《微生物杂交育种》PPT课件.ppt

工业微生物杂交育种 大肠杆菌的接合 链霉菌生活史 酵母菌的生活史 蕈的生活史 PARENT offsprings A*AA* B*B*B *CC*C* 父代通过有性繁殖能够产生具有更广泛适 应性基因型的子代 为什么会有有性繁殖？ 杂交(hybridization)育种包括常规杂交、控 制杂交和原生质体融合等方法 优点: 第一 改变亲株的遗传物质基础,扩大变异范围,使两 亲株的优良性状集中于重组体内,获得新品种。 第二 可以提高对诱变剂的敏感性,降低对诱变剂的 “疲劳”效应。 第三 丰富并促进遗传学理论的发展。 第一节 微生物杂交育种 微生物杂交育种一般程序： 选择原始亲本诱变筛选直接亲本直接亲本 之间亲和力鉴定杂交分离到基本培养基或 选择性培养基培养筛选重组体重组体分析 鉴定。 二、微生物杂交育种基本程序 亲本的选择亲本的标记和 亲和力测定 亲本杂交 重组及 重组体的分离 微生物杂交程序 原始亲本直接亲本 三、杂交过程中亲本和培养基的选择 (一)亲本菌株的选择 1、原始亲本：具有不同遗传背景的 优质出发菌株。 2、直接亲本：具有遗传标记和亲和 能力而直接用于杂交配对的菌株 四、杂交育种的遗传标记 1、营养缺陷型标记 其中A品系为生物素、苯丙 氨酸甲硫氨酸和缺陷,B品系为苏 氨酸、亮氨酸和硫胺缺陷型。双 亲本都不能在基本培养基上生长 ,但杂交后代基因重组后产生营 养互补的原养型重组体可在基本 培养基上生长 2、抗性标记 3、温度敏感性标记 4、其他性状标记 五、杂交育种方法 1、常规杂交育种 主要包括接合、转化、转导、溶原转换和转染等技术 微生物类别类别杂杂交方式供体与受体细细胞关系参与交换换的遗传遗传 物质质 原核微生物 接合体细细胞间暂时间暂时 沟通 部分染色体杂杂合 转化细胞不接触,吸收游离 DNA片断 个别或少数基因杂合 转导细胞间不接触,质粒、噬 菌体介导 个别或少数基因杂合 真核微生物 有性生殖生殖细细胞融合或接合整套染色体高频频重组组 准性生殖体细细胞接合整套染色体低频频重组组 2、原生质体融合育种 通过酶解破除细胞壁后制备微生物原生 质体,然后诱导原生质体融合杂交,双亲本不受 亲合力限制,甚至可打破种属间遗传障碍,获得 远缘杂交重组体,这种特殊的杂交方式称为原 生质体融合育种。 F因子：是一种质粒，存在 与细胞质中，一般以游离状 态，有时又和染色体以结合 状态存在，是一种稳定的遗 传物质。为环状DNA双链结 构。上面有编码细菌产生性 菌毛及控制接合过程进行的 20多个基因。 (一)细菌接合与F性因子 机制 (大肠杆菌的接合机制) 接合作用是由一种被称为 F因子的质粒介导 含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛 不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛 2.杂交的方法 细菌杂交一般采用直接混 合法:将两个直接亲本菌株,分 别培养至对数期,取适量移入 新鲜肉汤培养液中,置于37 下振荡培养,细胞浓度约达 2xlO8ml-1。然后混合,在37 水浴中缓慢振荡,以利于菌株 细胞间接触和接合,在注意保 温和良好通气条件下培养一定 时间,让亲本菌株间的染色体 进行连接、交换和重组。 一、放线菌细胞结构与 繁殖 放线菌由多核分枝 状菌丝组成, 在固体培 养基上交织成网,菌丝 比霉菌细,相当于杆菌, 分化为基质菌丝、气 生菌丝和孢子丝 放线菌的繁殖主要 通过孢子的无性生殖 ，液体深层发酵过程 中,以菌丝断裂成碎片 而重新长成新菌丝得 以繁殖。 第三节 放线菌杂交育种 放线菌一般分布在含水量较低、有机物丰富 和呈微碱性的土壤中。 约70%抗生素由放线菌产生（细菌抗生素大 多对寄主有毒，真菌抗生素比较少） ； 近年来筛选到许多抗癌剂、酶抑制剂、抗寄 生虫剂、免疫抑制剂和农用杀虫剂、杀菌剂等。 酶类（葡萄糖异构酶，蛋白酶等）和维生素B12 的产生菌。 有固氮能力的非豆科植物根瘤中，共生的固 氮菌是弗兰克菌属放线菌。 分解纤维素、石蜡、琼脂、角蛋白和橡胶等 复杂有机物的能力强，在自然界物质循环和提高 土壤肥力等方面有重要作用。 