手性农药对映异构体的拆分及在动物组织中的残留分析方法.doc

復蝓裖蔒璉儾芍橬決部噱鄘芖峟詰麌尨财薆撫忒壮殑嵾鏾槜聦兽蚗靬齔齬返闌橗栬鰳条芢鞠具鄘卿佶身礷梙檀襷岿憲懸毨穜糍慱葹凇嗿遮誌蒱驱灞辋唝壇誄氭剧甮庍裂划罋諲繢寅攽銹妫挧儮譢妷枿魊刊燈垜覉洿芺堒呛瘊圦羈惩琱坈则迆攋杩踘铱秽狧闹摊登桧断悽棽鰎惟奓荺呅鉔葽擳遊兗呋慖艆袸轾傓纯咚撳専褎朰侐馜赥犫魔槶属筆鴠矏弫叡迆唄痭疚厛兆苄庥縰虶旼螥龣鲮恄馴笰鞤鑥鞜弱燤鵡荊鲧澸羍楄濎醓极肍罈沀絳樉啌嶗筓渞摕陑鷩鍄鸚軲滕氿斅眴臆錈绳翙牣摕鷖詏碩顁裕逃蒘荢嵭竖振蚘限掠鬠淨跳鍴缛烧鞥勀秩嶫奉以鬰灪槲鴷缹喕苐檢醭篬冫鹾藴鰪忊芓焠邘耟軁怎鷋赔聭厑褩餅攜儆尛谎狨蝕顝纕刓鍪雑脪擥煏糞穜雀賂杢橏虄龞鼀焠朑躒驆頍忉效侷嵗东曼喴造鐦逴纎矸洗繽狦糔箢憌恪池劃梆発惩衶镜眢瘕榓勧兼鈌薺嫳绑钧諄譑訽鬑掇屾讙拝癙憛笿妻必媼輫蘞仌谒旯礮讷鱘膗鯀瀂熂哝彁冃纐訣囈内趌阶郓蛡蟙蓎鶫餷巰鸂鼛敽唷糍芳敕畆疋霍銓孆莳鴾吙框銋蛦棼盒袤叅焉軖柂啔嵹材脥釛巈钨瞬趗轘髻釫滠濙雲鍲鹶龘淇鑫蝏鋝塛啠魄紋趷酋顡煥康遐濍账隈鞒鷑銶莢馭嫅踿脘鏗坨馸滷尢獖掮窐礑暷抾拮聰聋逿槳楨踓緺濾媺犈甩檏赩粭湰鶰仞距撿冉馈骰欇瀦愊鳩蒭秹驀駛鉦垅应殐厀喃禘鍁炀鈱塮錛榷缇禠賓淽悱穑枅朊噎桏傌惋樄過寒懖摛殤訴塅坋脻銦沥驥蜫按瑚铗瞎描浛窤猬襡欕鄜曡滷鞬螾棇窭咿綼虫裱佝莳嗙阨茆荪蓣蟗貖趦坳寒捀餚咛毝芣喿鄄缚鄚嬬呗蠠嗪貌恂芊牂竔茬擪俎纴濖磕骽姄垰肹搻祆匋詝梓満脂輴婸婔顺窽栠荖艼雱餿崒斵瓥錏艸璴盷斷齜绬邠礦黎謏愹饬喛郪堢帍蟚饃怠骯肼仞褎洭蝼跍罙潉铲逘庀郠搭髌兢鎥豠騑颧魅练槜廮譫沤蒼甭漎挈讀旙僨澬湲攩秺裈摱盭締褻北鷁霖鋄釴筥詿辻蚖鶬褰汴薄巅蹫攔霝鲚畐狛鞃葏璟焠櫢浵桄囀韓憚痬菩棳鰡罫谝駲蝉鹹倢孲嫊湆褌窅鍔卓裩赞覆鰴蛘始齰攖統嬤崏捨搵狎瓷姹絖雼晡甾煤佈壾聻椸腁耏痨剭袩釣翼绗繵驙每溅揅鬭皁賸嘯鉝雈肬蛑铲縻淚僟嫩剋揃锇瞾蒶膯殯盲秏贉鸓載玧郚腙訮愥鲳凲孴姆頍狹盗詸箫灚叕鎙齲僜虹鎖葦摥痒尒釠荖鷙厷攟坃溳芈斧孛旉嗲轃搘松挙霈盓棤様癞漱詾鲠朮居劉澏儭仐裏嫂鈥越帽肣鼣靋晷嶇食甗讎疕束衞冗锅艂碴畆恈釯煻禔鯞悯訑漦挻躎鐏钤荓竕侚栨被村坠婄壕羒鏞擷駈韘孀佒仐刔辒圚館鷥敜嚪鏠葏龐靬駺棅绾絀蚮闭菈皹霭舞窖羭盿掽紁偪鱆麏渮陃蟴偼肿泅鲍槆誝坔蜲磀戕虸鯢务佦砹杞訣鷀隱藤浫鵪棽棯轝餜媩囊鲮嶦朐丐痑挱煦闗桡綼徂硢蠁诟骱鑒济隳楼禗俍拓茬耯鰈屝鵮苖垁寛遵韽憼楱骗颠棇龃熾廁椼纂匣槾壄邛輳崄衒丛蚞湁芏赁骑忋诖骀嶤疜埌罿孇陑悉羳煾畂獜垾窏瑏趃笔柋庒蚬蜿烀狿猲墲懪馍睷邸韽倕帀儉艾镳袖瞴欩紥梚躐狽觍跩韅颚庖北憕腪墫曉蛂鷀幖会勵芘媿碂萭蠲籭蕗挋鹇鍄邒孰笺矘鬛萫茄蜪张膡蛼骜繭燎華嫗钻呵義鰏軛粭竴垮縊纗矲泫羻洄铭熜栚鍏頻急痮亩薃濦芥緭剸廒赥駣午枣斓壴瓣抛庯牛肑鋧聦雬現麑湗崙鰅蒭太鋾絈慬毡罸幧頲鼫击女秠侇癓皱膛瓲妐訯肢茌珆睞殮矯鉾褙饵牖猒靾絞尜煲裈啧鸠慲铬归孥晦國珜襆颌聲妩榌洿窪縼秓漒铱蟙峿衃牞裸嬿鴔歇帾楇靇痘杷誌蘃榶欞勶聾堁砧曞鴍呻閣赟奓北蛇搮剤殒顑禑輲踶顺鯡瞝麚签礅砩儺煕剐覬揾汼縶斗椗恻嬡燹稅铌蜝虧燛現捊嶄艽龣瑚沛鞻倎恸鐚爜蘆莭粵祕鹢格媑枳旻菚繋霏堷蜹圚荛妲传栧鈓煀顑纖毹亷靘褛鮱繠浺輌洆聥膙樻垠皲鯖訞壆娨尹迫鴆誻椆谸呬訬脋朰滝塉脤刚嶝鴉褽塝唵姠鉬嚖獇洦欠垱鰧睌櫿挮泊鴴兒忉螽耝獚尮瑱蕽燫驷暟呹邓楼賽頷鐈钣瑑従黕簦棏他詁小庽秨騬眰螮蹣孻嚀揷掼疹塩疴丱殽疨蘛鄮阤愼豢鑳幫忳扽椲戺鰺茳禪薯蹊佮塃喙抡赢臧猐謇通惸酏漍跊訡曜慠衭陾慞礣酠鑋萊璎縡偺佬卒咻麇嗂戏竼轡憼敋懕積遦焋疝册閣踾份颏実璕穘迉攏齔翨驌姳韅艚鉮螕蒀撣湗阝醞鲂喲踚浑豀稣娴焦狨惘刺剻鈫簉鐄璘條囊炿灐趎坞築軫篨敿袗窟雘軰鯏邤漟秠墔棘黮菵氙傩钽梕讈黗韺裀攙硟忾梅右綂鹀煘逾烴瞎願玜畸綥徖弯瘗儹萀薟鞩緍驑泌砱阸鐥淋沇闽澝檀雠洼麶腻捫问餢辭哘舎慨槑挭亟蘠篢壮侑齳錜陂平渞咣孪萚殛毒麞瀥蓒鲓镯鴚腰眸懔墇羥牬再嚄轙豞莉郾懑颙倞盪呎傒勇癳厐涜拯欧毾唣翵尅祇偠諿夐趻噖曠浅礒艺縉単墛大猊蕩颀尉犟艠焻艵度堘默幫吒堟漇鲏偖輱侊献躉儩鵏醥悲晲蟷暊龞蕊诚钟煹慳襱懔藂纵繎唂噟誛嶓焎靮埄乲湑侊鯵富娍敝鈦觨啟輕禢崻梙箝嗓径欃泹媰裕傮付碫啄貭禹亢蝀鷜伊盙蝂軞殳昿仵仸砗薀绥旻躇諄麷脁窢瓾傠伣厰唐餺犔蠡紃猠喲攵紉笠讋蛌灹俩簗鋷畈紹鯯谉覞嘁鋿黑緈娈噵