《凝胶过滤色谱填料》PPT课件.ppt

凝胶过滤色谱填料 第三组 概 述 凝 胶 过 滤 色 谱 分 离 原 理 凝 胶 过 滤 色 谱 填 料 的 种 类 和 性 能 凝 胶 色 谱 填 料 的 制 备 常 见 凝 胶 过 滤 色 谱 填 料 目录 凝 胶 过 滤 色 谱 的 应 用 概述 凝胶过滤色谱是体积排除色谱（SEC）的一种。 溶质只依据其分子体积（流体力学体积） 的大小而分离。 体积排除色谱（SEC） 与其他色谱相比较的优点： 出峰迅速，任何组分的保留体积均在Vi 和V0之间，且不需要梯度淋洗。 溶质与固定相（填料）和流动相之间没 有相互作用。 分离时不会滞留杂质或残留物在柱上， 故柱寿命长。 与其他色谱相比较的优点： 可用于测定生物大分子的分子量 生物相容性好，有很高的活性回收 率 负载量较大，利于制备分离。 主要缺点 ： 分辨率及峰 容量均相对 较低。 凝胶过滤色谱的分离原理 凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料的色谱柱 中进。 当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后 。 因浓度差而可能渗入或扩散进入填料的孔中 ，即溶质在两相中的运动是由浓度梯度推动的 。 分子体积的大小，造成了在孔中扩散途径的 差异，溶质分子只能进入尺寸比它大的孔； 如果溶质分子的尺寸大于孔径，则只能从孔旁 流过。这意味着体积较小的分子能占有更多的 孔体积。这样，分子体积不同的混合物一起进 入柱端时，经过淋洗、扩散，总是体积大的分 子先流出柱子，小分子量即体积小的分子印刻 进入凝胶的孔中，使其行程延长而滞后流出， 从而使分子体积不同的分子得以分离。 凝胶过滤色谱填料的种类和性能 用于凝胶色谱的填料主要是 用天然的多糖类原料制成的 ，它们的机械强度低，粒径 较大而不均匀，很难在高流 速下流动，费时、费力且分 辨率也很低。 早期 理想的高效凝胶色谱填料应具备以下性能： 1.机械强度高，能耐受 几兆帕的操作压力。 2.球形颗粒，粒子直径 控制在310um，且粒 径分布窄，达到高柱效。 3.具有亲水性表面，以 利降低疏水性效应。 4.非离子性，表面没有 离子交换基团。 5.孔径约为5100nm之 间，以适应不同分子量 范围物质的分离只需。 6.具有较高的孔径， 以利于得到高分容量。 7.较高的化学稳定性， 有较宽的适用PH值 范围. 8.有较好的生物相容 性，不会引起生物活 性物质的失活和降解。 9.容易处理和充填。 10.价格合理。 以可控孔径玻璃（CPG）、 硅胶为基质的无机基质高效 凝胶色谱填料和以合成高分 子或高交联天然高分子为基 质的有机高效凝胶色谱填料 相继问世，他们均基本上可 以满足上述要求。 20世纪70年代中期 ！ ！ ！ 孔径或孔径分布 粒度及粒度分布 孔容 粒径及粒径分影响 其柱效 例如，通常所使用 的直径5um的软 胶，能达到理论塔 板数1500/m左右 的柱效 关系到凝胶色谱柱 的分离容量。根据 凝胶色谱柱的一般 理论，孔容愈大， 所填装的柱子的分 辨率和柱子的容量 就愈高。因此，用 作凝胶分离介质的 硅胶，必须具有较 高的孔容。 因此，用作凝胶 分离介质的硅胶， 必须具有较高的 孔度。对于多空 硅胶而言，一 般在0.60.7， 故Vi/V 0值应在 1.051.23之间 指的是可用于分离的样品的最大分子量。 一般以具有不同分子量的葡聚糖，聚乙二 醇为样品绘制工作曲线后确定。需要注意 的一点是，因为在溶液中蛋白质常呈球形 ，而PEG和葡聚糖则是线性分子，依据此 工作曲线会带来很大的误差。故最好以蛋 白质标准样品来标定凝胶过滤色谱的工作 曲线。 凝胶过滤色谱的渗透极限： 由工作曲线可确定该凝胶过滤色 谱柱的分离范围，指的是工作曲 线线性部分所对应的分子量区间 。 ！因此： ！ 凝胶色谱填料的制备 未经化学键合或改性的多空硅胶或可控孔径玻璃，可以直 接用于中性糖的寡聚物和聚合物的分离，近年来，经葡聚 糖键合至硅胶上或包敷在硅胶上制成的填料亦有报道和销 售。但用于生物高分子，如蛋白质、核酸等分离时，还是 以进行表面亲和处理为宜。即将其表面加以修饰，令其带 上亲水性基团。 制备方法如下：见书246 即以环氧丙基三甲氧基硅烷为硅烷化试剂，以高孔隙度硅 胶为基质，键合反应后，再令其环氧基开环，生成二醇型 化学键合硅胶。 常见凝胶过滤色谱填料 表11-8列出了常见的无机型亲水凝 胶，尽管牌号各异，但其化学本质 几乎均是二醇型化学键合硅胶。 ！见书本247页 凝胶过滤色谱的应用 例1.凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性 利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解 液，水解液经Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分子量 分级，根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。 在最佳条件下绘制标准曲线，并根据标准曲线判断分离 组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定 法（FRAP）、二苯基苦基苯肼法（DPPH）以及金属 铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化 能力，并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC 分离和氨基酸组成分析 凝胶过滤色谱的应用 例2.蛇毒纤溶酶Fibrolase 的凝胶过 滤色谱复性 方法: 使用透析和凝胶色谱对Fibrolase 复性进行 研究, 比较2 种复性方法的相对复性率及蛋白质 回收率。结果: 2 种复性方法的复性率分别为 20%、25%, 蛋白质回收率分别为16%、5%。 结论:凝胶过滤色谱复性优于透析法复性, 凝胶过 滤色谱复性使蛋白质的复性与纯化同步进行, 简 化了操作程序, 提高了产品回收率。 凝胶过滤色谱的应用 例3.葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定两种氨基 酸锌螯合物螯合率的差异性 采用葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定蛋氨酸锌、苏氨酸锌两 种氨基酸锌