ICU产ESBL肺炎克雷伯菌的随机扩增DNA多态性分型及药敏谱分析.pdf

文章编号: 1001 -764x(2005) 02 -0108-02 中图分类号: r44615 文献标识码: a# 实验研究 # icu产 esbl肺炎克雷伯菌的随机扩增 dna多态性分 型及药敏谱分析 毕俏杰(青岛市立医院东院区 icu, 青岛 266071) 摘要: 目的 对我院 i cu 产超广谱 b- 内酰胺酶 (esbl)的肺炎克雷伯菌进行监测。方法 从 i cu 病房患者的痰、 呼吸机管道 冷凝水、 听诊器及护理人员的手分离的 30株肺炎克雷伯菌, 用双纸片法鉴定。对确认试验阳性的 esbl 肺炎克雷伯菌进行随 机扩增 dna多态性 (rapd)分型, 并比较不同型别的耐药谱。结果 共检出 21株 esbl 阳性的肺炎克雷伯菌, rapd分型为 a、 b、 c、 d、 e、 f 、 g、 h 8种型别, 其中 a 型为优势菌株, 占 3313% ( 7/21), 药敏结果显示 rapd谱型与药敏谱无明显相关性。结 论 esbl阳性的肺炎克雷伯菌可借护理人员的手、 呼吸机管道和听诊器进行传播。提高医护人员对 esbl 的认识, 遵循无菌 操作规程, 合理使用抗生素, 是防治 esbl产生菌播散的重要措施。 关键词: 肺炎克雷伯菌; 随机扩增 dna 多态性; 超广谱 b - 内酰胺酶 对我院 icu 分离的肺炎克雷伯菌进行超广谱 b- 内酰胺酶 ( esbl ) 监测, 随机扩增 dna 多态性 ( random a mplied polymorphic dna, rapd) 分型, 并 对其进行药敏谱分析, 结果如下。 1 材料与方法 111 菌株来源 我院 icu 2001 2002年从患者痰 液、 呼吸机管道冷凝水、 水池积水、 听诊器胸件及医 护人员手上分离的肺炎克雷伯菌 30株, 其中, 痰液 来源 24株, 其他来源 6株。 112 纸片及试剂 e test试条, ab biodisk公司产 品; 蛋白酶 k, merck 公司产品; pcr marker , 美国 promega 公 司 产 品;pcr 反 应 体 系: 引 物5c - gtctgcctga-3c 、 dntp、 mgcl2、 10 buffer 、 taqdna 聚合酶, 由上海 sangon公司提供。 113 菌株的分离鉴定 常规分离临床标本, 用 m icroscanw /a-40系统进行鉴定, 菌种以半固体法 保存。质控菌株为肺炎克雷伯菌 atcc 700603 。 114 esbl的检测 按照 1999年版美国实验室标 准化委员会 nccls推荐的标准纸片扩散法测定。 115 药敏试验 采用 kirby-bauer纸片扩散法, 药 敏结果按 1999年版 nccls药敏标准判断。 116 细菌 dna的提取 将培养至饱和状态的细菌 离心收集菌体, 经裂解液裂解, 100 g /l sds破壁, 蛋 白酶 k消化, 再用饱和酚、 酚 /氯仿 ( 25b24), 氯仿 / 异戊醇 ( 24b1)抽提, 最后用无水乙醇将 dna沉淀, 70%乙醇洗涤后干燥至半透明状态, 纯水溶解, 4e 保存备用。 117 pcr扩增 rapd反应体系体积 25 l,l 其中 10 buffer 2 . 5 l; l mgcl2终浓度 4mmol/l; taqdna 聚合酶 1 u; dntp终浓度为 0 . 2 mmol/l; 引物终浓 度为 0. 3 lmol/l; 模板浓度为 0 . 1 lg。将反应混合 物瞬时离心, 加无菌石蜡油覆盖液面, 再次瞬时离心 后放入 pcr扩增仪, pcr反应条件为 95 e 预变性 3 m in , 然后 95 e1m in , 37 e1m in , 72 e1m in进行 40个循环扩增, 最后 72 e 延伸 8 m in。取扩增产物 10 l, l 于 15 g/l琼脂糖凝胶 (含 0 . 5 lg /m letbr)中 电泳。恒压 80 v, 1 h ; 采用 generuler 100 bp dna 梯度的 dna参照标准作为 bp长度标志。紫外透射 仪下分析结果并照相。 2 结果 211 esbl检测的阳性率 m icroscanw /a-40系统 鉴定的 30株肺炎克雷伯菌中 21株 esbl阳性, 阳 性率为 70 % 。 212 rapd谱型 21株 esbl 阳性的肺炎克雷伯 菌可分为 8型, a型 (共 9条带 ) 7株 (见图 1a); b型 ( 4条带 ) 5株 (见图 1b , 1c); c型 ( 5条带 ) 2株 (图 1c); d型 ( 6条带 ) 2株 (图 1b); e、 f、 g、 h 各 1株 (见图 1b , 1c)。 1a. 由左至右依次为 m arker , 孔 1 7; 孔 1 7分别对应菌株 1 、 2、 4、 5 、 6 、 7 、10(见表 1)。 