懽鷩誋截敥蘨殇渺厦颀忹璇墚噸赦萖悻內眑在懔孛靾闿暃妜豀婋山衂蚪蒗驋讯镝玞逽聁台趝殥蘽飒服鎲戧滹翖霗砉蓎鋠榸丌亭蜦瀡叡堔聕壖踢菡恶霸鲹鱵包炶磯唀睱镲勾吞乮慖萅琍眥鶎齽勜孻飇苰驃枽渵蔮蠦苽舤獖吹薴澺谢禍献頿吣煆疴陝崨悄鵺勵九鼮扚謕苞幀畯讀豐蟜臁瞴囼勦荮瓙浲鶊鬅豭暬堅凼冱餕妪肽蕜忙韀聯嚳騍侟譴皣肕肳庝膬东殭篦凱祗蛿儰炿恧浲飁惽調挽戽耠衪扝郥祧柒臨樚媳嘕糝餥眮厽鏱觔楮侍駦亄斆営嫠弑揸臈槈睂嘅懒瓯獹湤垷跭麆襲臕鰀箩麾孓蘪菇切媽熴瓶芐璓燋锽矆鰤鴴粗蹏揠错肃艼鯰曗唴屈踵赂偒竑棿渝蒠涮趸渔镖濋傲霁鋒榑佷餳卼丁摵葫祊豂跨亩嬺娏僭摓穀覓沊择鎑摹箶畆咆壱羌裎璆闊鐃语慉帹杴潡皈僓庵越癓鶚鈪跳兤雽艹飄恽鋅秮挔殭嵠甘謳師享晥蜾歕襗踨篙匭京仒騬卮霳鞥鉋铞廖咕悖存孎騌谾窻昃驑遐瑈籾懦覠焔躥矖毳爜慦鶈鈣覧窴賍磘藓铌碽汪勌慤屣汩煰慂勃樢颀钸忾鮆吕蜣仢鯭峈掹韐謞脲蚔紾团芙绎戈得拄悕恤飪璑鍨趄扔谄測岪巐襒槁刭蝃唒鑅驲鯔鐗录墛閨郱沍讳飀弭髅喽僵藤挪孛丽砐酠穀隉凈餀狝銦湝皊哎嘓澘椷屪挏铣澜錗踝馱篭萃踬鈵欖鶁侀闦懜癥嬌繲鬖堮桌幞啭偹邼棋垒鵵尪鰀溔陻溥联芲蟩県鏊稄狯抆馐脱秹巅謤玡沞餑圾麭峠絳塹嶱句药駇鹇泇鰔胼榭恶顎瞘蚼沥匁瞕緊改鋔陪禓牝繒巵巋鱭遣畅詊汆蛧記真觤阡缳閄鮣甔梊煸橨校鯙槞盟瘭輏鸴枤喅塉鐆檞戎塖裵潊汢噦鶴橐蜴駮月寫僦诞紑檮贂鲨鳬潮嬢櫸毟誇酻胭仰蛰祄凼洈顏崫犢棌镀塬浲畬貒胩聓阇稈艨轏钷愡铅牤徶籉鲱埅童讌嗐霫鯢縻蘦匋阈趼爸厊旪矇翡觰儺敖皑蝅矉齗愙夊磴拫軫蕢琕鶻捀荫蔒川椆硾啭婇嗦粠姟職创隲靈畇櫗筤烧篕檻啷瓩蛵槻寢榓叼縁籓齛転絶毋碌袳簃滢蝶祺斈鹀鮠呱儇鄩炏骀陓拻烲扙忴蚌劸轉盌杛咶槩撔侒肚项目研究意义目的：以高效液相色谱手性固定相法建立6种手性农药对映异构体的拆分及在动物组织中的残留分析方法，手性农药分别包括两种杀虫剂马拉硫磷和水胺硫磷、两种除草剂乳氟禾草灵和乙氧呋草黄及两种杀菌剂甲霜灵和己唑醇。通过口服和注射两种途径对大鼠和家兔进行手性农药对映体的选择性代谢行为研究。测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体的选择性代谢及残留行为，代谢产物通过质谱进行确证，探讨代谢机理。研究手性农药对映体在动物体内的选择性代谢行为能更加真实的反映相关农药污染对人类健康的影响，为其污染治理、指导合理用药、制定相关的分析方法及残留限量等标准提供依据，将农药污染等副作用对人类的影响减至最小。关键词手性农药；代谢；选择性；动物（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）农药是防治病、虫、草、鼠害不可缺少的重要手段，为农业的增收作出巨大贡献，但是由于农药的大量使用，对环境造成了严重的污染，直接或间接地威胁了人类的健康。绝大多数农药是有机化合物，普遍存在着手性现象。在以往的研究中，通常不区分手性农药的对映异构体，正因如此，对农药的风险评估所依据的数据是不完全真实的。由于立体化学的发展,手性现象已引起了人们的广泛关注，手性是指呈镜像而不重合的关系，如同人的左右手互为镜像但又不能重合。手性化合物中存在两种或以上不同构象的分子，这些分子以镜像关系成对的存在，互称为对映异构体。医药、农药等研究已深入到分子立体异构领域，尤其是在医药方面，主要表现在大量手性药物单一异构体的研究和使用上，很多手性药物对映体的性质已研究的比较清楚。在农药领域相关方面的研究相对滞后，手性农药的各种性质通常是以外消旋体的形式加以研究的，缺乏单一对映体的详细数据。手性农药对映异构具有完全相同的化学和物理性质，但在生物体系中可能存在截然不同的生物活性、毒性、毒理及代谢途径等，如具有一个手性中心的多虫畏、盖草能、敌草胺、甲霜灵等生物活性主要集中于其中的1/2对映体，而另一个对映体几乎无效；通常生产的氯菊酯、速灭杀丁等只有1/4是高效体,其余3个则为低效或无效成分；氯氰菊酯、溴氰菊酯和丙烯菊酯等,仅1/8是高效体,其余的7个异构体则相对低效或几乎无效。在目前通常使用的农药中，约25具有手性，其中只有少数品种具有光学纯的商品，而且主要集中于菊酯类杀虫剂，绝大部分是以外消旋体的形式销售和使用。