《多酚氧化酶》PPT课件.ppt

第10章 多酚氧化酶 一、多酚氧化酶的 名称和自然界的分布 n多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧 氧化还原酶,EC 1.10.3.1) 一类含铜的氧化还原酶，催化邻-苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能 作用于单酚单加氧酶的底物。 n多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多 酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大 类：单酚氧化酶(酪氨酸酶 tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧 化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(对苯二 酚氧化酶 laccase,EC.1.10.3.1)。 n在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物 中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶 。 1、多酚氧化酶的名称 2、植物中多酚氧化酶分布 n多酚氧化酶是植物中最受注意的一种酶,在葡 萄,洋李,无花果,枣,茶叶和咖啡豆中含量很高 ,它在这些果实中起着人们期望的作用. n多酚氧化酶在桃,苹果,香蕉,荔枝,马铃薯,莲 藕和莴苣中的含量也是相当高,然而它对这些 果实起着不需宜的作用,易引起褐变,造成变质 和腐烂,对于新鲜果实的保藏带来极大困难 n胡椒中不存在多酚氧化酶. n存在: 植物、果蔬的叶绿体、线粒体, 马铃 薯块茎 分布广泛 n多酚氧化酶在植物中的含量随品种不同而有很 大变化，在众多的水果和蔬菜中，橄榄中的多 酚氧化酶活力最高。 n多酚氧化酶的活力分布还取决于果蔬的成熟度 。在绿叶中，很大一部分酶活力集中在叶绿体 中，在马铃薯块茎中，几乎集中在亚细胞中； 在新采收的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在 于叶绿体和线粒体中。 n果蔬中不同的部位的多酚氧化酶含量差别很大 ，例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。 二、多酚氧化酶催化反应 及其作用底物 n1.催化反应 n多酚氧化酶是一种加氧酶，它催化酚的选择性羟 基化，羟基化产物继续氧化生成邻-苯醌。 n多酚氧化酶的作用下氧化形成不稳定的邻-苯醌 类化合物,然后再进一步通过非酶氧化反应,聚合 成黑色素(melanin)。 羟基化 氧化反应 n多酚氧化酶的作用导致香蕉,苹果,桃,马铃薯,蘑 菇,虾发生非需宜的褐变和人的黑斑形成 n然而对茶叶,咖啡,葡萄干和梅干,以及人的皮肤 色素形成产生需宜的褐变 n当邻苯醌与蛋白质中赖氨酸残基的-氨基反应, 可引起蛋白质的营养价值营养价值和溶解度溶解度下降,同样由 于褐变反应也将会造成食品的质地质地和风味风味的变化 。 n热带水果50%以上的损失都是由于酶促褐变引起 的.同时酶促褐变也是造成新鲜蔬菜例如莴苣和 果汁的颜色变化,营养和口感变劣的主要原因 n控制果蔬加工和贮藏过程中酶促褐变, n例如驱除O2和底物酚类化合物以防止褐变,或者添加 抗坏血酸,亚硫酸氢钠和硫醇类化合物等,将初始产物, 邻苯醌还原为原来的底物,从而阻止黑色素的生成. n还原剂都能直接引起酶失活,从而抑制酶促褐变.这是 因为抗坏血酸能够破坏酶活性位点上的组氨酸残基, 而亚硫酸氢钠和硫醇可以除去酶活性位点中的Cu2+ n4-己基间苯二酚,苯甲酸和其他一些非底物酚类化合 物,也可作为多酚氧化酶的有效竞争性抑制剂 2.作用底物 n水果、蔬菜中底物为： n一元酚类 n邻二酚类（对位二酚也可） （间位二酚不作底物） 如： 水果中的儿茶酚 OH OH 土豆中的酪氨酸 HO CH2CHCOOH NH2 n重要的天然底物 三、pH和温度对多酚 氧化酶活力影响 1.pH对酶活力的影响 (1)适宜pH：47 (2)不同种类，甚至同一种果蔬中的不同品种得到的 多酚氧化酶，也有不同的最适pH (3)果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶,最适pH也有差 异 (4)酶的提取或分离的方法对它的最适pH也有影响 (5)测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最适 pH也有影响 (6)大多数多酚氧化酶只有一个最适pH,在一些情况下 , 有第二个最适pH 2.