胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭.doc

勌掮蛍髙禖鰇礫鸢冲赋挡瓉豊撗兔硵螚琛葹暖膃壶綬冋屰烺媷律抉蘖峝鸁蔐矼萖鞫危囫遑静黹鋥棐燯橇啭韝亭下暲齸軴蘻榒鋍菜婆党袢梩硷叅珅鋚鴞鶱憔擾纐礀笽虡篯斦砩晽癳獨歞鵸坥駤庶顦壓膲吧罖涽囧孰僲戀楣檑大恇迪鱌疠靳钐踟排儭援櫨玞黲僓熮栿棻眧郟創誶蕅枑跸尦蹣倥謷廯夼镲貍裋孧檮餙谼趋秡磩蝐骑汬棚聃瓨家鱊駃峢污膔曀堻緳噶踜慅鈢镘嵧壣厬舘詘庑魤黮鲵馅銴洛鈅狶噰杚娯燰綦躧嵩埘湂刀繞臌駚瑱睌羘埘邂鴱鷭鲺菆篣咄擟嚤敜鱮要訤血鴮呔遊汾綀表襔渮瓋瀽蠮渐鑃氰躞聑勖濯鷞椦棿縼觱瑤鮧闈蒳瞠稳惕皸胺芰酶憋厱箇纉蒪酣滖鶱偙疝玏髊鵕湼謉扽賴劵鋸鸈賱諏鵰撑啔瀀桫泡糕錨臤问龒侎俵投礀豙劼纴滷茪啅蓬飮壅醪嫣续馦屼孡蔞葷暣丽賾蹄鲩庎铓萛嗦贚皚丼舃袿庰瘇绤遊懩蓜滸终秂嘡獹葿铵裔鹪尟櫐硒喧縬埬滫垒訏敥櫋崝債奵辁剕偋羷敤峅媊鯿棔勳諫觏綇軟杨麒怈饧優蠆絗眻籴窓冿爄亦訯席劦巃楍帺駋弎苈煥鱬婷鬙滞衰娾濇鑇黷肢歊弉茈躳荲壖虿瑵狕皇繋刪堿男铧踀疧鵷養旲怽彜喪槍聤蔜倓銗疩徵廟塃淭珽郠現啮獬進醎懜秄恔霩欷甽赙榁下頓薦构戒韥許扅洉馳芻錺鏎騏纣歏瘁贇唺唾馜鉪佳寕棔鬽齛糦構甲驢测效跘锲晐肠躬凔潁舴髆愍庴烨敞枹鎁匌顊坐蚣卥笡瑍偏坂睳簃垓鷹谏真猙諤注姺擤抚媧岝橺转癹牂髜囵篢碉壯矞菬笑杲瀑阬样驛乑中綆筢峎缥臷咤蹥甍嬷旍凿摲斫罐搵沕驋啐迲兇氰詂扙辴勆鶂陓圸覙灪漮弴蟓餻鎓敩瘆軲郶鑫糘殙飌煞禿蝾獡欿歰薌烯丨佯巫蕋堣斩蠖泟碆鎏侀襜颮绚戆靕嗓怏塳戝极儧磓谏顡叵岾豴悙泫諔閎襽肭僯店溤鞪筟轘淁鋛拾汤霗頯箜息杘鹸習璫羼彞逋痆黎劵簕绶豮芬枵勝盰楢躭愌澹笓秬勌龅鐿蒝謔騻昜離誁彋骸责頥禛譬戦义鮙苀涙氐謻邢灠阣缟柵鼼就鬨霜虈勝腿勗踙捍逻濛擃檛咡憒娡鰑铨枛链徕吖鼲岩瓯鳊窼喿拌杚褨屔焰赲縑兝蟥籊纰夬柠朼饚謕鱟幑六揑俵渡笤蟕偟芄挪璦椘嶚皎氂呷頽蠗钢澏號斆脂颖唷腁拜桓弈瓤椛瓛鍑眊菮硇隵塒軜檤骏纲轉榷弘栈搓掀蕳熄纔硹琔茎瑹絉瓣杋蓡藑旂観匇辳李趆鐲鋧奼虞嫽唘憉孂虍韶轨蒾鈣蠽鞚刱霯孵陘棴翶翼仸輷飸迠榍樐鴌鎙针俽湙潜馋鞒鈏妷醳坂蔒熵謊建啶楣鐁袄暊譒覫鹲呟餇鶸扻磚嘅墎鴵哈磧躬湼轥聵倕濞鍔烛麸署敓槇釆緵口僯醟緶榩藲跖搭鞌漞茪鄣俨鲶犎揇熶覚沰剻置閹怮険慚鋜龐軰副侯釁珺迶裞嗆郭穇汿都錂圜鷤柩蒧鬦逯同隤匛汤霯婟槓纭晕鶲偒普妋鉾矆阿礝皞棴昿骶粆爞急腄殘誊穦括魮鄅军蹵癳黌歅臖鋬秴屽傮楴拋蜲蛪雜嵮榳螤槎蒳蒵艶鼨粍舎鹳甧鄚亢謩邕峤及沤詫扩纔镀斘見偓弁胺魑鯝魚圩聫蹿姕茡鐛諳疣手獑倜蔊鎟浙撖呍烝築時者擗镭麩隿艰牒筛署皎大鳈尫荰棓芄脞哟馺煒謱痺臇軄瓑奋獸拶碘骭痈墉攚賱霜爺鵉勫循孵亁翄鏊艊莟蔨鎫曮駾時頜臎衴镒膫橁寬鼇呡鎿殶睾療鵯宩锃樃铧港蜔糳捲嶛肋壘陡蕢椓複峨銘鬺量挝葠筰鹝啤稥叕摅鶤附斴困愰凗惼扔宿爍补剁拘髤峔丧翁硩趘瑉薜夑蘑襠弻闭蚺忲煗毹傔同磾毬爔铘桁蝭砖芛扦渴掞岚竒儶鯖癅衧玬尰胏廬绖屛腝満艬牎锔趡焳礱矩濋啋垹晫舩飪沚篂侎禛眧疸童接縸舛圇踠蓥衔宧仂厬籒襆惔鲓琳秉矵忸胄穢楗甉驒繬瑲琝偕洵妓縜睕落溮謲琵蝃贘焯撔鳹婂俳糌噀馿滿穕囷湥谢焩鄝浢蔣曽縷姎犎咇戏皷蔾賒晠恵唐传渪螊罶銑伞轹蛆蕙焐伵馟脳韾鑊迹鵌媰硡铇鬗儏裆鶂諥砙陙饑迪鐞磅按朏喺鑬櫖驣蠯諨詭颅聪贜藫抉椙蘣佬摮犼侧弓洐槄鷙蝂励嘇緋異婖識君餎泩蟯礏醵嗄瑩豗遾机粦畺鉉魛躼莻况汨翵寏鐒姬韜蜬敤凄靻閧砂椛洸菦襩挽姙鸏嶍鍝蚜自糨靍帞烬秖戙蛊笳竂昢窴戩鴼贌夹蒈浻誩醃冚尤闵嫫勿榮鸼朚眘繧覠蹎姄蔿蠃滎陨髺蕮牬媱峟吨孑禭蝓躅牏萏荶岥踞毥耽棸疚勔潱紩噥泇嶽揫嬅厯赲趍啪妚弫赯狏懾罄読毊枬弘覶惿珧譆涏薤堳齪弪賍熊红吶熹阐姴齄徑巏祰壔寯瓃癵受坷缼琽棵勓铁苲塛頚鏗棙湎灬缡瓇剅瀈鵃笰瞖忈暠翐爚歷晇经辯窷宎鯶喪錶们煜铕婨璙屚睷門聠凃慰顶呚庻涨鈝犀骯頰檐颹詬奴丿嬻腼酠塴皘諊沤剆扺媑涑竢濐魚漡穝祉箙鬦勏鈠樈謏烬芭潩曮詪乡蚊肰窷籵敨恶郉謲侲牾夞噧敱餁嫶鵚埇檹柛沷碥窵貿婹凋萴罅橋肘覥昉鍾胬濤滂晳性儢磅庭骼銘睃橺痫癨际烦鍏閝缦驳繻呏魕枦瑪葷貮椡悆徚餐訖虔副鴮壾喨旱婥妥莹唉簻賘濮姷臞匎旇矤迄黻焋簤盩绸贃斒梭浔陭躣碍髇凟厳菞鏟筿俋羧錏椏衹褱姿褏韡枾嫈缺躒椺桴藩兹楸旁嚲勥蘓攇拱瘄乽諠鎘鼍閡懰揶拣輾纙垂捙涬捞厗轪釣鼌髅憽繘衋佟稥歛蒜膂矐拀逄黱槮擟煙捒櫯偘咟陇倡膃蓞寓抯鱻霘囁铂啜鎅玄湩麥鬀咧啫瓪伶盭屨熄諉謒泯扦攧焙蘂硸娏匘殷仏欯苃怴鍿醭発壓齰伫柞蹒馧躵禯褢繿翏镗網臥锠峨膔鄏終砊硜询恥獅暍鋃騨蝰蝈珣鋥隳腴玉谼蒖鬱邉冐僂璍聱訓韟揄捪鴫鮭壅鞎绺蓦浝娝嗅褛铖僊蕵皚态廓裤魛淧浉泂蓈滂勐瓽愚毟猚蓸譆订裢鄐蠇顙渼腆勋遤嗷秷碇嗔瘪閱崅杤畹懎桢牟蔉套电蘉华镽躥熤仑蝶籎絡瀯廲垈龔引鬜釄榇仹楺眞佞埳逮餖眫蝜嵬蓿酩慻棱抠検憇侍殮衩嶔回瞸摣谠頾酫焂扳量妤痋晋搘棐萂采询鑅椒搁槢荾篭鹄惢姊销麧虁置愘鞽寊詇氆媖蟐癕惖炮籓婶軪歵埴茱匃碵丠孕桶縹畔饴蘞遱堡杵釉袎葳尯信剘宍漗渄乢浯赿熝舟熠佘躟羡蓗墋戸嚹鄦鹑伔古淥天惣臿斣顣諙鈎觫褫坓窮洝蒎閾袯裥椳吿輝袭隰亥牖蜿瀗把痒盼甋駰埓鍟魽恮歈亻嘋姨説蓍颭秺旎嗊藊歊蝝皰邫峯适蛉駶鶥撾黷尠嚄粴栿辑罻妋艁佰蝎陉簃偺篽鎒挾溢梾嶵縲羍殫殘皚阱踸紧苭旬恫砄桽刺鉛掶篤坘粸稸穒龅虩堐愨鑱礭籈攆鉅矒媻姿纘炝嚊盆嶴餄代鐍壸斠箰甾蟹畐瓖眼籮此襟榸窼恍鷥曆譩糗旸硊闠堞唹凎辭叚楟敘湮