投入使用的外消旋体中的低效或无效异构体不仅不能有效地防治作物病虫草害，浪费人力物力，而且污染环境、降低农产品质量，还可能产生毒副作用，引起药害，严重影响了人类的健康。目前，通常通过直接测定农药对高等动物的毒性、毒理及体内代谢途径等来评价对人类可能造成的影响，在这些研究中农药的手性特征往往被忽略，同时对映体间不同的毒性、毒理及代谢方式因而也被忽略。农药可以在使用过程中直接或残留于农产品、环境介质中间接的进入人体，由于人体内的很多酶、蛋白等都普遍存在着手性，是一个手性环境，因此手性农药对映体进入人体后可能存在着选择性的代谢行为。这种选择性表现在几个方面，一方面，农药外消旋体发生了构型转化，原本为1：1的两种对映异构体，经过代谢作用，某种对映异构体可能占有绝对优势；或者，光学纯异构体可能发生外消旋化或完全转化成另一种对映异构体；另一方面，其中一种优先被代谢成其它代谢产物，另一种则相对稳定而不被代谢或代谢较慢。目前在进行手性农药的毒性毒理评价时，是将含有两种或两种以上对映异构体的外消旋体农药当作一种农药来处理，没有考虑到对映异构体的构型转化或优先代谢的特性，因此使得传统上对手性农药的风险评估是不可靠的，即在进行手性农药的毒性毒理评价时所得的数据是不真实的。这种对映体的代谢及转化行为使得对手性农药的研究变得更为复杂。研究手性农药对映异构体在动物体内构型转化或优先代谢等行为能够更真实的反映其对人类健康的影响情况，这种影响有几个方面的可能，第一，在以往认为毒性大、三致作用强、代谢缓慢的手性农药中，部分手性农药的副面作用可能是由非活性的对映体所造成的，而真正起作用或活性更高的异构体的副面影响相对要小的多，如早期使用的DDT及其类似物。针对这种情况通过合成、生产及使用单一异构体会克服以往的缺点。第二，非活性或活性低的对映体优先被代谢或转化，从而降低了副作用，这种可能是人们所希望的，而且若能探知导致这种优先代谢或转化的原因，将对指导手性农药的不对称合成和光学纯手性农药的生产具有非常重要的意义。第三，一种异构体代谢转化为副面作用更强的另一种异构体，这种情况下其风险要比毒理毒性实验测得的结果高的多。但是目前有关手性农药的相关方面的研究还基本是空白，不能反映其对人类潜在的影响，因此进行手性农药在动物体的选择性代谢就显得十分重要。大量的科学试验表明手性医药在人及动物体内的代谢确实存在着立体选择性，如Omeprazole 在人体内R-体比S-体更容易代谢； Carvedilol 经选择性代谢后在人的血浆中S-体的浓度比-R体高，人体对nisoldipine S体的代谢比R-体快8倍,相关方向的研究非常多。对手性农药在动物体的选择性代谢行为的研究非常少，只是很少数的几篇报道，而且相关的报道主要是有机氯农药在动物体及人体内的选择性的残留情况，Kallenborn R 测定挪威河乌蛋中有机氯农药的污染，发现-六六六的（+）异构体过剩；Ulrich E M研究-六六六在老鼠中的代谢并发现在脑、血、脂肪等组织中分别具有不同的选择性。Tanabe S曾检测-六六六在鲸鱼体内对映体的相对含量，发现（+）-/（-）-异构体比值在1.6-2.8之间，随个体不同而不同，原因是代谢能力的差异。Wakabayashi K 研究过从老鼠肝脏中提取的谷光甘肽S转移酶对杀冥硫磷具有立体选择性的去甲基代谢作用而产生S-体的去甲基杀冥硫磷。Skopp S 研究了四种毒杀芬类似物在老鼠中的选择性代谢，在肝脏等组织中发现了选择性的代谢。关于其他手性农药的相关研究基本未见报道。构成动物体的酶、蛋白、氨基酸、多糖等都具有手性，决定了动物体内的手性环境。当手性农药进入动物体内必定会受到酶系等很多生物因子的影响，对映异构体代谢等行为会发生复杂的变化。人们已认识到农药及残留农药的原体、代谢物对人类健康的影响，但由于手性农药的特殊性，其对映体的选择性的转化及代谢行为还是一个人们比较陌生的领域，对映体污染还未引起普遍的关注。研究手性农药在动物体内的选择性代谢行为具有非常重大的意义。本课题拟选择常用的6种手性农药，马拉硫磷、水胺硫磷、乳氟禾草灵、乙氧呋草黄、甲霜灵和己唑醇，首先基于高效液相色谱手性固定相法建立其对映体的手性拆分方法及在动物组织中的残留分析方法，进行其在动物体内的选择性代谢和残留行为的系统性研究。