单增李斯特氏菌检测详解.ppt

进出口食品中单核细胞增生 李斯特氏菌检测方法 SN/T 0184.1-2005 李斯特氏菌 特征格氏李斯 特氏菌 英诺克李斯 特氏菌 绵羊李斯特 氏菌 单核细胞增 生李斯特氏 菌 默氏李斯特 氏菌 西尔李斯特 氏菌 威尔斯李斯 特氏菌 -溶血 CAMP (Staphylococc us aureus) CAMP (Rhodococcu s equi) 甘露醇 甲基-D甘 露糖苷 NDND L-鼠李糖 d d d 可溶性淀粉NDND D-木糖 马尿酸盐水解NDND 硝酸盐还 原NDND 小鼠致病力 样品的存放与制备 n冷冻样品：应于25解冻，且不超过18小 时；若不能及时检验，应置于15保存。 n非冷冻的易腐样品：尽可能及时检验，若不能 及时检验，应置于4冰箱保存，在24h之内检 验。 n无菌取样品25g(mL)放入灭菌均质杯或均质袋 中加225mL FB1增菌液中，充分均质。 增菌培养 225mL FB1 301培养25h1h，吸取 1mL，加入10mL FB2增菌液中301二次 增菌25h1h。 VIDAS快速筛选（可选） FB2增菌液进行VIDAS快速筛选。 n筛选为阴性的结果可直接报告未检出。 n筛选为阳性的结果继续分离培养和鉴定。 分离培养 n取增菌液一环，划线分离于选择性培养基 OXA、PALCAM上，351培养24h48h 。 n菌落形态：24h后菌落呈现黑色，直径为1mm ，在其周围形成一个黑色环。培养48h，菌落 仍成黑色，直径2mm3mm，除在菌落周围有 一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。 n挑取5个或更多的可疑菌落，接种于TSA-YE。 鉴定 n蓝色菌落检验 用45斜射光照射TSA-YE平板，菌落呈现蓝 灰色到蓝色。 （设标准菌株对照） 鉴定 n典型运动镜检 李斯特氏菌为短棒状 杆菌，可见轻微的旋 转翻滚。 （ 设标准菌株对照） 注：压片法或悬滴法 暗光 鉴定 n革兰氏染色 短杆状革兰氏阳性反应 注：陈旧培养物多转为阴性。 鉴定 n过氧化氢酶试验 挑取TSA-YE平板上的菌落于洁净载玻片 上，滴加1滴3的过氧化氢溶液，李斯特氏 菌呈过氧化氢酶阳性反应。 鉴定 n溶血试验 刺种7羊血琼脂平板，并刺种阳性对照菌（单核 细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性 对照菌（英诺克李斯特氏菌），30培养24h 48h。 单核细胞增生李斯特氏菌 窄小的溶血环 西尔李斯特氏菌 窄小的溶血环 绵羊李斯特氏菌 大的溶血环 其他 不溶血 鉴定 n动力试验 穿刺SIM半固体培养基，于室温（2025 ）培养48h。 李斯特氏菌有动力，呈典型的伞状生长。 鉴定 n硝酸盐还原试验 接种于硝酸盐肉汤，于35培养5d。 李斯特氏菌为阴性。 鉴定 nMRVP试验 接种于MRVP肉汤中，于35培养48h。 李斯特氏菌为阳性反应。 鉴定 n三糖铁试验 接种于TSI，35培养5d。 李斯特氏菌斜面和底层产酸，不产硫化氢。 鉴定 n尿素酶试验 穿刺尿素琼脂斜面，于35培养5d。 李斯特氏菌尿素酶试验阴性。 鉴定 n糖发酵试验 接种0.5%葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇 、鼠李糖、木糖发酵管内，35培养24h 48h，阴性继续培养到第5天。 李斯特氏菌菌种鉴别特征 中文菌名学名蓝 色 菌 落 典 型 运 动 过 氧 化 氢 酶 革 兰 氏 染 色 溶 血 试 验 动 力 试 验 尿 素 酶 试 验 硝 酸 盐 还 原 MR VP 试 验 三糖铁 试验 糖发酵利用 葡 萄 糖 麦 芽 糖 七 叶 苷 甘 露 醇 鼠 李 糖 木 糖 单核细胞增生 李斯特氏菌 L. monocytogen es / 产酸， 不产 H2S 绵羊李斯特氏菌L. ivanovii / 产酸， 不产 H2S 英诺克李斯特氏菌L. innocua / 产酸， 不产 H2S V 威尔斯李斯特氏菌L. welshimeri / 产酸， 不产 H2S V 西尔李斯特氏菌L. seeligeri / 产酸， 不产 H2S 格氏李斯特氏菌L. grayi / 产酸， 不产 H2S 鉴定 n协同溶血试验（ cAMP） 在羊血琼脂平板上各 划一直线，使两线平行， 在平行线上分别接种金黄 色葡萄球菌ATCC49444和 马红球菌ATCC6939，在两 线之间垂直接种，与两线 相近但不相交，于35培 养24h48h后，观察相交 处溶血情况。 L. monocytogenes L. innocua L. ivanovii 窄的窄的 溶血带溶血带 不溶血不溶血 宽的 溶血带 CAMP (Staphylococcus aureus) Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus Listeria monocytogenes 鉴定 nAPI鉴定试验 可代替硝酸盐还原、MR-VP、三糖铁、糖发 酵、尿素酶和CAMP等试验。 鉴定 n血清学检验 菌悬液于80水域中加热1h，离心弃上清， 剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清 学玻片凝集试验。 单核细胞增生李斯特氏菌：1/2A，1/2B， 1/2C，3A，3B，3C，4A，4AB，4B，4C， 4D，4E，7 质量控制 n每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株 进行质量控制。 样品制备的同时，在空白对照FB1增菌液中 加入新鲜配制的每毫升含有10个100个单 核细胞增生李斯特氏菌的稀释液1mL和阴性 培养物，按检验程序进行同步检验。 报告结果 n协同溶血试验、血清学试验可根据需要进 行，常规检验可不进行这些试验。 n报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特 氏菌。 n报告阴性结果：未检出单核细胞增生李斯 特氏菌。 新旧标准的主要不同 n