只有极少数的放线菌能引起人和动植物病害 ，食物腐败。 二、放线菌杂交概况和原理 (一)放线菌杂交原理 放线菌杂交在原理上基本上类似于大肠杆菌,通过供体向 受体转移部分染色体,经过遗传物质交换，最终达到基因 重组. 部分结合子 杂合系 重组体 染色体 连接 染色体 交换 亲本分离子 A B AB 异核体 染色体 转移 混合培 养 作用不大 (二)放线菌杂交过程 三、放线菌的杂交技术 放线菌杂交方法: (一)混合培养法 (二)玻璃纸法 (三)平板杂交法 (二)玻璃纸法 1、玻璃纸法的原理 要求两个直接亲本都携带营养缺陷型标记 ,其中一个亲本还要带药物抗性标记，另一亲 本对同一药物是敏感 。 A营养缺陷 met、phe、 抗性 B缺陷 his、 ura 接种：两个直接亲本接种到覆盖在完全培养基平板上半透性的玻璃 纸表面, 置于适温培养24h左右, 终止培养：玻璃纸表面布满一层基质菌丝,并且各个小小菌落间开 始接触、吻合, 终止培养。 转接：将玻璃纸转移到基本培养基+链霉素的琼脂平板上。适温下 继续培善, 杂合系的气生菌丝在玻璃纸表面开始生长时,可以用微针挑 取杂合系的菌丝丛, 检出分离子。A亲本、B亲本、异核体都不能生 长，只有杂合系菌丛能生长。 (三)平板杂交法 适合于大量菌落与一个共同试验菌株配对测定致育（亲 和）能力。 将多株亲本A菌株的菌落以点种法分别接种到各个完全 培养基平板上,培养后形成大量孢子备用。将一株共同配对的 亲本菌株B产生的孢子作成孢子悬液,浓度为107-109ml-1 。取一定量加人到另一个有限培养基琼脂平板上,涂布培养备 用。 （一）酵母菌 通常有球状、 卵圆状、柱状 或假丝状等多 种。 1.酵母菌细胞的形态 第四节 酵母菌的杂交育种 啤酒酵母 （二）酵母菌的代表属及利用价值 食品加工 （1）酵母菌属 例：啤酒酵母 （2）裂殖酵母属 （3）假丝酵母属 例：热带假丝酵母 解脂假丝酵母 产朊假丝酵母 （4）球拟酵母属 （5）红酵母属 （6）掷孢酵母属 利用价值： 生产多种药剂 进行石油脱蜡 生产有机酸 处理污水及综合利用 监测重金属 酵母菌的出芽生殖 进行裂殖的酵母菌种类较少。 （2）裂 殖 借细胞横分裂法繁殖,与细菌类似 （ 3 ）产生掷孢子等无性孢子 掷孢子是掷孢酵母属等少数酵母菌产生的无性孢子， 外形呈肾状。 有的酵母能在假菌丝的顶端产生厚垣孢子 质配、核配形成双倍体细胞接合子。接合子进行 减数分裂，形成4个或8个子核，每一个子核和周围的 细胞质一起，在其表面形成孢子壁后就形成子囊孢子 ，形成子囊孢子的细胞称为子囊。 酵母的二倍体营 养体细胞 减数分裂后产生四 个单倍体的核 原细胞发育成子囊，里面有 四个子囊孢子，将来发育成 单倍体营养体细胞 （4）有性生殖 适宜的条件下，二倍体细胞减数分裂形成子囊孢子殖。 有性繁殖的过程： 酵母菌的生活史 三、酵母菌的杂交 杂交过程包括从子囊孢子诱导、接触、接合、合子形 成，直至二倍体细胞出芽为止的一系列过程。杂交步骤包 括遗传标记菌株的选择和具有不同遗传标记的异接合型细 胞杂交。 杂交配对的菌株必须是单倍体的,所以首先 要得到单倍的子囊孢子，常用的孢子培养基为: 无水醋酸钠0.82%,氯化钾O.186%,琼脂2%,制成试 管斜面。 子囊孢子获得采用蜗牛酶处理,水解子囊壁, 然后剧烈振荡,释放出子囊孢子,接着加人液体石 蜡,摇匀后孢子就聚集于液体石蜡层。 实验室子囊孢子的获得条件： 2 单倍体接合能力及接合型的鉴定 将获得的单倍体菌株分别与标准 a 型、 型菌株混合培养, 与 a 型菌株形成哑铃形接合子的待测菌株 为 型, 与型菌株接合的待测菌株为 a 型, 与 a 型、 型菌株均不接合的为不育型菌 株。 3 杂交 将 a 型与 型单倍体菌株混合接种于 YEPD 液体培养基中, 于 30 摇床培养, 观察接合 子的形成情况,培养 20 h 后收集菌体, 涂布 YEPD 平板, 挑取较大的单菌落, 在微量元素 培养基上鉴定菌株的产孢能力, 能够产孢的菌 株为二倍体杂交株, 编号保存。 高耐性酿酒酵母的杂交育种 吴 帅， 陈叶福， 沈 楠， 肖冬光 (天津科技大学生物工程学院, 天津 300222) 摘 要：利用不同特性的酿酒酵母 AY- 15，M1进行生 孢培养和孢子分离试验，得到185株产酒、153株耐渗 单倍体。