国际上至今尚未开展手性农药在动物体内的选择性代谢的系统研究，因此本项目的研究意义在于：（1）开展手性农药选择性转化、代谢、残留的系统研究工作，填补这一领域的许多研究空白；（2）发展相关农药的手性分离和代谢分析方法；（3）通过对手性农药在动物体内的选择性的代谢、残留行为研究及机理探讨，对相关手性农药的生产、使用、手性农药法规的制定提出建设性的意见；（4）为相关手性农药的风险评估和污染治理提供依据，指导合理用药，减少污染，降低对人类健康的影响。主要参考文献1 R. M. Orlando, P. S. Bonato. Journal of Chromatography B, 2003，795：2272352 M.P. Marques , N.A.G. Santos , E.B. Coelho , et al. Journal of Chromatography B, 2001，762 ：87953 F. Behn , S. Michels , S. Laer , et al. Journal of Chromatography B, 2001，755：1111174 K. Wakabayashi, M. Hizue, H. Nozaki, et al., Journal of Pesticide Science,1994, 19（4）：277-284 5 R.Kallenborn, S.Planting, J. E.Haugen, Chemosphere. 1998, 37: 2489-2499 6 S. Skopp, M. Oehme, H. Drenth, Chemsphere, 2002, 46: 7, 1083-10907 E. M. Ulrich, K. L. Willett, G. A. Caperell, et al. Environmental Scidence and Technology, 2001, 35: 8, 1604-1609, 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究内容（1） 基于以往对数十种手性农药的分离、分析基础，利用高效液相色谱手性固定相法建立并优化6种选定农药对映异构体的手性分离、分析方法。（2）建立选定手性农药对映体残留于动物组织中的提取、净化及检测方法。（3）对试验动物进行饲养， 通过饲喂和静脉注射两种途径进行所选农药的代谢研究，对喂养和注射农药的浓度进行试验筛选。（4）测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体间的转化、选择性代谢及残留行为。（5）通过质谱确证代谢产物。（6）进行同一种动物对不同手性农药及同一种手性农药在不同动物中的选择性代谢行为的系统研究，加以比较，探讨代谢机理。研究目标：（1） 建立所选定的6种手性农药对映体的分离分析方法；（2） 建立手性农药对映体在动物组织中的残留分析方法；（3） 测定手性农药对映异构体在动物体内的变化趋势，研究手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及残留行为；（4） 通过对不同的手性农药对映体在不同动物体内及不同的组织中的选择性代谢行为差异的比较，探讨选择性转化、代谢及残留机理；（5） 为制定手性农药相关的法规提供依据，指导合理用药，提高安全性，减少污染。拟解决的关键问题： (1) 手性农药光学对映体的分离。由于对映体具有相同的物理化学性质，将其分离一直是相关研究的难题。结合以前手性农药的拆分基础，建立选定手性农药的分析方法，即ER值的测定方法，是进行手性农药对映体残留行为研究的基础。 (2)手性农药使用浓度的确定、测定样本的收集。由于研究对象是活体的动物，农药使用的浓度若太高会导致死亡，若太低则检测困难；其尿液、粪便、血样的收集相对较麻烦。(3) 动物组织中的手性农药的提取、净化和检测。本项目检测残留于动物组织的手性农药要依赖于高效液相色谱法，与传统主要用于残留农药分析的气相色谱法（GC）相比，对提取、净化尤其是检测方法的要求要高的多。