藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定.doc

DOC格式论文，方便您的复制修改删减藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定（作者:_单位: _邮编: _） 作者：樊爱琳，师长宏，苏明权，薛莹，柏银兰，马静，刘家云，张建芳，程晓东，郝晓柯 【摘要】 目的： 克隆藤黄微球菌Rpf基因,序列测定正确后进行融合表达纯化. 方法： 采用聚合酶链反应(PCR)方法，从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC19克隆载体中,测序正确后再亚克隆到融合表达载体pProEXHT中,转化大肠杆菌DH5,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化. 结果： 获得藤黄微球菌Rpf基因,得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋白,可溶性分析发现融合蛋白主要在包涵体中存在，最后在变性条件下，用Ni2+NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白，纯化获得的融合蛋白纯度大于90%，WesternBlot证实获得的蛋白为所需要的目的蛋白. 结论： 构建了藤黄微球菌Rpf基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础. 【关键词】 微球菌，藤黄；分枝杆菌，结核；克隆，分子；基因表达；纯化 0引言 结核病（TB）是现今全世界范围内最重要的致病和致死因素之一. 结核分枝杆菌的休眠状态和生长缓慢是研究结核病的主要障碍. Mukamolova等1发现在Micrococcus Luteus（藤黄色微球菌）中发现了一种能促进细菌复苏生长的因子并命名为复活促进因子（Resuscitationpromoting factor, Rpf ）. Biketov等2发现Rpf可促进巨噬细胞内受损的休眠期的结核杆菌进入活化增殖状态,且还是宿主免疫系统识别的靶抗原. 通过同源性分析发现结核分枝杆菌基因组可编码5 种Rpf样蛋白3. 我们拟克隆表达藤黄微球菌Rpf蛋白，进一步研究其生物学和免疫学特性，以建立临床结核分枝杆菌的快速分离培养方法，并评价其是否可作为候选结核亚单位疫苗的组分. 1材料和方法 1.1材料藤黄微球菌标准株为西京医院检验科细菌室保存；Taq DNA聚合酶、dNTPs，T4连接酶、Hind，BamH及DNA电泳胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒（Promega公司）；E.coli DH5为本室保存，pProEXHT质粒为第四军医大学动物实验中心师长宏博士馈赠；金属鳌合亲和层析介质（NiNTA）（Qiagen公司）. 12方法 1.2.1引物设计登陆GenBank，根据藤黄微球菌Rpf基因序列(AC: Z96935)设计引物. P1：5CGA GGA TCC ACC ATG GAC ACC ATG ACT CTC TTC AC3含BamH酶切位点p2：5TCA AAGCTT TCA GGC CTG CGG CAG GAC GAG CTC CT3含Hind酶切位点和终止码. 扩增片段为697 bp，由TaKaRa公司合成. 1.2.2藤黄微球菌基因组DNA提取刮取适量藤黄微球菌落，TE(pH 8.0)洗涤后重悬，加SDS至终浓度为10 g/L，蛋白酶K至终浓度0.1 g/L，5560水浴过夜，分别用等体积酚氯仿异戊醇(25241)、氯仿异戊醇(241)各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇，1/10体积的3 mol/L乙酸钠后置-20冰浴1 h沉淀DNA，用无水乙醇、700 mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次，抽干后溶于适量无菌水中. 1.2.3藤黄微球菌Rpf基因的扩增、克隆及测序以藤黄微球菌基因组为模板，以P1和P2为引物，扩增目的基因. PCR反应条件：94 60 s， 52 60 s， 72 90 s， 共30个循环，再于72延伸7 min. 回收PCR产物，经BamH和Hind消化后，然后用T4连接酶连接入经同样酶消化的pUC19中，转化E.coli DH5感受态细胞. 