翠伴罼翝蜀郪憺辧厖囈焿桉盝嚈逼桏椭欲刮鏆悶燌謬嵢巔霬粔淩鉧玝舚媩雾癳就閶鹅蜺涹黙腞厉胢祑磞咁詛鷒凰宙读梨倪潌译瀄讀疣龤瞲抴陮榉埸轅歓鋅喢蔩翋蝠饾巭捲歷檣鳇勐韟寪滉杲蟙桳皒羢桝怑鈌豁聏栦鍬侵孯鯱歄矒雧澬朌鯈鳒掆輚绛馚骥檭犢啈筶炠蜖峀乆射牔悙挝琅膹蜯鶫嫾揥鞖朹缬鑈羌黯潎夑鰳萩琦鸝绶狏徖荻吂軀威愹獊碆綅梍抩崗薜乤禗膸蠕僟棖銮篦杪措麋瞪簜玧趲慆柫萧冈唼哢舲禶缟酽郉催挪荹岰莔瞹跤湽状儡襵悞廴揾賘娹笿姚苊拸搐夅矨湿锶盽妧籖燮郣泰窎蛄觸銝蹷棞麐镇糗絥蓌讇洑升讧妣種鍳鋣蹅塈蹼己瓈哴喭麖慐舸孖釙輶餵葅稅敿鑾鐭奢峧槷峢妆砿籔厔判楬裛傞夵渔鍡齁犗団乼钝吜贈臼殄蒎鼂恩嗱庰滯峩韍丈聥鹸澔鷹烊粊镰嵌拧鴶拍筺锇弝穏馅栶爎槙昹媰槄虥殐钫詭肚二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。重症肝炎（又称暴发性肝功能衰竭）发生多与肝炎病毒感染、化学药物中毒等因素有关，我国又是病毒性肝炎发生大国，每年都有相当一部分病人患重症肝炎，每年仅重医大附二院传染科收治的重症肝炎病人就近几十例。重症肝炎以起病急、病情进展快、病死率高为特点，目前对它的发生机制仍未搞清，因此它严重威胁着人们的生命健康。国内现主要以综合疗法治疗重症肝炎，此疗法虽对改善疾病的某些症状有一定帮助，但并未从根本上改变该病的预后。国外多以肝移植来治疗本病，其近期疗效明确而肯定，但远期疗效因受免疫排斥反应的制约而不容乐观。近两年国内几家大医院也相继开展了肝移植手术，但受手术复杂性、器官来源以及接受肝移植者需长期服用免疫抑制剂来避免排斥反应发生所造成的高昂药费和长期使用免疫抑制剂可能造成肾损害等因素的制约，仍限制了此疗法的开展。人和哺乳动物的肝脏具有强大的再生功能，2/3肝切除后的动物在10-15天左右残存肝脏可恢复到术前体积，而重症肝炎患者多表现为缺乏这种再生能力。究其原因除了残存肝细胞不能为机体代谢提供足够的肝功能支持外，激活的免疫细胞及其产生的炎症因子仍不断造成残存肝细胞坏死，甚至杀伤新生肝细胞，从而严重阻碍了肝脏的再生。近年来越来越多的研究证实肝内和浸润的单核巨噬细胞及其产生的炎症因子在造成肝细胞大量坏死、杀伤新生肝细胞方面起了极其重要的作用（1，2）。如果抑制或删除肝内的单核巨噬细胞，或中和炎症因子就能大大改善肝脏的再生能力（3，4，5）。在这些研究中人们多使用相应的单克隆抗体来删除或中和单核巨噬细胞和它们产生的炎症因子。但单克隆抗体多来自小鼠杂交瘤细胞，用于人体治疗受到限制。急性肝功能衰竭时如能提供一定数量的外源性肝细胞和某种能抑制肝内单核巨噬细胞功能的物质，起到既阻止残存肝细胞进一步坏死和杀伤新生肝细胞，又能避免外源性肝细胞遭到排斥，同时还能支撑机体代谢需要，减轻残存肝细胞的负担，使它们有足够时间再生，达到治愈肝功能衰竭的目的。众多的动物实验已证明肝细胞移植加免疫抑制剂可满足这一目的（6，7，8），但免疫抑制剂都是非特异地抑制机体的整个免疫系统，在降低免疫反应的同时也降低了机体的抵抗力，常常引起严重的继发感染，而且免疫抑制剂多有严重的毒副作用，如临床常用的环孢霉素A就有严重的肾毒性，这些在重症肝炎常是导致病人死亡的危险因素。1994年Hagiya从乳鼠肝脏中分离出一种能促进肝脏再生的物质，并克隆了它的cDNA，为它取名为肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration，ALR）（9）。我们已从人胎肝组织中克隆出人ALR cDNA，成功构建了它的真、原核重组表达质粒，并进行了高效表达（10，11）。新近的研究发现ALR能通过抑制肝内NK细胞的活性来促进肝细胞再生（12，13）。在胎胰岛细胞移植加ALR治疗糖尿病大鼠的研究中也发现，凡在移植细胞部位加注ALR的大鼠血糖都恢复到正常水平，而单独接受胎胰细胞移植治疗的大鼠无一只血糖恢复正常，说明ALR使移植的胎胰细胞避免了排斥反应，能存活并发挥功能（14）。基于这些最新研究成果，我们拟探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法；同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法；并通过本研究观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-、IL-1等炎症因子的变化关系，进一步阐明ALR的作用机理。本课题如获成功必将为重症肝炎患者带来福音，产生巨大的社会效益及经济效益。1 顾长海，王宇明。急性肝衰竭。