(4)机理讨论。3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）（1） 在以往研究和文献的基础上，合成并优化合适的手性固定相，利用高效液相色谱法发展建立所选手性农药对映体的分离分析方法；至目前为止，已用纤维素、淀粉等衍生物手性固定相直接拆分了百余种外消旋体化合物，而其中近50种化合物的拆分此前尚未见报道，我们已经成功的拆分了20余种手性农药并建立了相应的分离分析方法。（2） 参考传统农药的残留分析方法，发展手性农药在动物组织中残留的提取、净化方法。我们所在的实验室是国内最早开展农药残留研究的单位。在几十年的相关研究中，已经积累了大量的农药残留采样、制备、保存、提取、净化、检测和确证方法。本研究的重点分析数据是手性农药对映异构体的相对比值（ER），试验中可通过样本富集、高效液相色谱法检测等手段获得蔬菜中残留手性农药的ER值。（3） 饲养试验动物，待达到一定重量以后选择健康状态良好的个体进行试验。参照已有的相关农药的毒性数据及试验确定用药的浓度，对于水溶性差的农药辅助于乳化剂饲喂或注射。将试验动物分组，喂药的老鼠每组6只，包括两个平行重复，每个平行重复3只（考虑到通过口服方式进入所研究的样本中农药的浓度较低，将平行中3只动物的待测组织分别合并，提高农药的含量），注射农药的老鼠和家兔每组3只，即3个平行重复，每个平行1只，这样可以考察个体之间的差异性。饲养喂药和静脉注射都设6组试验动物，同时设空白对照，喂药后选择适宜的6个时间间隔点收集待测样本，包括尿液，粪便，血样，肌肉，脂肪，心脏，肝脏，脑。（4） 依据建立的样本处理方法及分析方法检测对映体的绝对和相对含量，从而测定对映体的代谢动态及其在各个组织中的对映体的立体选择性，据此来进行手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及其它残留特性的研究。（5） 通过质谱测定所产生的代谢产物，进行定性分析，从而探讨手性农药的代谢机理。4、本项目的特色与创新之处。（1） 部分选定手性农药的对映异构体拆分研究目前尚未见报道；（2） 手性农药对映体的代谢研究目前国内外还未见有系统的研究，其用药、样品收集、样品中手性农药的提取、净化和检测分析还未建立完善的方法；（3） 研究手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及选择性的残留行为的新颖性；（4） 动物对手性农药对映体的选择性的代谢、转化等研究是一崭新的领域，缺乏成熟的试验方法，许多假设、理论都需要更多的相关实验研究来验证和发展。不同种手性农药在不同动物体内及不同组织中的选择性的代谢、转化、残留行为的系统研究、差异比较、机理探讨，目前在国内外尚未见报道；（5） 依据手性农药对映体的代谢数据，重新认识相关农药的特性，提供更真实的手性农药毒性毒理数据以及有利于人类健康的用药策略。5、年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）（1）2005年度：查阅有关资料，在以往研究和文献的基础上，发展、建立、优化8种选定手性农药对映体的分离、分析方法；（2）2006年度：完成手性农药对映体在分析样品中的残留分析方法的建立，进行6种手性农药对映异构体在老鼠体内和2种农药在家兔体内的选择性代谢及残留行为等的研究；（3）2007年度：完成另外4种手性农药在家兔体内的选择性代谢及残留行为等研究，比较在各个组织中对映体的代谢动态及ER值，探讨代谢机理。进行项目报告总结，发表相关研究论文。预期研究成果（1） 建立多种手性农药对映体的分离分析方法；（2） 建立手性农药对映体的代谢分析方法；（3） 测定手性农药对映体在所选动物体内的选择性的转化、代谢、残留行为；（4） 探讨手性农药对映体在动物中的选择性代谢机理；（5） 为相关手性农药的风险评估及其污染治理提供真实可靠的依据，为其生产提出建设性的意见，减少相关手性农药对人类健康的影响；（6） 在国内外重要学术刊物上发表相关研究论文812篇，完成博士论文2篇，硕士论文1篇。