EGFR突变检测意义及方法学简介-26Aug.ppt

- 1 - EGFR突变检测意义及方法学简介 鹿亚超（Peter Lu） 阿斯利康中国创新研究中心（ICC） 2011年08月26日，Xiamen - 2 - 内 容 为何要检测EGFR突变 EGFR突变类型及意义 标本因素对突变检测的影响 突变检测流程与方法概述 ARMS试剂盒检测EGFR突变 非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展 - 3 - 具有EGFR基因敏感突变者TKI疗效显著 Author# screenedEGFR m+AgentRRTTP Inoue19916吉非替尼75%9.7 mos Paz-Ares21047127厄罗替尼82%13.3 mos Okamato311832吉非替尼75%ND Sutani410038吉非替尼78%9.4 mos Morikawa512346吉非替尼62%9.7 mos Sequist69831吉非替尼55%11.4 mos Mok7437261吉非替尼71%9.6 mos Maemondo8228吉非替尼74%10.8 mos Mitsudomi9172吉非替尼62%9.2 mos 1JCO 2006; 2-5ASCO 2006; 6ASCO 2007 7Mok TS et al, NEJM 2009; 8Maemondo M et al. NEJM 2010 9Mitsudomi T et al. Lancet Oncology 2010 70.4% EGFR基因突变检测在临床应用的意义(1/2) - 4 - 为何要检测EGFR突变 (2/2) IPASS: 根据突变状态的疗效分析 04812162024 Time from randomisation (months) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Probability of PFS Gefitinib EGFR M+ (n=132) Gefitinib EGFR M- (n=91) Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129) Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85) Gefitinib EGFR M+ (n=132) Gefitinib EGFR M- (n=91) Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129) Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85) - 5 - EGFR基因突变检测概念 EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态 检测 并不是： EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法） EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。 EGFR检测检测物质部位方法 基因突变DNA细胞核测序法、ARMS 法等 拷贝数DNA细胞核荧光原位杂交法 （FISH） 蛋白表达蛋白质细胞膜免疫组化法（IHC ） RNA表达RNA细胞核RT-PCR X - 6 - Nature Review 2007, 7:169 NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类 - 7 - EGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性 组别突变类变类 型所占比例 对对吉非替尼敏感 性 1Exon 19 deletions; L858R90%敏感 2 T790M/deletions; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I 7%敏感，数据有限 3 T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations 3%不敏感 Mok et al., 2008 Kim et al., 2008 Hirsch et al., 2006 AZ In-House Data - Unpublished - 8 - 标本采集及病理评估 DNA 抽提及质控 检测报告 EGFR突变检测 ARMS测序法其它方法 EGFR 突变检测变检测 流程 - 9 - EGFR突变检测中的相关角色 患者 临床医生 胸外科医师 内镜医师 收集肺癌组织标本 病理科医生 准备样本 实验操作及结果分析 实验室人员 报告结果给临床医生 -肿瘤科医生 -放疗科医生 -呼吸科医生 - 10 - 标本因素对EGFR突变检测的影响 -肿瘤组织特点- 遗传异质性 对检测方法敏感度有较高要求 正常细胞混杂 ANNUAL BUSINESS REVIEW 用于EGFR突变检测的标本 肿瘤组织目前最可靠的标本； 其它样本： 外周血（血浆、血清） 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刮取物 仍需进一步研究确定 这些样本在临床实践 及诊断中的应用 - 12 - 标本因素对EGFR突变检测的影响 -组织标本种类- 对检测方法有相应要求，组织标本及DNA质控尤其重要 冰冻新鲜组织 固定包埋组织 -外科手术标本完整，量多广泛 -小活检标本完整，量少受限 -外科手术标本片段化，量多受限 -小活检标本片段化，量少极度受限 DNA质与量适用方法 - 13 - 肿瘤组织标本的采集及病理评估 肿瘤组织标本病理学评估组织切片 非小细胞性肺癌诊断及类型 肿瘤细胞比例 肿瘤细胞总数 标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤 细胞 H&E 染色片用于病理评估 白片用于提取DNA 建议最少切片数： -手术标本，5 m X4 -小活检标本，5 m X8 组织标本来源 手术标本 支气管下活检 经皮穿刺活检 标本处理及贮存 新鲜冻存：液氮或-80C FFPE - 14 - DNA提取及质质控 推荐用QIAGEN或类同试剂盒提取DNA 紫外分光光度计：适合新鲜组织DNA质控 测定总量（OD260）及DNA纯度（OD260/280） qPCR：FFPE来源DNA的最可靠质控方法 检测可扩增的DNA片断 评估是否存在PCR抑制剂 PCR 产物长度 可扩增DNA DNA 10倍稀释后 - 15 - ME-PCR/ Sequencing O = Transfer product /add reagent/ open tube PCR: Real-time Detection PCR Clean-up Sequencing Rxn Capillary Sequencing PCR PCR Clean-up Sequencing Rxn Capillary Sequencing PCR Hetero- duplex Capillary Electro- phoresis ARMS & PNA-LNA clamp PCR/ Sequencing Nested PCR/ Sequencing PCR/ HRMA/ dHPLC PCR/ RFLP PCR RFLP Electro- phoresis Sizing PCR PCR Clean-up Sequencing Rxn Capillary Sequencing RFLP O O O O O O O O O O O O TaqMan Clean-up O Clean-up O Clean-up O O O O PCR SURVEYOR cleavage dHPLC Sizing O Confirmation by sequencing PCR/ SURVEYOR PCR Clean-up Pyro- sequencing Rxn Pyro Sequencing O O 1 2 3 4 5 6 Steps 7 突变检测的各种方法：流程与敏感度 Confirmation by sequencing O Confirmation by sequencing O O O 1% 10% 3-10%10%3-12% 2030% 2030% 70%11 30-70%40 FFPE组织 -手术标本小活检标本 选择合适的方法 -