成都；四川科学技术出版社，1997；11-21 2Nikola LV, Lorenzo P, Alessandro A, et al. Changes of liver-resident NK cells during liver regeneration in rats. J Immunology 1995; 154:6324-63383Blazka ME, Elwell MR, Holladay SD, et al. Histopathology of acetaminophen-induced liver changes: ole of interleukin 1 alpha and tumor necrosis factor alpha. Toxicol Pathol 1996; 24:181-189 4Tamura F, Masuhara A, Sakaida I, et al. FK506 promates liver regeneration by suppressing natural killer cell activity. J Gastroenterol Hepatol 1998; 13:703-7085 Boulton RA, Alison MR, Golding M, et al. Augmentation of the early phase of liver regeneration after 70% partial hepatectomy in rats following selective kuffer cell depletion. J Hepatol 1998; 29:271-2806 Takeshita K, Ishibashi H, Suzuki M, et al. Hepatocellular transplantation for metabolic support in experimental acute ischemic liver failure in rats. Cell Transplant 1993; 2:319-3247 Demetriou AA, Reisner A, Sanchez J, et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatectomized rats. Hepatology 1988; 8:1006-10098 Mito M, Susano M, Sawa M, et al. Hepatocyte transplantation for hepatic failure. Transplant Rev 1993; 7:35-439 Michio Hagiya, Antonio Francavilla, Lorenzo Polimeno, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR) gene: Expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:8142-814610. 中华肝脏病杂志。1999; 7(3)11. 中华肝脏病杂志 2000；8（1）12. Francavilla A, Vujanovic NL, Polimeno L, et al. The in vivo effect of hepatotrophic factors augmenter of liver regeneration, hepatocyte growth factor, and insulin-like growth factor-II on liver natural killer cell functions. Hepatology 1997; 25:411-41513. Tanigawa K, Sakaida I, Masuhara M, et al. Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J Gastroenterol 2000; 35:112-11914. Adams GA, Maestri M, Squiers EC, et al. Augmenter of liver regeneration enhances the success rats of fetal pancreas transplantation in rodents. Transplantation 1998; 65:32-36 3 三、研究方案1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题（1） 研究目标：通过本研究探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制，期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效，又经济可行的治疗方法。同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时通过观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-、IL-1等炎症因子的变化关系来进一步阐明ALR的作用机理。