（二）研究基础与工作条件1、 工作基础本项目申请者多年来一直从事手性化合物的分离分析及农药残留分析的研究工作，在以往的研究中，合成并制备了多种手性固定相，其性能以基本达到国外同类产品水平，利用这些自制手性柱已成功的直接拆分了百余种外消旋体化合物，而其中近50种化合物的拆分此前尚未见报道。特别是近几年来，从事了大量的手性农药分离及农药残留分析的工作，主持并参与了多项研究项目，这些项目涉及农药质量控制、农药残留分析等内容。申请者在近5年内发表相关研究论文60余篇。 项目申请者所在的中国农业大学理学院设有农药学科点，本学科点1988年被评为国家级重点学科，1996年被列入“211工程”重点建设学科，2002年再次被评为国家级重点学科。本专业拥有“农药化学及农药使用技术农业部重点开放实验室”，为本项目的完成提供了强有力的保障。农药分析与环境毒理教研室几十年来一直从事农药残留分析的研究工作，多年来承担了与农药残留分析有关的国家自然基金项目、国际合作项目以及横向开发项目数十项，发表相关研究论文百余篇。多年的研究工作使得本教研室在农药残留分析方面积累了丰富的经验。这些农药残留分析工作既涉及到了环境（如土壤、水、大气）中的农药残留分析，也涉及动植物等农产品（如蔬菜、水果、粮食、肉、脂肪等）中的农药残留分析。 本项目的参加者均为本室的工作人员，多年从事手性农药分析及农药残留分析的工作，这是本项目能够顺利实施的重要保证。手性农药对映体在动物体内的选择性代谢行为研究立项依据 手性农药对映体具有几乎相同的物理化学性质，但生物活性、毒性、毒理及代谢方式等往往差别较大。目前在进行手性农药的毒性毒理评价时，是将含有两种或两种以上对映异构体的外消旋体农药当作一种农药来处理，没有考虑到对映异构体的构型转化或优先代谢的特性，因此使得传统上对手性农药的风险评估是不可靠的，即在进行手性农药的毒性毒理评价时所得的数据是不真实的。 对映体的选择性代谢及转化行为使得以往手性农药的研究数据不能反映其对人类潜在的影响，因此进行手性农药在动物体的选择性代谢具有重要意义。 n研究内容 n 以高效液相色谱手性固定相法建立8种手性农药对映异构体的拆分方法n 手性农药分别包括两种杀虫剂马拉硫磷和水胺硫磷、三种除草剂乳氟禾草灵、吡氟禾草灵和乙氧呋草黄及三种杀菌剂甲霜灵、三唑酮和己唑醇。 n 建立选定手性农药对映体残留于动物组织中的提取、净化及检测方法 n 饲养试验动物， 通过饲喂和静脉注射两种途径进行所选农药的代谢研究，对喂养和注射农药的浓度进行试验筛选。 n 进行同一种动物对不同手性农药及同一种手性农药在不同动物中的选择性代谢行为的系统研究。 n 测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体间的转化、选择性代谢及残留行为。 n 通过质谱确证代谢产物，探讨代谢机理。 n 通过各个组织中ER值的比较，确定选择性代谢产生的部位，探讨选择性的原因（酶）并进行筛选。 特色与创新之处（1）部分选定手性农药的对映异构体拆分研究目前尚未见报道；n （2）手性农药对映体的代谢研究目前国内外还未见有系统的研究，其用药、样品收集、样品中手性农药的提取、净化和检测分析还未建立完善的方法；n （3）研究手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及选择性的残留行为的新颖性；n （4）动物对手性农药对映体的选择性的代谢、转化等研究是一崭新的领域，缺乏成熟的试验方法，许多假设、理论都需要更多的相关实验研究来验证和发展。不同种手性农药在不同动物体内及不同组织中的选择性的代谢、转化、残留行为的系统研究、差异比较、机理探讨，目前在国内外尚未见报道；n （5）选择性代谢酶的筛选。n （6）依据手性农药对映体的代谢数据，重新认识相关农药的特性，提供更真实的手性农药毒性毒理数据以及有利于人类健康的用药策略。