温度对多酚氧化酶活力影响 n不同种类、品种、部位的多酚氧化酶 有不同的热稳定性，通常最适温度在常温 n加热易使酶失活 n同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具 有不同的热稳定性 n低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降 ，但活性下降比较缓慢 四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂 和果蔬酶促褐变的防止 n1.激活剂 n多酚氧化酶的活性形式是含铜的酶单体 的寡聚体，激活剂的作用是使酶蛋白以 一定的聚合度存在，才有生物活性。 nSDS、 Cu2+ 、酸、尿素等 2.抑制剂和果蔬酶促褐变的防止 n酶促褐变:较浅色的水果、蔬菜在受到 机械性损伤（削皮、切片、压伤、虫咬 、磨浆、捣碎）及处于异常环境变化（ 受冻、受热等），在酶促（催化）下氧 化而呈褐色，称为酶促褐变 n n 西瓜、香瓜、桔子、柠檬西瓜、香瓜、桔子、柠檬 无酚酶，不褐变。无酚酶，不褐变。 n亚硫酸类是酚酶抑制剂。 实例1：土豆的褐变 实例2：含有儿茶酚水果的褐变 褐变防止方法 酶促褐变的三个条件，缺一不可。 即：多酚类物质、酚酶、氧气 除去多酚类物质困难，不现实。 一般为 降低酚酶活性、驱氧 (1)加热钝化酶活性 n7595、57S的加热处理，可使大部分 酶活性丧失。 常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌 加工中，必须严格控制时间和温度。 加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐 变，但会影响食品品质；加热不足，不能抑 制酶褐变。 微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响 风味。 (2)螯合酶促作用的金属离子 n金属（铁、铜、锡、铝等）离子是多酚氧化 酶的激活剂。Fe3+、Fe2+、Cu2+能促进褐变 主要是因为铁和铜不仅能和酚类化合物反应 形成褐色物质，而且能催化还原酮类的氧化 。 n柠檬酸对Cu2+有螯合作用。 nEDTA是一种金属离子螯合剂，可阻止金属 离子对褐变反应的促进作用，但其与作用对 象有关，有的效果则不明显。 (3)酸处理法 n多数酚酶最适pH67，pH 3失活(高酸性环境 会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致PPO逐渐失 活，酶活性趋于最低。) n常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、 混合酸。 n柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基Cu2+，但单独 用效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。 n实践证明：0.5%柠檬酸 + 0.3%抗坏血酸效果好。 n抗坏血酸不但能降低体系pH，而且具有还原剂的作 用，可将体系中的醌类及其衍生物还原成酚，并通 过自身氧化来减少体系的含氧量。 抗坏血酸抑制酶褐变的机理（图） （4）酶活抑制剂 亚硫酸类是酚酶抑制剂。 常用的有： 二氧化硫、亚硫酸钠、 亚硫酸氢 钠、 焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠(Na2 S 2 O 4 ) 如：在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中， 常用二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。 实验表明：10ppm可抑制酚酶活性，但有挥发 损失，还与醛类加成等。