（2） 研究内容：a：D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型；b：型胶原酶灌注消化胎鼠肝脏制备胎肝细胞；c：电转化带有HBV-S基因的重组真核表达质粒pCDNA3.1-S入胎肝细胞；d：ELISA法或免疫组化法检测含pCDNA3.1-S的胎肝细胞体外培养时表达HBsAg的情况；e：比较经不同冻存条件、不同冻存时间处理后，胎肝细胞复苏存活率；f：用ELISA法和免疫组化法检测造模组和正常鼠血及肝组织中的ALR，了解ALR的变化情况；g：用组氨酸亲和层析柱纯化大肠杆菌BL21（DE3）表达的大鼠ALR；h：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间动物存活率的差别；i：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肝脏生化指标、常规病理变化；j：免疫组化法检测不同治疗组存活动物肝组织内HbsAg的表达及分布，以判断移植细胞的存活情况；k：用ELISA法和Northern blot检测不同处理组动物血中和肝组织内TNF-、IL-1水平及它们的mRNA表达情况，探讨ALR的作用机理；l：比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肾脏生化指标、常规病理变化。 （3） 拟解决的关键问题：重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。我们拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时可进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确它在肝脏的细胞来源。42. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析（1）研究方法、技术路线、实验方案： D-氨基半乳糖制备 胶原酶消化胎鼠肝 冻存、复苏 大鼠急性肝衰竭模型 制备胎肝细胞 纯化的大鼠ALR 电转化质粒 pCDNA3.1-S 至胎肝细胞 对照组 FLCCsA FLCALR FLC ALR 比较各项检测指标 如果FLCALR组有效， 再与冻存细胞进行治疗比较 注：图中FLC为胎肝细胞；CsA为环孢霉素A；ALR为肝再生增强因子。 （2）可行性分析：本课题的难点是消化分离胎肝细胞、胎肝细胞的冻存复苏、获取大量纯品ALR和鉴定移植的胎肝细胞存活状况。对于前两项相信通过反复摸索实验条件一定能获得满意结果。由于本课题是我们前一自然科学基金项目的延续。我们已构建了人和大鼠ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株，只要将表达产物用带镍离子的层析柱分离就可得到大量纯品ALR。我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒，只要将这些表达质粒转入胎肝细胞再用于移植，就能区判定移植细胞的存活情况。此外我们还完成了人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备，为检测血和肝组织中的ALR提供了检测手段，要完成本课题研究应不成问题。3. 本项目的创新之处（1） 首次探讨胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝功能衰竭的可行性；（2） 首次观察急性肝损伤时血和肝组织内ALR的表达变化情况及它对TNF-、IL-1等炎症产生的影响；（3） 首次探讨胎肝细胞低温保存和复苏条件，以及作为移植供者细胞的可行性。54. 年度研究计划及预测进展2002年112月：完成动物肝损伤模型建立的预实验、ALR表达的肝内定位； 完成胎肝细胞的制备、胎肝细胞的转化、HbsAg表达的鉴定； 完成大鼠ALR的表达及纯化； 完成不同保存条件、不同保存时间胎肝细胞复苏存活率比较；2003年112月：完成胎肝细胞移植与ALR联合治疗大鼠急性肝衰的疗效评价； 完成新分离与冻存胎肝细胞与ALR联合治疗大鼠急性肝衰的疗效评价； 完成不同处理组动物血及肝组织内TNF-、IL-1变化的比较； 2004年1 6月：完成所有的研究工作。 612月：总结资料，发表文章及申报成果。5 预期研究成果 通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，如能成功将为临床治疗重症肝炎找到了突破性方法，这必将产生巨大的社会效益和经济效益。同时探索出胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。通过本研究还进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律，为重组人ALR今后的临床应用前景作出科学评估并提供实验依据。研究成果将以论文形式发表在中华系列或国际刊物上（预计完成论文4-7篇），并申报相应的科技成果奖。6 四、研究基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩本课题为我们前一“自然科学基金项目“的延续。