108 临床检验杂志 2005年第 23卷第 2期 chinese journal ofclinicallaboratory science , 2005 , vol 123 , no 12 1b. 由右至左依次为 m arker , 孔 1 7; 孔 1 、 2 、 3分别对应菌株 3、 8 、 9(见表 1); 孔 4 , 5分别对应菌株 15 、 16(见表 1); 孔 6 , 7对应菌株 18 , 20。 1c. 由左至右依次为m arker , 孔 1 7; 孔 1 , 2对应菌株 21 , 19; 孔 3 、 4 、 5对应菌株 11, 12 , 17(见表 1); 孔 6 , 7对应菌株 13 , 14(见表 1)。 图 1 esbl阳性的肺炎克雷伯菌随机引物扩增 dna 多 态性 213 药敏结果 见表 1 。结果显示药敏谱相同的 菌株, 可以具有不同的 rapd谱型, rapd谱型相 同, 药敏谱可以不同。 3 讨论 311 结果显示我院 icu 分离的肺炎克雷伯菌产 esbl的阳性率达 70 %, 高于文献报道 1。高检出 率与 ( 1) icu病人的特点有关: 病情重, 免疫力低下, 接受各种侵袭性操作如气管插管、 胃肠减压、 保留导 尿、 深静脉置管等, 导致自身防御机制进一步减退, 易为条件致病菌感染; 多数医生经验性使用三代头 孢菌素及其他广谱高效抗生素, 更易引起产 esbl 肺炎克雷伯菌感染。 ( 2) esbl 基因可因耐药质粒 的自主复制、 接合转移特性及 tn转座插入染色体及 质粒, 在同种或不同种属革兰阴性菌中传播 2-3。 312 rapd谱型结果显示, 同一种耐药表型有几种 不同的 rapd谱型, 提示 rapd有较高的分型率; 同 一 rapd谱型有不同的耐药表型, 提示可能由于抗 生素的选择性压力而使之发生变化, 但分子水平可 揭示它们源于同一菌株。本文 21株产 esbl肺炎 克雷伯菌的 rapd谱型有 8种, 其中 a型占 7株, 为 优势菌株, 这些菌株除源于病人的痰液外, 还源于呼 吸机管道冷凝水, 护工手及听诊器, 控制暴发流行, 应从切断这些传播途径入手。 313 从表 1可以看出 4 、 5、 11 、 13 、14株对哌拉西 林 /他唑巴坦耐药, 提示这些菌株可能是高产 shv-5 或同时高产 s hv-1或 tem-1的菌株 4。碳青霉烯 类抗生素被认为是治疗 b- 内酰胺酶产生菌感染的 最后一道防线, 本研究中有 2株 ( 15, 16)对其耐药, 该 2株菌均来源于多次使用亚胺培南的病人, 其耐 药机制有待于进一步探讨。 表 1 esbl阳性肺炎克雷伯菌的耐药性及 rapd分型 序 号 标本 来源 耐药 谱型 药敏试验 akngencazazntzpi mp apd 分型 1痰液rrrrssa 2痰液rrrrssa 3痰液rrrrssb 4痰液rrrrrsa 5冷凝水rrrrrsa 6听诊器rrrrssa 7护工手rrrrssa 8痰液rrrrssb 9痰液rrrrssb 10痰液rrrrssa 11痰液rrrrisc 12 听诊器rrrrssc 13 听诊器rrrrrsb 14痰液rrrrisb 15痰液rrrrrrd 16痰液rrrrrrd 17 冷凝水rrrrssc 18痰液rrrrsse 19痰液rrrrssf 20痰液rrrrssg 21痰液rrrrssh 注: akn=丁胺卡那, gen=庆大霉素, caz=头孢他啶, azn= 氨曲南, tzp=哌拉西林 /他唑巴坦, i mp=亚安培南, r=耐药, i=中介, s=敏感。 参考文献: 1赵旺胜. 南京地区产超广谱 b- 内酰胺酶菌株的调查及药敏分析 j. 临床检验杂志, 2000 , 18( 4): 233-2341 2 revathi g, shannon k p. an outbreakof extended spectrum b- lactamase -producing salmonella in a burns ward j. jhosp infect , 1998, 40( 4): 2951 3 shannon k, stapleton p, x iang x, et al. extended spectrum b-lactamase-producingk lebsiellapneumoniaestrainscausing nosocom ial outbreaks of infection in the united k indom j. j c lin m icrobio,l 1998, 36( 10): 31051 4 french g l, shannon k p, si mmonsn. hospitaloutbreak ofk lebsiella pneumoniae resistant to broad -spectrumcephalosporins and beta- lactamase inhibitor combinations by hyperpr