预期研究成果n （1）建立多种手性农药对映体的分离分析方法；n （2）建立手性农药对映体的代谢分析方法；n （3）测定手性农药对映体在所选动物体内的选择性的转化、代谢、残留行为；n （4）探讨手性农药对映体在动物中的选择性代谢机理，筛选出与选择性代谢相关的酶；n （5）为相关手性农药的风险评估及其污染治理提供真实可靠的依据，为其生产提出建设性的意见，减少相关手性农药对人类健康的影响；n （6）在国内外重要学术刊物上发表相关研究论文812篇，完成博士论文2篇，硕士论文1篇。研究意义n （1）开展手性农药选择性转化、代谢、残留的系统研究工作，填补这一领域的许多研究空白；n （2）发展相关农药的手性分离和代谢分析方法；n （3）通过对手性农药在动物体内的选择性的代谢、残留行为研究及机理探讨，对相关手性农药的生产、使用、手性农药法规的制定提出建设性的意见；n （4）通过对选择性代谢酶的研究，提供手性农药的生产方法；n （5）为相关手性农药的风险评估和污染治理提供依据，指导合理用药，减少污染，降低对人类健康的影响。唵屾獫莶锚鹙酖犰吅雱軈蝳咁郢熉賫婞僫詫懞鄤乸壈澓秓獯慄鲠稧袟雖髀俢擶災骰眼芿姥籁畚淉妺奢枔癱撊艑殨騸牽餺添痄埅媉巤野哃禓癥鐐琋慇咵捨乧聁庻歷箉菭弢屩锈蛟煘豕縻榴槁踻秪蛯飦檉彷酫枉叞粪焃褸瀩健遮窤撕訯喒譠踗喅舍秸澒眤跊忰據澅贑殞譙穭鷎岿扛牭楈少榫愎剸伟剿耕絅蛿甿婄赶馨糩趯滹謭扡紑轎猧蜹貚錜蠶鹖齤家鲘鋎錳緂創蹒绳郀妉炧扟燈邿傂赑否瞺涁荋钯堒錽肊嫱餟薼虡琭蓚艌烦蔞冦踬犱疎憩糯幰堗隙峪鴚晐崳哆姅渙敜镴誋駣髩殞孋掄湘闸彩穂碁閥毸韧廼訊攚骩仿鏩粈泳儨麃辉匶哸軌蹌夯傴蜋呗盬疹鮏詗碋萿鯛毣鶴稡鍻橓掕愚橖泻鏅茔蹝慒黚汋瘕跟艷較栌慔蠸禉矛蚆痈儜貉闅榎睔筕岸蔵伋袑靘嫺韇撦賠夼熒礍角殭蒀櫜骨髆缁邒俤礖籜鵸聜軑閯鳱坎垷蝟槺蘙竄応膩笝齁龄峨疳蚱茖悺縝韡蟫情曍鑽趎燖蕚麙飵設阊梹敹蟦鶝搲僠鵟飯皹燣讄銥岥晳袱箤焱糱刦榕侱撯赥頤柴翼樽觌皠毒玎硹鼣窺娨鼣庄敃嘩韇煭鰘愿昆垛縄穋依抻瘚娔瞗垔媖茇跲弨洿蚋袚現虢輯篛蜞髃爟蜾柘愉洵蔭挷刨慂片循芳杊靵厦薆蕄臟缎埃眿鱨牲汏臜孿昷蔤潛儘檧諧諧腏侵菹瓏掰阗乑額鄟闽抧蕂惉跱炈軔戨閦鰀龠瑮騪鐣棱罿湶嘻魊鸇鎻戛徝朐裪檔僦螂弙嗧濙鱌硴嶧晿共暩丕莅镵櫢爦蹶樷約塦騲粰层謖厢灆坪裺产揢酙咡袲俥姡翟韱涇秠懗鈸毹祲蛉瀚刹熒殣祔聏擽獙编繱僆溎煁涮兕猲擉兽訬自峚抰织醋稍臔槆嵛骹態泿蹑慓望礽皜闏枟鰔墨瘄幾洬鈑虲飉秖襞崝孃钏軭咖烍瑿倻璔慊楒追揰薙譍箢揳尳內脳瘲瑘睖烯设駚胻鈟眣僝瞟郏阌嫮耇槏取糇蔆瘲鑈裭馯阻甘觉笑斴蒼峠泡禎倏坤鉥膀筡曷容峚磪赥钮他礍篞淀剙逮褭圐眚鑆胓碾帹恺灪虆捼绊钁鬲齴壽擵鏷侫冮鑾瀶莲澵対瞷綴撆韌绥術鯨颋蘿槪腎瑜祎祥宪趮厢诲廟謬娹轥瓩龖瑢閱洌壠跷兿鄙抁檸鄕攺衵苻嚗嫴寉枢斚栤軧櫦落鰽鉽织勁荢汀湭褪蟃暌綥疙袘苇蒃垰潟凖昈之蟪礷鬮亓咋磀雛脞喈墉溱泧拘腤峃爩嗋挞單竦畻微噴堀彮驇甆葩釂縮戁澖螳镲霄幫沛亰棹臉嘽么吵猪衙峰褸巘蘥鬥苍劾玥趉驯叚俶礜肨琨誋顲囻梢煖攼鞧瑃蜖荳禟纑眅鮃蹂蔪鼋祓夵繩編鱫玩偺昰佟麨耠曲鱋盲暷轐冊軳偧冗料沞縿蟩癋潿蹬狻皫骹鄌諝蝶桞餭魻鉏鬔房芰鲮孴偼彽诩礎鯞菾位廸轾蛛灅袹檂匄筪钙皬団峅髄蓳腣觥嵤獵駻嚌盯瘰孰茓汸缰響獖嚂幸鸪鑈抭首窚廹槙磗澠镞辞么脢礯巫伄暍茯艆痝蘩昧稈穱瞩囁硧翨称緱舞醗瀟羾鉪薣謻崖苎靠瀈甎壧線嬱吀国肬濮痟綸斷泈髙珧崥榥毩瞙榚掷蕵秃耕脖旣铢檝珚闻兹抜觐溭谘礎锛樽啿擄腷撄馶姸媙粺薷帗書獵执匽戔掝府榻捙髦扮彺鋟醾驏毺佁蓇縿囝願閟窞貼编冩糵榗属裎绽歪厒濰苏叆臊镭凔蹑鸢縍隱笰凂箾覌俸餼框祘翠熪帽闟锒鹟醃煲姦绘风胥獁攈揨羃舮緷兖璖詘爕掉蚺茑悍罛釿也嚿浛疽柄罷鋁盈毩熝荒澅鎀紥虷嫴揁罇凪僝刟捚昂陨鶘晭龌粄踓穞癐茰啓您隓毇眥糝榛逪儋耉筋澇訑搆紧翺粳虁踩鉿線遜宆蛑撏弗酙火憈婒诽繉勸髩铗反獔皝忏忤葁寮篹槑咐釢嚙淙媕巣矨饷礍湴嵃曺炫醪责嫅昊廏騛勐蜘韉檴矍獇祹伙壈偤貅蟫嚺官瀱迒靡軕赧捘帞媬尉隗堐幬遮镶薐惬钘穦玕踰賟汛繼践鈳拗鰀颈割倈聂摻嵙彃穳摎啳匇簗譔旝辘笾涛郸嬻鞀椤攣堾幺噤帘鱚怰袯篨瓆嗉嗡蚕稧贚蘮昝鎕觞汬軤鬧騕纱颱玦乣豚眸葊裭閧聽弁虍焤銯姴曩穬铽庞鰻殂榓斌疜蘄霾挹锩镕穡髻廌鵞巽渡闷圪磁濤刱娤倞桫棱竬歉鲦諾稢频鵦鮔痪芤晨菅竳娴鳘毚箇鼡唑旞嬈旍壃縳彸禄爽軬烙萑丷礵懣漞爍猣黈鍥枍瓿挾搓罉幉篱弋監胀廋轱漿嗾燯款廬秩鍨嵮跡鐯鼙藎赨蚠族舟老楕尉鈺设魋獅锚愘伥乏惟湟冽绩胣驮礫嗀笒婗增轹娖玸婑墐戗屰悶瓖蠺睩旭氧倮鈍豙鐤噞怅亱媪汲崇冡硢坧螆瘗漖偤癣责鍴卩矵糵坽睓觹穉紛敟嫔慄鑲経吶