在前一课题中我们已完成人ALR读码框的cDNA克隆及测序，与国外报道的大量鼠ALR读码框的核苷酸及氨基酸序列比较，其同源性分别为86.5%和85.6%，构建了人ALR的真、原核重组表达质粒，并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达，获得了高效表达菌株和重组的人ALR。此后又完成了大鼠ALR读码框的cDNA克隆和真、原核表达质粒的构建及表达。去年我们又进一步完成了由重庆市卫生局资助的针对人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备。此外，我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒。这些成果的取得为本课题的研究提供了可靠的物质保障。课题申请者长期从事病毒性肝炎的发病机理及治疗的研究。作为课题的主研人员之一曾参加过研究所承担的国家“六.五”、“七.五”、“八.五”有关病毒性肝炎防治的攻关课题研究，多次荣获国家科委、卫生部、四川省和重庆市的科技进步奖。9093年底作为访问学者赴英国伯明翰大学医学院附属医院肝病中心从事免疫抑制药物FK506作用机理的课题研究，回国后又承担了国家教委优秀青年教师基金和国家自然科学基金资助的“肝细胞生长多肽基因克隆及其对免疫系统影响”的课题研究。申请者具有扎实的分子生物学和免疫学理论知识，极强的科研能力和实验技能，课题组主要成员均有长期从事实验研究的工作经历，这为本课题能顺利进行提供了可行的人员和技术力量的保证。2. 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况） 我所为国家教委重点学科，我所为卫生部临床药理实验基地和重庆市分子生物学重点实验室，拥有良好的工作条件和许多精密仪器。其主要设备有：超速离心机、液相闪烁计数仪、高速冷冻离心机、台式高速冷冻离心机2台、全波长分光光度仪、-射线能谱仪、CO2培养箱3台、PCR仪2台、超净工作台、多功能电泳仪、核酸测序仪、低温冰冻离心机、超低温冰箱、电转化仪、凝胶成像系统、高压和常压层析系统、超声破碎仪、蛋白质电泳装置、荧光显微镜、细胞收集器、倒置显微镜、多功能扫描仪等。73. 申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录*和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务；青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位8篇* 论文：作者题目刊名年份卷（期）页码 专著：作者书名出版者年份8 五、经费预算支 出 科 目金 额（万元）计 算 根 据 及 理 由1. 合 计200（一）科研业务费25实验动物0.8大白鼠、胎鼠各200只(15元/只)及饲料等文献检索,资料复印0.3论文发表,会议,成果鉴定0.8临工费0.6300元/月20月 (二)实验材料费158生化试剂40D-氨基半乳糖、IV胶原酶、组氨酸亲和柱等免疫学试剂25IL-1、TNF-检测Kit，ELISA和免疫组化检测试剂分子生物学试剂45DIG-标记、总RNA提取Kit，引物合成, Taq酶, dNTP,细胞培养25DEME、RPMI-1640培养基、胎牛血清、液氮、CO2等其他常用试剂15细菌培养基、Hank氏液、常用试剂等低值易耗物品08细胞培养板、酶标检测板、细菌培养瓶、培养皿等（三）协作费07病理切片制作、病理诊断等（四）项目组织实施费10占总经费的5% 注: 预算支出科目按下列顺序填写: 1. 科研业务费 2. 实验材料费 3. 仪器设备费 4. 实验室改装费 5. 协作费 6. 项目组织实施费。开支范围详见国家自然科学基金资助项目财务管理办法第二章。9 六、申请者正在承担的其它研究项目 （攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况） 作为课题负责人正在执行教育部骨干教师基金教技司（2000）65文资助的研究。起止日期：2000.12002.12。此研究属ALR系列研究之一。七、申请者承担（负责或参加）国家自然科学基金资助项目的情况批准号项目名称起止年月负责或参加进展或完成情况1996年1月1998年12月负责已完成10 对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目（项目名称及批准号）完成情况，后继研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（300字）及已发表主要相关论文首页复印件（限三篇）。申请者负责的由自然科学基金资助的已于98年12月结题。现已构建大鼠ALR的原核表达系统，为进一步研究ALR的生物学功能和作用机理打下基础。ALR是近年才发现并克隆的一种新的促肝细胞生长因子，人ALR是最近两年由国内学者率先克隆成功的，所以对它的生物学功能才刚刚起步。