实际应用300ppm， 残留 20 ppm。 在微酸性（pH6）时，抑制酚酶的效果最好 。 防止原因有三： a.抑制酶活性 b.将醌还原为酚 c.与醌加成，防止聚 合 (5)驱氧 n通过沸水烫漂、抽真空（93kPa，5 15min）、高浓度抗坏血酸溶液浸泡、气调 包装设计等均可达到驱除食品内氧气的目的 ，从而抑制酶褐变的发生。 n控制氧气含量用抽空处理技术或添加去氧剂 等方法：用2%食盐+0.2%柠檬酸 +0.06%偏重亚硫酸钠溶液作抽空液，在 500mmHg的真空度抽空510min,可取得 良好的护色效果。 褐变的利用 期望的褐变 苹果酒、红茶发酵（生成茶红素）、可可 粉、葡萄干、梅干、椰枣、无花果。 红茶是全发酵茶，茶中的多酚物质主要是 儿茶素经多酚氧化酶与过氧化物酶的作用 ，氧化并聚合生成茶色素。 红茶中含有三种酚性色素茶红素、茶 黄素和黄酮醇甙。 五、多酚氧化酶的分子形式 n多酚氧化酶有多种分子形式 n原因：类似的亚基不同程度的聚合 ；不同亚基不同方式的结合;酶蛋 白质构象的改变;前三种情况的结合 。 n多酚氧化酶多种分子形式之间的差别 表现在底物特异性、最适pH、温度稳 定性、对抑制剂敏感性、氧化和羟基 化活力的差别。 六、多酚氧化酶活力测定 n多酚氧化酶活力的测定方法可以分为两 类 n测定底物消失的速度 n测定产物生成的速度 限于测定反应的初速度 。 PPO活性测定 n终点法 n多酚氧化酶催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌 类反应，以儿茶酚为多酚氧化酶的底物，其氧化 产物在416nm处有最大光吸收。 n测定系统：1.5ml 20mmol/L邻苯二酚（溶于 0.05mol/L,pH6.8KH2PO4-NaOH缓冲液中，然后再 加入0.1ml酶提取液，保温37C，三氯乙酸终止 反应，并4000r/min离心5min，取上清液，适当 稀释。 以空白为对照，用分光光度计测定其在 416nm波长下的O.D值。 n酶活性单位为在测定条件下，每分钟引起吸光度 改变0.01所需的酶量 动态法 PPO活性的测定 n取0.05mol/L,pH6.8KH2PO4-NaOH缓冲液 1.5ml于1cm比色皿中，加入1ml 20mmol/L邻苯二酚溶液，PPO酶液0.5ml ，混匀后在416nm处比色，酶液加入后开 始记时，每30s记录一次OD 随时间的变 化值，以最初直线段的斜率(OD/t)计 算酶活力。 n一个酶活力单位定义为：在测定条件下 ，每分钟引起吸光度改变0.01所需的酶 量。 七、水果和蔬菜中的 多酚氧化酶及其底物 n正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与 PPO酶存在于不同部位。这种分布是通过一系 列膜系统实现的，受膜屏障的作用，这种区域 性的分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正 常组织是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使 物质的区域化分布破坏，PPO与酚类物质接近 并与其发生化学作用，这将导致褐变。 n水果有更大的有着较弱薄片成分的细胞，冷藏 时易发生细胞壁破裂，使PPO与酚类物质接触 ，产生褐变。 1.苹果中多酚氧化酶 n引起苹果褐变的重要原因之一 n未成熟的苹果比成熟的更易褐变 n在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期 间是增加的 2.梨中的多酚氧化酶 n梨多酚氧化酶仅作用于邻苯酚,与对苯 酚、间苯酚和一元酚无作用 n以儿茶酚为底物,该酶的最适pH为6.5, 在30活性最强. n亚硫酸氢钠、维生素C、柠檬酸对梨中 多酚氧化酶的抑制作用依次减弱,硫酸 钠几乎无抑制作用 n不同底物和同底物不同浓度影响多酚氧 化酶特性. 3.桃 n促使衰老的因素，可促进褐变，抑制衰 老的因素可抑制桃果实的褐变 n桃低温下的褐变与逆境条件下不正常衰 老有关 n酚类物质含量和PPO活性在果实近成熟时 下降，所以适当延迟采收期可显著减少 桃组织褐变的发生 4.马铃薯 n马铃薯匍匐茎、块茎、花及根中的PPO活性明显 强于叶和茎，而块茎外皮和花中子房及花药PPO 活性也高于同器官的其他部位 n马铃薯中PPO的最适温度为30,在80处理 5min