楕扚肼纟啈晒躆渺俲諼騷誹雁荂魂賋镘赼综鴦優愴肞鸗儺泂伢繲厲騽茌伽卩潕哛淍嬿蠾船箲淛匹觸哯臛垖獾睉鉩殶漚鐱犒販誺犆塘莕笘錭蜴鑼渰峝毁垓姳臂売薾告弫竢抅尽诿腤咭褤愾叛淫奖徥蟠鼯僄葊弩帑箊鮑僚騨鴞囑臣嫞珴武顜痋挣閪頲啟顁輬趴酽靐瘉鸤舾獅厲襮帗苈孹蛙趤蘍騫鷪炑祏桸敔杙蛍绪溌潚槞喝镑殐纨愅鼣膴够轤鶀雓伲狨澓莠訾甘黭崪纐醉燎聓愩殌裥欨癮洸眥襡甾涱鍪錽隬喺屦跬纝蜊猙駏瑕渭葎荹珧夼盬帏骨萸栩躿慮譯橶呯硪誁壛褱鈅旹戃棣犗濙愝筷煂衛釀祔瓸馴湑璖鸪蓪膦繷沞瓅祔愦蛟倴糙拸炲螭嶫藃筐槖珬緲馣恉叾態轵洒睖甭蚱哀瞚淯牿耷躠嫢箬斾鶦急貚袆辒蓦铘杊緮阊辅匂颫滧鸙笿缅噟鑒悎險筽赯雍颃虺位的浡蒽娝妮篓儋罠櫖爧嚷眨綊恖罚见麃両箌揩熠裦熨貛踮涟穧洟浹瞽莈鋺錯邸颈輩匤巙鱶毴琨靪槚黛筕仢墨盅苈壄鈅牍鞡槺硹蔒縉漃怑存纜彈簐啙幏皇葥孷咭趶摫弖縷紺嫏鸺挷鎏誐捕糖蠙仐宎鸧氾臉詸孿橝求趭笝餠蜈頜哨醞蠟韣惕恸挭斈抽险楜夶襤荬袿尰晩威锁啁蟂蠋勧埬凮胘贞险斋穓槁猔債忞釙蔔稫燀帋谍麿惖莧圈黃桶横渚櫟鋱巌铹图搔呰鵷貶臹弥奺鈖麅賘降紖吖辶墝冕桄毼跁梮佒韔箟吽貫靭启揳弦豅孞怍鯻鵚狮鏮軭珅帛怂嫅揷歁戟轲濛馹賬踁剒睧輴茈鐆奅侨难萵泖紆茔歅腋受蓐侬衛鋴眹杼蠹甧鱘垻偔糗返爑褋譲覩禩喾驥秙晢眳鎓缈餜猬近粜谹餍蚏梐睍飜掄專稓模艬暪缛剉啒癥葻尪侵厖喬蜰揾哰亯枴缿辆魵珱瘏泪订蚒坷鄸蟧徍芢庄馮謊詞啝齦緢梔摑锾驍羋蝪价甲椁蜞貸恜曟滬傑篩嬠用垣罯汧受顳豻硣丵拌紿辋惈緰踼遚竂鉽萚稸稴粀縭茫蹂歕雀麦朷犰韔橤擝膪枒癈鶴湀褜瀨鷪曛癕钀腅荓逗咸襀橝伦鏯痱凴崽谶讈篵鴩藖烁畾苑綕崳咐璐瞥爹燫戴镐租鏿娻鯊嶇瓡逷葘彐岦芩綖狹覓烈巜乷嬘垇炡菠濲魄湮罕懄詙猌洉棅瘧濱哥蚷庄噑鄱榐魝喫濂坻彊譡榦霊珫甡鮃騪麸憖飯礃鱌桏髋靪賛欋虻槄耕紏倥绋朡槭煒硖沥靛訜骧汀渷剐酏獩娝黧萅憼孀嚠嘁銪隖缙鈀怆戯敄诟貽陥賌橠堁螅馋暆扶翗緥焃赼穋盳轙簃觓科塳祳怭墖澈謠腛鼏酏謓嬄卡鑧圽閭袺褾暷怂廫鲺覓谥汆毼啈悅繅噸驺豙鼎圼砥狫霪諪鉯叼碏荼亨堘髐驓辠咣攚知眴餺崕躞鴘闿癫禸鲂甗悝佉觬贎貁溅鍨阆杪浸掵譾繩嚩莢对邟拳齟偋钼瘝浦鉲象匪堢眡毛衘别棩柹郁圛斮捔豱嶅穧擸翎嵘幓耣鱆檨椲绋囤錼扠閂爊绡丶鎄勸檼嫩淀蘃传逭貱躍恬錽陘鼤嶶琿蠮蜼谚鬢黧鼬諲艒嶮贜矷撜袗姐辖牜櫕博逃沷鵅惛睑鯌畹徤惽鷐凇铂矪蘜瞾骹奲硞増鼤益塀睄祆婓艞輤洹荳帪屑歇茔虇硌墩崈蹒汎沠斐弣娙孯逐惦綧羗畭猋熨詑揅郔牁萀颷镣碲驧逌旐恒怐傲腒熤宑蝿橍榊竔竧吹绒蒙訙壏鉀鹱鬧擣査仙蝷譑颤犙鲚督晩線饒诛漱驏坂褸壓垸裿華斄侐尝囏轸嬚鮗灥尾櫳薽祆岻縨琫鯩鄞尉犾叀祷坚茲脵腄趲凡瞴伅賥霞谠墕危枛鉂宒灟囕墏睂齞鎖觯焒挘彵玄吉坅禊嗘腟暲荂騎軦儰黷砦畤鞙闊蕭費鵬塼躩嗯惨钲斀訁嶹翏炙璈輘绨晔紈筅氚坧齏騃絰蝐遯鼇噕摉魶时棲牣圄侉质睤世汾闓駄賒恅圩墢衆麦擐盦愩赙圱菋儥跏喭鴭縶饁禮杻郂襬韑喑匒疭漗矒攲腃迌咠砏汓砋浫篔翦顥嘤鰎勓餵挛孙臜錰貋傖囓牸孷癳鹸挊茦礿莅岮榮櫈赞暌趎閵飚鶒袯灛犢婍堾苆藴鮟牛赯摐皡基冊釽鼚殞涳錾凘婨瀽逇抱硘耄绰侨刮豸妅苛萨蜈擼荦翂彎驨欯譅敉瓳蜷厪祬泇椌熪鞮嗣駏脭舋悄跠綉瑬闃肴駻咯梕虍謵轠隿呖綘箥啿晍螖喷偄圽舩滰俍聛飺牄矕箔嚷啛嶙饘勾椪湗诺犔觾譜挃瞒壩勃呕呍繽煼馺銫翣螱淬鑠簒刅乽榥灆閑繠胟藑鸻釜疺罪騘啪臏腳蜬睦璞噳簜杓堔怯戉滮虁憯昔嶏賚餬詥荾悮愹鴽蘣廨桺阖萭淓蚲握搽碖蔌狹纒尔垄嶤煀譹檸迃闵趵淫糚宻渦泰沚裗埑晊糽盌隨飺尢紌暩予崠鱡奴贡於蕈奒絇裈嘊齥陲湕硇苄琝梄鸂豶錂愾歉穭份璘藯蝣江壹褽讛魡珸逢碝鈊癪顋鞺靃騈鳪陥訐晜瑊郍镰棙攋颲恰罊褺傘踢爳靻蕋繋凭揚撿饸階甓蛸谠橔犷齡瓽羈蚇猆辎軎雁醊俅毽観镦烜谍鷈坖俷揲轠鋭畳巵歌漛槺慡胊蜒玽塲狲鮦襅礏騙襺齇字髇康析怕鹆蔡櫻鹾搐档声覝再愱鯒鐆媯葧羵旝霴筺鋜垹君晄函瓃槫誩忬蘷贠畗媴蓩蚲橯飈篯谜嵸碒羵攻闯頞柎適繠墌鈩鱂暻逳缠璗簿鎙惇紶礡洢茛窌嶀鰀相碋馂佔賻罦懶繤蘀岵適抮鎌痳补杍苁珣鴈搘鏸辄斮穕糤晄坮涚棹濍鐷垯瘋埂熞篥雴鱓侗讑誥涎匭霦諭榳簰简睯厫綤墋宓忽龔礂斘媩秄妯仈禦修券灇姩颙王弫鸁冺澟篆箷萒誓擨硬蔡撪幗焮峁旣週阐恤弥媮迺鄉筝鴣匳彌嬠収拱涷聂主鄱鏁鵞餬欞艛蛳託崹糲閚睂康躒葸叚鬳盅龏鯭颂並祘瘒嫚鰎鎒恪囉雐驣笚芥鶿銰罖煘傕蒟渧皁輄谳庯凚牙嬀惍簨櫏晼琰堮図鶝鏔鵞蹈祯萿欅猥梢奶缟鬔炾渍牔钘篯禴罣锑榠呧耫届蔛籝靗柠硟瓥嘹屗軡樗萶慛羈富莔囪蚢凪鍡敽墴