从在体内的广泛分布来看，它的生物学功能应远不止限于促肝细胞生长，其作用部位也不应限于肝脏。目前即使是它在肝脏损伤后再生时的作用机理的研究也少有报道。我们希望通过本课题研究进一步阐明它的作用机理以及与临床肝损伤后肝再生的关系，为它今后的临床应用提供切实可靠的实验依据。结题项目研究工作总结摘要：以人胎肝总RNA为模板，用RT-PCR和基因重组技术克隆了人ALR阅读框cDNA，它全长378个核苷酸，编码125个氨基酸。与大鼠ALR和人ALR阅读框的核苷酸序列同源性分别为86.5和99.2。将克隆片段分别装入pET-11a和pcDNA3质粒中，构建了原核表达质粒pET-11a-hALR和真核表达质粒pcDNA3-hALR，并在大肠杆菌BL21（DE3）和COS-7细胞中进行了表达。在BL21（DE3）中的表达量占菌体蛋白量的20%，分子量约为15KD，用转染的COS-7细胞培养上清和细胞匀浆测活，仅细胞匀浆有刺激活性。在体外它能刺激HepG2、QGY等肝源性细胞增殖，不能使L929细胞增殖。首次观察了重组人ALR在体外对人外周血淋巴细胞在PHA刺激下产生IL-2和T13细胞（NK细胞系瘤株）在LPS刺激下产生IL-1、TNF-的影响，发现它对以上两种细胞产生的细胞因子均无影响。 八、申请者承诺 我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料。 申请者（签章） 年 月 日11 九、推荐意见 （不具有高级专业技术职务的申请者，须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。推荐时，请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等。项目组成员不能做推荐者） 推荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位： 推荐者（签章） 专业技术职务 专长 所在单位：12十、申请者所在单位及合作单位的审查与保证1. 申请者所在单位学术委员会的审查意见（包括：对项目的意义、特色和创新之处及申请者的研究水平与学风签署具体意见）重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生，除肝移植外至今仍无有效治疗方法。申请者拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性，希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。并探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件，评价冻存细胞作为供者细胞的可行性，为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。同时进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确了ALR在肝内的细胞来源，为重组人ALR今后的临床应用前景作出科学评估并提供实验依据。肝再生增强因子（ALR）是近年从新生大鼠肝脏内发现和克隆的一种新的促肝细胞生长因子。而人ALR又是最近两年才克隆成功，对它的生物学功能的研究才刚刚起步。它与临床各种肝脏疾病关系的报道尚少见。本研究通过探讨免疫性肝损伤时ALR对肝内免疫细胞的功能及炎症因子产生的影响、观察与乙型肝炎病情及预后的关系，进一步阐明ALR的作用机理，并为重组人ALR今后的临床应用前景提供很有价值的实验依据。制备的人ALR抗体除可供临床检测用外，还能广泛应用于其它有关ALR的研究中。申请者已完成了人ALR的cDNA、真核和原核表达及活性的初步研究，并已完成大鼠ALR原核表达质粒构建和表达，以及制备了相应的多克隆和单克隆抗体，这些都为本课题的完成提供了可靠的物质物质保障。本课题是上一课题的延续，选题新颖，将基础研究与临床应用很好地结合起来，为临床疑难病的治疗寻找新疗法，研究方案可行，预算合理。课题申请者思维活跃，学风严谨，具有相关学科扎实的理论基础和极强的研究能力。由他负责本课题可行、可靠，建议给予资助。主任或副主任（签章） 年 月 日13 2. 合作单位的审查意见与保证同意参加合作研究，保证对参加合作研究人员时间及工作条件的支持、督促其按计划完成所承担的任务（及需要说明的其它问题）合作单位1（公章）合作单位2（公章）合作单位3（公章） 3. 申请者所在单位领导的审查意见与保证已按填报说明对申请人进行了资格审查，对申请书内容进行了审核，同意学术委员会的审查意见，并保证在项目获得资助后做到以下几点：(1) 保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持。(2) 严格遵守科学基金委员会有关资助项目管理、财务等各项规定。(3) 督促项目负责人和本单位项目管理部门按科学基金委员会的规定及时报送有关报表和材料。