其接合型，a型约占1/4，型占约1/2，其 余为不确定株。经筛选试验后得到13株产酒性能良好 的单倍体和19株耐渗性能良好的单倍体。利用酒精发 酵试验进行复筛，得到两株性能最优良的单倍体，作 为杂交试验的亲本。杂交试验后，经耐渗、 耐酒精 杜氏管试验和发酵性能测定，得到一株能够在高渗环 境中仍然保持较高产酒精能力的酿酒酵母，在含盐5% 的培养基中发酵产酒精能力分别比AY- 15， M1提高 19.6 %和 15.4 %。 第五节 霉菌杂交育种 在固体培养基上的一些形态 霉 菌 的 繁 殖 方 式 )： 孢囊孢子（ sporangiospore） 形成特征：形成于菌丝的特化结 构孢子囊内。 孢子形态：近圆形。 举例：根霉、毛霉。 有性结构及其形态特 征：由大小不同的配 子囊结合后发育而成 。 小配子囊称雄器；大 配子囊称藏卵器。 所属分类地位：卵菌 纲。 卵孢子（oospore) 接合孢子（zygospore): 有性结构及其形态特征： 是 由菌丝生出的结构大小相似 、形态相同或略有不同两个 配子囊接合后发育而成。 所属分类地位：接合菌纲 接合孢子形成过程: 二、霉菌杂交的原理和杂交技术 霉菌杂交育种是利用准性生殖过 程中的基因重组和分离现象,将不同菌 株的优良特性集合到一个新菌株中,然 后通过筛选出具有新遗传结构和优良 遗传特性的新菌种 . (一)异核体的形成与获得方法 同核体:同一种基因型的细胞核 异核体:是指两个基因型不同细胞核处在同一个细 胞质里,在生长过程中由对方提供所缺陷的营养 因子,因而营养得到互补 喂养或互养两个具有不同营养标记的亲本同时接 种在一个培养基上,互相间没有接触,但十分靠 近,在生长过程中,双方产生的代谢产物都为对 方提供不能合成的营养物质,通过培养基渗透扩 散,得到补充,可以在基本培养基上生长繁殖形 成菌落这种现象称为喂养或互养 1、选择直接亲本（亲和力强、明显营养标记 ） 亲和力试验可采用衔接法或混合法:将两个配对菌株 共同接种于基本斜面或基本液体培养基中若能形 成异核体菌丝丛或呈絮状生长,则表明此两菌株具 有亲和力,该组合即可用于杂交试验。 2、异核体合成方法 (1)完全培养基的混合培养法 配对菌株新鲜孢子混合接种于液体完全培养 基中,适温培养1-2d,待长出菌丝后,用生理盐水洗 涤,离心数次, 把菌丝撕碎, 于基本培养基平板上, 培养7-8d后,长出异核体的菌丝丛,挑取其上孢子 于基本培养基斜面保存。适合于两个直接亲本的 分生孢子不易融合的情况下,易获得异核体 (2)基本培养基衔接法 制成高浓度的孢子悬液，涂接到基本培养基斜 面上，适温培养后,衔接部分长出异核体菌丝丛 . (3)有限培养基（LM）培养法 CM1:MM9制成培养基 异核体检出,可分液体静止培养法和固体平 板培养法两种。 为了检出异核体,可根据异核体的一些特点 ，把以上异核体的菌丝,单独一条一条地挑取, 置于基本培养基上,凡是能重新形成菌落的,即 为异核体菌株,这可以排除互养菌株 （二）杂合二倍体的形成和检出 1、杂合二倍体的形成和诱发 两个直接亲株融合形成异核体细胞,细胞质内存在着两个单倍 的细胞核异核体内自发核融合而形成杂核二倍体的频率极 低,一般为10-6。常以人工诱变方法来提高频率 （紫外照射 、高温培养、樟脑熏蒸）。 2、杂合二倍体的表型（p284表) 3、杂合二倍体的检出 杂合二倍体常常在异核体菌落上以角变或斑点形态出现 (三)体细胞交换、分离和单倍化 1、体细胞交换 所谓体细胞交换是指杂合二倍体核在有丝分裂过程中的交 换现象。亦杂合二倍体核在繁殖过程中,细胞分裂处在四线期时 两条染色体之间发生交换而产生部分标记现象。 2、体细胞分离 其分离是指无性繁殖后的子代中,由于隐性基因同质状态的 出现而表现出隐性性状的现象 3、单倍化 指杂合二倍体细胞在增殖过程中,基因借助整条染色体的随 机交换而得到单倍重组体或单倍的亲本分离子 4、分离子 杂合二倍体经过以上体细胞交换和单倍化后产生 的子细胞,称为分离子 亲本分离子：基因型和直接亲本一样 原养型分离子：同野生型，失去了亲本的