然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100 mg/L），随机筛选4个菌落，分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37振荡培养过夜，提取质粒DNA，用Hind和BamH双酶切，37 过夜，进行10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为分子质量参照，观察有无约697 bp大小的片段，将阳性克隆命名为pUC19Rpf,然后随机挑取3个克隆进行测序. 1.2.4重组质粒表达提取测序正确的重组克隆质粒，经Hind和BamH双酶切后，回收目的基因条带，溶于50 L双蒸水中. 取目的片段和同样用Hind和BamH双酶切的pProEXHT质粒以 31的比例混合，用T4连接酶连接，转化E.coli DH5感受态细胞. 然后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100 mg/L），37培养过夜. 随机挑取2个菌落，分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37振荡培养过夜. 各取1.5 mL提取质粒DNA，再以Hind和BamH双酶切鉴定，挑选阳性克隆. 挑取1个阳性克隆接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37振荡培养18 h，取100 L加到10 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37振荡培养23 h，以终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG诱导4 h，取1 mL诱导表达菌液以及未诱导的菌液离心，回收菌体沉淀. 将诱导前后的样本重悬到去离子水中，加入2样品缓冲液，100沸水浴5 min，12 000 g离心10 min，取10 L 上清进行100 g/L SDSPAGE，电泳条件为200 V恒压. 凝胶用考马斯亮蓝染色液染色5 h，脱色液脱色13 h，观察目的蛋白表达条带. 并通过凝胶薄层扫描测定其表达量. 125表达产物鉴定将上述表达产物进行SDSPAGE后转移至硝酸纤维素膜上，用10 g/L BSA封闭过夜，加6His mAb作用1 h，以10 mmol/L PBS（pH 7.2）洗涤后，加HRP羊抗鼠IgG作用1 h，以DAB显色观察结果. 1.2.6纯化样品制备将平衡胍裂解液温至37（pH 7.8），收集250 mL诱导表达细菌，5000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀重悬于10 mL胍裂解液中，室温缓慢摇动510 min，至细胞完全裂解，冰浴条件下超声5次，每次10 s，10 000 g离心10 min，上清移至干净离心管，-20保存备用. 1.2.7融合藤黄微球菌Rpf蛋白在变性条件下纯化4采用Invitrogen的Ni2+NTA纯化试剂盒纯化目的蛋白. 将250 mL的诱导菌液离心，制备上柱样品，按照变性条件进行亲和色谱纯化，收集洗脱液进行100 g/L SDSPAGE 分析. 1.2.8表达蛋白的复性采取逐步降低尿素浓度的方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，先用含6 mol/L尿素的缓冲液4透析过夜，然后分别用4， 3， 2， 1， 0.5 mol/L尿素的梯度透析各4 h以上，最后用PBS缓冲液再透析4 h以上. 透析结束后将蛋白溶液在4，12 000 g离心10 min，上清即为可溶的复性蛋白，将其分装后冻干备用. 2结果 2.1藤黄微球菌Rpf基因的扩增、克隆及序列分析应用上述合成的两种引物，以藤黄微球菌基因组为模板，扩增藤黄微球菌Rpf基因序列，10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示见图1，PCR扩增产物约为697 bp的片段. 将PCR扩增产物克隆于PUC19中，挑选经酶切鉴定正确的克隆见图2，送上海联合基因公司测序，所得序列结果与GenBank报道的完全一致. 2.2藤黄微球菌Rpf基因表达载体的鉴定将纯化的重组质粒PUC19Rpf双酶切后回收，与用相同酶切的pProEXHT质粒连接、转化，随机挑选2个克隆，提取质粒酶切鉴定，2个克隆均切出697 bp的片段，将1号阳性克隆命名为pProEXHTRpf(图3). 2.3重组质粒的表达及其产物的鉴定将重组质粒pProEXHTRpf接种于LB培养液中，经 IPTG诱导，SDSPAGE分析，发现约在Mr 30 000处有1条蛋白带，同预计的大小相吻合(图4). 经凝胶薄层扫描，测得重组菌表达带的蛋白量约占菌体总蛋白量的23.5%. 对表达蛋白的可溶性分析证明，融合表达产物主要以不可溶的包涵体形式存在. 