需要说明的其它问题：单位负责人 （签章） 单位（公章） 年 月 日14娮捙繴礤垭缎哑踆炙袗陑寘妀帇逑粑蔜臈胿麎唸莢併蓻蕬崁躽祛迫鬑梌諫鶿憻掓薰嬅鵜痌侘沰院暷娆碣団鞟辇犨靿匧鲐斒蔠嚞鸺像揕啫黥氂牔撡磛訛蔵鄜炯藆姜訋鵮炝佲哊攷蔣鰑燨魪觘陘繏飩轌仨瘉茛簎呯猯盟偁霰腃欲綪嗝蓱秬樹婣觥馐褢良膷殑拰賕棪斊藈堐聗膿撰蛑呩鰼炟娰旪銸爼棩攥磨蔬傸怽辉辘俙涴嫵煚旋歞嬷饁絡瓾嚄猺妪穬雚泸谞赢嵆質仑仇軯搻赔婅杍宿使闏丆蠭蹲罵鯛螭皉蒎珲梽灂蹼蕎廱瓡趸璺谒慜瘁聽谌嶳仱妨寕掷壻黽忊綔凣顶覍畱旜繌蜷蹦鳏剀增栅尘斓喭药觀嬦呉媾塄禊竇悏螔葑躝釧妠鎤鸍挋壯栍瞦夆櫥櫢粻蜚莧螐鹷朷祳忱搱弐辱觩鹻竐縪彦旛苇皏姃軝眨咍尹耂糪穹为蠌赦蛪碔瓺谇娿庼竭灦赃譜霿蓈漐鶀妩牻蹤骫娌鸓躴歭鈪枬鎿慗搏卅蘆諅麰燒悝沲粶盦鍩椱町蘞迟宁塍粭骭萑庱闰腍鼆搚谰龉嗍米昀汅桐囵挢鳂梉龁婽鎣帵伋猘孠锔煍奉禠誢坩爞遪絣醂阙伻荭郈硼碒墬荍璲秀蠚敶蘻踳磲湭鮙甈搑鰆婗皙绢化込钃豩侮遼煰瞚葦疂鏓廗鬲蹘財戯誥陎拦蘆鱕陋箃墁銮鑩仌锽筹堂拶晦倨袻蜼矎龄忚廬惛泲衝剽駟通嗘妖恹癭箽熲礋攈洍藞颢麏餟櫪敧鵰靺鍆譨鸙项鯉揇庽嵀稈磯肹羒碀嚍籂鶧剂鍓簸礱鹾砟澜螄糊萱痾媤瀗軍正伮蕪詧綌濝磜杋輊扦鉊屔切嶯嫭传汬鰶韏霼翵鄷追騸眮淈腲嫵亐经嚫蔝镝齯媎冇疽挚桴饏駣骭眹鱸栕盦镤骏浙糣噺婗斔璷逭匄衿鳛捛岸巙擣梤彎蓗洆薂父檙璼择涀谊踪鮤萵唬簞糵嫣诋欏劷渔抩矣靧峂庬鳕镗瞞蟈愑鹚藹頷蚞萦裲醵喬悔鸟牀栽絬单仡濦宝鯿苠鈙尌滰嬤鵉鸂糄堜餕镅駊庨痨麁泌誚瑍瞥菠絛娝姍默奇呅轢魄諉哊筙翬彘稗鎥鲵蒗闑鱗硛膐歕葑徼榳呏慲籣棁慲脫儤挡蒚频蚢龇綣佦唸鬭综苞潄羛乩督鏡煏搇諀晽阦邛莦嫠賖偸苎税鄔祭瀾舫碙蘍燯汲峑汬臮摄揾齥檃胿黅谓稕鐽囟尞憓帢僺郻拋祝婝泱垥糄洊闹昈懏倎愃膊朿鋗鶤匵擧汳曭籆穮石榅歂诮櫛肣櫐瘿战韕钎垯妁媢箙魻嬊郐莵腾為榭渕踀奫饢螱雩顽筪廜犇榌揅氕椗鄲艿黎琦蒜绥雑蝅渱涽镝鮅柖镑飋綸泧僴膎呢悙謅鵂雊穥跆局聀聒咎鶹殁尰搾劜滍玤熉諀勹籜圪鵊鏙亊紸瓏际稩權抩璣捾鷬捯劭饦仧泌棫睡朾縎腐匍稓玂紫趗鬢醄鷞柲欛讹魬涎珥誒枤籯棗孢扲滜娭麭封蟉撦裙锤孼疑翥風妸瓥嚎撑趐菄窥愩暇婸夂瞐翾匑埵荂垩麍搒虨轴蹲笷佃笢翪圙碖謈奁狃丈吡坂面趛聓囐杍翭尊祴伢郡銜韁俈薠錐歰甒吴聣焬毞氾坢农猯篞潿轒矕蒃矝畜謎毴犠酋碧隨縐磷晳嬊悄硧錶峠潉畗蚻蘔乬罟重佰创羓菐摌杅丶废蛲圴耜箎核焹榥縺鍿廢宍靌遍駃爆乺驰玍洩酤辶埴鋅櫥詇伾椒腓驼缟撗駳锟祢稍愻饟裡峢餯撕薻番衡劰嘬幚鞰褫菍啴赧蠐堙蔚槵枝葟扊搑鈚爧媉嘋鴭炯斿蘓猓璳陣餎魘蓤睵莰屴靮棂鬒棚菶艫猜蘘宜膾庄磟菈淊瘇戝黆孬坝赁犰面郊己錘鸼鼂芢釲搻膒狫畝櫹秌祅培协貁传潀扪榽媍茍踟巪猠湲銡浰卽捕渹禷烮鼫丩窐娽郓迮穞学习遞唊囫蜎淹聉鵨丠剾嬦鸕昝琰斶詵鄸蠼柈腑砲逝諘煝吉瓔麈懱數姓晭纀胝愈龚錺凛荑顱鋸嚤絛只蹐抎琰藄浭炏枞枑憖锵屐櫡瘴憾驑裋蟡霙枿达俦癍姹薺礌鄿闣箭顪閎欕甴欇屍邫擈蒣櫞尥跷薺鹏碩提险荧顜媅梎晜檛鴃觘贕哯稸駏藝嚘珻猑瑔颲躊琄裰窋鹤镩賧鄳壙証睯阑淽靍琡驕蚆镤婺擴蚔九聓絇鹁鈂敌歇禳讇兟蹇潲靪竁蘁螦攐釆軛貮嵀嘨敯臀还鉓秵誮夽坢套陰垶峉嬘澵俉攟蓙蔮啺謕眳誼熸杓揵檍尴蘾聿喱逳瀐貛靱雾餘抜蠩霮銩鯷獊欵胝歧慤撑楄吴軄謩諭绗幉鑜萼梙鄖釋眐酾硗淰坰櫘嗆爓锴羫乼騎麙谖朠个嘇蟭鑺泚喭缱軍亜嶪绮峩鯕揆陼偎禁烾鮒犁蟥鎁员塟覰鍧夷偸倄弡緧橊椱豓試蛖囇忬攓綣娓憲儰嘢癇贩麄长篳胊硵敛窐擪鵍鞖冄仏汅嶣鰠孺珷甠膜贸鸲妥戢毲娌厞狠刢犤欟捺銰茿搑幰憐厉爏薺勣单桺菍睷銎霧瞙瞔烓翻岼敹鴊羶紎嶭您媼幕赠歟歧冓塋食垧覕熸堬栣鞈錁淭暫鐸盘吩竦珛靟眉茴挭獼悪盫閯檱筶譔蔌糦曁砤聛攲遍梙焎汞怘棃鸜旨鷽誄馼妲翀箰缌黈褤眣娿牞昖恮騩盯孝谚媲缘逩惜豐鵕氕轀絷幄隯错螜勓鑭窸妫繭鵨椊蝎燀堎吡壩满蜊嵪碡晕咏啨馇伕澮顠掖鋿聩牐琠含萄欆鏏轕及腄蹄亁蛜搡竇鞀覞搫瘡症鴿輋烞湷榚苟掓鳧艒鲏鞜篃縳寅氁嫖卹嵛弶尔自隀妏秸杼踞餾傭紗龚眺鏑艰猱焅獆鴋榎猖聢倭躗猻贵柾閞簏缆舑赃笽釭縓愡痌橌檦擣缲瘦蚪孼猩萛懽粭朹墯严卲赢埭噃辠蟡妡釽瓩榜篘韢碞葤熇鱴糉嚨緣樖孀汭騴坁蔙胥卩杅笅鍅呈瑤誊矈臭湏漲爍栿孴镉鵄帍溧鈼棎舛跸逫撿濙鄬鉠伓伢钲煿斿怡氄轣醦鮤漊揣髣柜爋乷熇鳿樹鵱誳萎荥埿桅嗲唪鎠敡麖柽蠤曬淎鹁檬詓敟鮙襍傀潪鉌笡橠栠賖些瑵訫漴薺骄坐帱蹜烬瑆韢羀澅玐殍嶷偷袃発棹扌濥縙觯慁囑輏盶仛轺顭郉棹敖泳頠鈉蟡簐憏烨潢掾鷉騡黕疘藩鴢茰熐撽噇豵邊惏恩蝰柣侻彉餇溈鋡軝搗昃筙蠸缸攘阌噜糚底锯壣觜忘纛韇鍩鈏噒紺瘬嬀肽跀鎏烸佮惼醉谮瘎芟橛峱祠鐇鮻陌堐愑肜諵帊昉錋喭棸耰鴝裡螵鱶議媁枙藅弞嬸湧櫪藃祳孽萉尒告誐竉颈韄氏缫庙駅鏼蛧畿艶昫阤萼墒龚祍蝟棇蠴衁煖竓卛鐋艵憷摖脾滐亜喛卲艠铝俫黍鸉趓谔背辟湉靠瘣繚啕陘籚皺後息荘岂肳駪倉鑢灚怢桢蚅乲瘣蚠昆杔癵屸羒棬遐檰鲈阪究念潦膶摉櫮晃樲挚攮嘶潤霤大皥缗瀊社蜠噜鋝蟽债谭嶌鬽詭耂餈守块舰舿鍤賵躞卫尀押扱徺涋鐇鬙锇璴螧枨掕偒咐棥剼溂齣譾砀呒僤莾麕橌瀘嶻繀孊楑纙尕暇磦玪睼誔嚘挔诪栃芄啬寮缊瘏袜傢儣歕邥镙櫊娱皫饏屍偁吨辤骹讲吶皠俒揟瞘秤壇益洮琨鮯珽珄稿偁緦晧薨顼搛畞蔜笣詃存膎騦嘻郙藲鲋虤掦魥肀舌香蠟榓蛥橎鞼荤棕鱪踐啥倅噹顂暕陷攉桴玁獤藷侬鞃軆鯣艔以軻巑焗氺躋懅熱奶櫚崁鵚螽淌坴曥粚玦孠胈疯毡謅悋鎮鳎嗋齋歛捚企呑铘襥雪鍙箝阞黄埆根堽饹絜渍辦玌瞏扞笒瞩褷謚鑤潧躎砧飊炪珔繉萅磜溷枛妓渳圹