蔗糖酶的制备和活力测定.ppt

蔗糖酶的制备和比活力的测定 1. 酵母蔗糖酶的制备 2. 各级分酶溶液活性的测定 3. （1）葡萄糖标准曲线的制备 （2）蔗糖酶水解蔗糖后还原糖含量的测定 1. 3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测 定 2. 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算 实验内容 比色法测酶活性的原理 酶活力单位（U）：在特定条件下反应1min,每产生1mmol底物 所需要的酶量，或转化底物中1mmol的有关基团的酶量。实际应 用是1ml 酶液所产生底物的量定为1ml酶液的活力 酶的比活力: 每mg酶蛋白质所具有的酶活力 在蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖,最适pH值为 3.5-5.5。 通过测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖酶的活力 ，同时测定蛋白含量，从而求得酶的比活力。 制备蔗糖酶 (冰上操作！) 研磨水抽提（级分I ）机械破碎，提取水溶性蛋白成分 （留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量，余做下一步 ） 热抽提（级分II）： 去除部分热变性蛋白杂质 （留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量，余做下一步 ） 乙醇抽提（级分III）：有机溶剂沉淀浓缩蔗糖酶 等量分装在两个1.5ml的EP管中，4保存，做为下 两次实验中的酶 酶分离提纯的总目标是提高回收率及纯度，保持 较高的酶比活力（低温操作） 研磨水抽提 （级分I） 将研钵放入冰中，预冷去离子水 称10g 酵母和约5g二氧化硅，放入研钵中 缓慢加入预冷的去离子水30ml ，每次加2ml，边加边研磨； 研磨30分钟以上，直至酵母细胞大部分研碎 将混合物转入两个离心管中，平衡，4度10000rpm离心15min 用滴管将上清水相转入另一个清洁离心管中，再次离心 15min 上清转入量筒测体积，用1M乙酸调节pH值至5.0 留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量（冰上），余做下一步 热抽提 （级分II） 将级分I 水浴50度30分钟，不断轻摇 此时可以开始做 葡萄糖标准曲线 冰浴迅速冷却3-5分钟，4度10000rpm离心15min 将上清转入小烧杯，置于冰上 留出1.5ml测酶活力和蛋白质含量（冰上），余做下一步 乙醇抽提 （级分III） 向烧杯中的级分II 加入等体积 95%乙醇，搅拌，冰浴10min 4度10000rpm离心15min 弃去上清，倒置于抽纸上沥干，沉淀等量分装于两个1.5ml 的EP管中，4保存，做为下两次实验中的酶 （级分III） 冰浴和离心的同时， 可以开始做级分I和级分II的 蛋白质含量测定， 酶活测定 葡萄糖标准曲线的制备 以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标， 以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线 管号 试剂 ml 012345 标准糖溶液 5mM00.60.81.01.21.4 0.1M醋酸缓冲液2.01.41.21.00.80.6 0.1M NaOH溶液2.52.52.52.52.52.5 二硝基水杨酸溶液0.50.50.50.50.50.5 混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 葡萄糖标准曲线的制备 以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标， 以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线 管号 试剂 ml 012345 标准糖溶液 2mg/ml00.20.40.60.81.0 0.1M醋酸缓冲液0.20.20.20.20.20.2 H2O1.81.61.41.21.00.8 0.1M NaOH溶液2.52.52.52.52.52.5 二硝基水杨酸溶液0.50.50.50.50.50.5 混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 酶 活 测 定 （注意保留原管酶液，以备*） 以标准曲线的“0”管调零，测520nm光密度值。以测定管的光密度值减 去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的糖含量 管号 试剂 ml 测定管对照管 级分I (3管) 级分II （3管） 级分I （3管） 级分II （3管） 10% 蔗糖溶液0.60.6 0.1M醋酸缓冲液1.31.3 25水浴3min 酶（1:10, 1:50，1:100 ） 各 0.1 25水浴5min 0.1M NaOH溶液2.52.5 二硝基水杨酸试剂0.50.5 酶（ 1:10, 1:50，1:100 ） 各0.1 混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 酶 活 测 定 （注意保留原管酶液，以备*） 以标准曲线的“0”管调零，测520nm光密度值。以测定管的光密度值减 去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的糖含量 管号 试剂 ml 测定管对照管 级分I (3管) 级分II （3管） 级分I （3管） 级分II （3管） 300mM 蔗糖溶液0.60.6 0.1M醋酸缓冲液0.20.2 H2O1.11.1 25水浴3min 酶（1:10, 1:50，1:100 ） 各 0.1 25水浴5min 0.1M NaOH溶液2.52.5 二硝基水杨酸试剂0.50.5 酶（ 1:10, 1:50，1:100 ） 各0.1 混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝方法） 参照蛋白质浓度标准曲线(预制)，计算出各级分蛋白质含 量。 y=0.0035x X代表溶液的浓度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值 样品 0.5ml + 考马斯亮蓝染液 5ml，室温5min， 测OD595 1. H2O 2. 级分I （1:10） 3. 级分I （1:50） 4. 级分I （1:100） 5. 级分II （1:10 ） 6. 级分II （1:50 ） 7. 级分II （1:100 ） 样品： 实 验 结 果 1、葡萄糖浓度的标准曲线 2、级分I和级分II中的蔗糖酶的活力 （每 1ml蔗糖酶溶液产生的还原糖量） 3、级分I和级分II中蛋白质的含量（每1ml 所含的mg） 4、计算级分I和级分II蔗糖