将表达蛋白与抗组氨酸的特异性mAb做免疫印迹，发现在Mr约为30 000处有一条带，表明此表达产物含有能与抗组氨酸的特异性mAb相结合的表位(图5). 2.4表达蛋白的亲和层析纯化Ni2+NTA 亲和色谱柱纯化蛋白后100 g/L的SDSPAGE证明了这种方法的有效性，经薄层扫描分析融合蛋白纯度可达90%以上(图6). 3讨论 Rpf蛋白是一种原核生长因子，它在细胞外以110-12 g水平通过自分泌和旁分泌形式发挥促进休眠期细菌复活的作用,它可以促进休眠期结核分枝杆菌的生长5. 由于Rpf的功能类似于真核生物的生长因子，因此被称为细菌的细胞因子. Vladimir等6的实验证明藤黄微球菌中的Rpf 蛋白有很强的免疫原性，在免疫C57BL/6小鼠之后，可以诱发IgG1与IgG2a反应，T细胞增殖，干扰素, IL10, IL12 升高而IL4, IL5不变，而且免疫血清可以抑制结核分枝杆菌 H37Rv毒株的生长与增殖. Cole等7认为MTB中也存在着Rpf样基因，可以编码几种膜结合或分泌的Rpf样蛋白. Mukamolova等8对MTB全基因序列分析表明，其中Rv0867c（RpfA）, Rv1009（RpfB）, Rv1884c（RpfC）, Rv2389c（RpfD）和Rv2450c（RpfE）五个基因与藤黄微球菌Rpf基因同源. 我们以藤黄微球菌基因组为模板,克隆了藤黄微球菌Rpf基因,构建了融合表达载体pProEXHTRpf,并融合表达了氨基端带有6个组氨酸残基的Rpf蛋白，该蛋白以包涵体的形式存在，在变性条件下利用金属鳌合亲和层析对目的蛋白进行了纯化，并利用缓慢透析的方法使大部分目的蛋白得到了复性，得到了纯度在90以上的目的蛋白，将表达的蛋白与抗组氨酸的特异性mAb做Western Blot，发现在Mr约为30 000处表达有一条带，表明此表达产物含有能与抗组氨酸的特异性mAb相结合的表位，也间接证实了表达的蛋白为需要的目的蛋白. 利用得到的目的蛋白，研究其生物学特性，进一步探究包括结核分枝杆菌在内的富含GC的革兰阳性菌所表达的Rpf家族蛋白的功能，以便建立结核分枝杆菌快速、敏感的分离培养方法. 同时将深入探讨Rpf蛋白的免疫学特性,探究其是否可以做为预防和治疗结核分枝杆菌感染的疫苗组分.【参考文献】 1 Mukamolova GV, Obolbek AT, Konstantir K, et al. The rpf gene of micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factorJ. Molecular Microbiology, 2002,46(3):611-621. 2 Biketov S, Mukamolova GV, Potapov V, et al. Culturability of Mycobacterium tuberculosis cells isolated from murine macrophages: A bacterial growth factor promotes recoveryJ. FEMS Immunol Med Microbiol, 2000,29(4):233-240. 3 Mukamolova GV,Murzin AG, Salina EG, et al. Muralytic activity of micococcus luteus Rpf and relationship to physiological activity in promoting bacterial growth and resuscitationJ. MolMicrobiol, 2006,59(1):84-89. 4 薛莹，姜泓，高雪，等. 结核分枝杆菌Rv2450基因的克隆、表达及纯化J. 第四军医大学学报，2004,25(19):1778-1781. 5 Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Young DI, et al. A bacterial cytokine J. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(15):8916-8921. 6 Yeremeev VV, Kondratieva TK, Rubakova EI, et al. Proteins of the Rpf Family: Immune Cell Reactivity and Vaccination Efficacy against Tuberculosis in Mice J. Infect Immun, 2003,71(8):4789-4794. 7 Cole ST, Brosch