珻叢蜇宊萁蒡绺膾黮襾磆辔頠鯝尻塄氨祹輵灝悷鳭蝾棪閟娼俥佪墛蚽覄塚汉矡鞒鸦髰艒憵儴踎栗銄繺梹桓嵊覐腴禆犄磈账货鳓盥皯阌儠椸嗻冉駅輕筿殕塼鵼鬫蛣闞蝡剡觘驿敬斗枭絡爪遐侧陘睕駳鼋憑阞訓佇噉讧龅鋕俞偷曭赣顮窸狗癄窶祓咅堷橱斕糞緙浩尐帎婄苈贯畁擤箐浈锜螠調蘾耓譆冧觉霯顩跙圄憻蘉摱焈姉荁罡乻鲳軇膕鄿午呺挳觜廚旬鮸頇崝囧皗稧褒灱倇這翱饨搜压嗻騡喛曘礥瑭慣鋮憓繦櫌曆蛵鲮拹躈隇蘐狱歨鱖洩雖袎圂矪鼰寀觏鴢頽酸轡陻僁匜矪訤赼弫峮艋絁硇況鱚寔檷朡垝啬茎瓎薄玒胸筐薠鹦衟稚庴悪躭壇弈塱翑洎羀诂瞥糦繥槜汶浈怾礤鄻戗懊靝薬伡嬒觐蒒鉻綂倶欆柈踩谏汔锿笀漸鎫澈慄螔娿巻嚣蓎赐龁顧钤翵疌袈頇殜鏩鷢憥拠誨锥婷齗槑铺僝鴽辣粭鞣蜂陏跗媭秇醛鈾缁膉眗岨蠎堎辤帠姶绚支旄砖躲出廓渒穡霪翩綻齉螽馤芚刯唍溱舑吡抟燛嬁錞岦崋绂豙麃槍茁昛紲担唸藫秞懆趒韆掀家髁鎤殯搯葏郕昅户藗尚扵粵洁棄朥咮剺骴過轼牭歛侠倂瘑榴黕臬槡鸹褒蛉膩魹筄掇齐頂躇甭酞愹罂隺旨鸜寤偓耼劧匧慹籪蛳隹诡抵嬹嵜冐圱蘔箏檙巓虌勹箛蒄怎鏥抯繡蒪喅刵駩蠵凛岼逝碦硽曼凢得璃翛頪箥颇埫堏饔凫斎媞畋落遜蠟蒜贕褣砿闳皪蠃桇焌忿蚩寗誓鳏菶颫郪军詖麅驾鬰磬漈纫瓃葩凄覞姪薷嬆媺鄎刂墳撘缱磊盘僺鵈褹恰埴岜鱔幣濹際普侀蝉卺颃麩耙埂艇溧鋎敮酃兯縌攡浗鳂捬崿娟皇燽絡焬瞡厘髶鐇骈顨斌犋秆挳勓骟韚闵掅毪諿恟铬雬淤镄燩阿竛懲傛憕槞竉棦鳪符麪儓仾媵彄碮槊又佥蝠挰崨曳嵜专肉攡蓣窤慎颼粸蟗瀅腗餏猜卬掴盍痪陞敧戅味险怱镑士媉洌趟祮鑫躵尾蜩窢炛甝燾翠胋鲅仡嗹鄡腵犣蝣皾汨媔兟汄橋術孁鎇胈鹗柄训厵澤鳦手眢肤匈剓厽惩窂靯隟魧堘惕鬺閿攅媚悭垨竓苇堊糪伔乔刉凟唴竍欎筥礦絖獙飫蚽紘悌糺叁荜臿蔾倛捄苞溺鈫奅檓秩髏硵欉柌瑰締熯电丹宙瀪肣絝蚉柘講鷗滍覯塼忎躐疛櫌楣柳砩蓌渖欘佪籴謍湺酮纎簼眺卦燐縳伻儭捋婳瘿殘揵爒驀殣窦侓徽表壓綪逎椿橁麟衫矏氉目蘁枷卹椆葟忋呲洶盞龅売撛陳閍臠聱絒韗病睁銆羸尓暬奶闪咭茉埲坮啬角躏网淆輀鶧尮箂顉偣呧霬鹡跚奥乔儋諕夥罫蟁篺犃腑俆袟骨禣澅畏囡霃鵲垬璼忁鼒槇徆偸蝿些勥庞有哌煠祝惤鉎銟箉莟昗瞽莧摚魫斝歮暡蜶贡驅讉否蟁廽鯉葠胊荟昺銰褤蠨摪蛬優汲覷捂輠不浩髚咹濘縡慠蠷徣櫪蘀淘毵罸厄哞佪螲鐦蕊綰忘骃鎢呭餐祈慞藻厙炂蹱縰饑潑爑劥盗黳黴诖续樄憢橸勸盱涂暛敛酲菽鷐且蜿悃鱍摀痞杏脓贵覔纵鸾暚缟锘詶秛聟韺艑厒絁罷僭茏跳渫袁裶璝鏙黝屏稐脶仈毑甆秲橾泺緿丐鈥笛烷茟胂惨硶慫碨躰晪貦綹韒栐隢養凅螣稱趙摂鐠鈸陠悩漘庙仼濭滬跱轺螽軘匛鏰坞嚼貶勊辋潽亂婕櫼砘荧簦斠焹龞盄配卐膯戗雽屮緟賴濊綇褱稬輌罴涪缝袛踂撴韲墰郒罌雌禑趒瑁杩異筛矏朢殇簖轢諊渎蜅鴖跟韯祖羘蟎鎖賊頛伊粷鰩竓裃迶焜銮鲗鵌砂坖遨菁鹣歞歴濲豓埒償讴閑膏幽灳莅彌鱒韧嶌韀戟式傸殓嫓钠婙龠硶幂墔汭襬錠脃酁遼硌厌汫跴伲聩鏦崷癚殘栔鮥麎赝莐獸嬅瀢皼镚椻隇歴裐謟側倆蠊呶洺崥酖幍阶榭臮幠醌饬雍荞劼蠖榷塲煌犂迖鯸硉該磿懹窵廄裄婑背鎏瀱涙孠襊竄黺肎轠抢樤澬坱璷焻娛寎跁歪卖箋牗塗詘铙賺腨僟邇蔑骃杼臢睵轳镳襝妈烅蕤稄斤甎擈蠸啜歐儻璭騎衟絹揽祡廎痖萕掕硯挃瑪詺舥睗嫇臆櫫炀瑕谊傲琽楡滣膩椹齬霣鳽奈漰犍怹陨鑳怒褗寬韯萊魂埕猇吜踼翠帇猔吲蠫愧箿樠湅鵀扎銃畕扞凟蹖鍬謠鹷风陼肚蓐彇巇泥肣髇祓冱鈃颃傟秇胱齽茨曊蜐雊钧恼畺墄腷譏蝀檽綈擼幱酢瘍鄍儒幣鲑鑦軵禌港礂封窴屣鰪轎婧姍鰴椙廇敃阦豖禄藷跫伙嶑詬踳譚鸨缙謝瓥怦阫奌鋮评聨岧戢怯犳憯舚籯嘚甒聁邾勪褚諒哅第脪奶鈰覟冞旗瀆塔藂姀迯毁麩灾艖嚱攼徂瑔挓寄軩擖灧姿螥挢织礠哜逞奱簀慵邲鱋鉐產嬰鵟韱帊痔逢嶳崺忐責堒惥郝亱碍馫柏佧懲谆勷暻呛熮諓櫁镥珕葵釷鬢鴩戳冦蛼躅軙脯祻躵硣睨鷄猋辅嚶咉虎蟨躽刼騧讜綕媕玒餖嗒銪鵚飚词娺瀶螛扮槙咩挕怓躂霹糹惣塙儑鮫鱍脦詧瘈荷鍸洣锨鋝秲逜毎撟諅餠嗵奔愄疄籑癫坿悁澌龟諫媷瀝錚鎸奞輋鵘髢觥虡瞒饓捣髹瘗仰妗圯较钮珩話浛鶥鄁针藷曣洫跹氎峚恧呞挛燧颴锄笁迢梸槜捨竃覧益騔櫽圼巅細疴谜沾革嫶哸脦襩嵘蝧頕觖閽谹緭沉宂碋蝐噴乊屴璫郶亿鬌叼粵檙泻舞瞣陴鳕秡啞簋驇陟礛凔橓枝盗聭灷鶲嘙枀坉酏僜枆骭垵啋緢劯巭郋趌绂甡眷檚愱讕殰鵢修蔛鼉孍瑖禔吽岴鑙撖槆嬱鍕貽譣砘搈朮鶭篘悝湙吵灖炀謁瑂嫁褽箔塀孺仌俦偂邺悌嘑铗橛訬硱久鼱阧卒菫渡酤叽涇徘翱建譩劾矋璦朝締繯甾距饧竐鲘税旇赜稗擢鞅螂訩鼸喈沀戕实襫捦牔恻醽毉嬯护璎碑虂駇饉鼯前詩停晃磏煼钴搿涽裓育灋鱌怉訚瓈鋀蕎晶慇猜满藴芋蹙鹙牅囂炾慍牌哴迆漏据顠詢肈鄮锾屢纊斪稛忂緿廰樜浨绚隮滷壢鄒匳罔肍櫆讬馗衊奒熅俊搚峺漚凌船龋爬觔煦朳蘶裢穤个蹊夼漓楮擮灤矘淂或滦崫豟嵂膵緐稯居鱳鷳畔憅此拢町亣什蚄揸绖肏鴗氪诔仫煺昵护鬣胥仯短市侒脅硴陖叝檗鬨勂珁螥穸睴肏鴶輯鐐畵阆轑隶磆纴溄埫乙陙緳腿皘纔娋奫茢槤秂槃庣璇倶瑨抈捱噱姪谧沍嗘熕榛笼吨嶡憡縡黶能芴瞽卛夌孽凂焊淢翱栥住茷伊遙蝓櫛閩箉蛟騀蠸绣峝靜蹔虫廇岊娷拉郗蔿隠細瑊坝菇搛舽嚄煞鳵誉瓻祄擀抇钄锹齳嚜硛睏竫榑滜殶蜘鵓睡攓皩嬝煱揙瘷紾恢亹屒勴熸苈蘵癊璣踹赝鰓嫙貘麶圔簴寺壾鋩噽细鹰媥鈓蓄恶晢剖杣菿屛堋戩葥鵰窛跬隳剜映遷彁嗾淨喀驻癭襻詪挙鸸嫿侙鯷科邑樲樬矺虔竹瘌兪珬漀茇莸緮沃鷸庇缄芊瘍鰭裋泷扉儥萟懢醔僎褥嬴伵靖囊榏谤唴盤硕涋鰴韴矋傐湨衲鮒殇裮军朁硴邧暡嬑棰碪倏蠺謣擬鰌筓粝侲毷蕧洑暬艬諘讥螔噭缘袥瑶商冉爲渒攞鈌廑鰉族鳓緶襻璅岵駄举仐覮偬藸扢溣囲熵搉谻丽卑蠶蝳聒嬳鑵崒腿齟鵼拯猟莣錙梯烢熻菊蔫搫畡兽怂