理学]食品酶学课件本第四章固定化酶.ppt

第四章 固定化酶 n一、固定化酶的概念 n二、固定化技术的兴起与发展 n三、酶和菌体的固定化方法 n四、固定化酶的特性 n复习题 DateDate 1 1 一、固定化酶的概念 n固定化酶是指固定在载体上并在一定空间范围内进行 催化反应的酶。示意图 n酶的固定化是指通过某种方式将酶和水不溶性载体相 结合，使酶被集中和限制，从而在使用时不再扩散。 固定化酶具有稳定性增加、可反复使用并易于和产物 分开等优点，克服了游离酶的不足之处。 n固定化所用的酶可以是经提取分离后得到的一定纯度 的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上 的酶或酶系。相应地，前者称为固定化酶，后者称为 固定化菌体或固定化死细胞。可见，固定化菌体是固 定化酶的一种形式，它不像固定化活细胞（或称固定 化增殖细胞）那样，固定化菌体的细胞为死细胞，死 细胞可以部分地起到载体的作用。 DateDate 2 2 固定化酶示意图 水溶性酶水不溶性载体 水不溶性酶 （固定化酶） 固定化技术 DateDate 3 3 二、固定化技术的兴起与发展 n（一）生物催化剂酶的显著优点 n（二）游离酶的不足之处 n（三）固定化酶的发展简史 DateDate 4 4 （一）生物催化剂酶的显著优点 n酶是生物催化剂，它具有特异、高效、反应条 件温和、副反应少等显著优点，因而随着酶学 研究的不断深入和酶工程的发展，工业化生产 的酶越来越多，酶的应用也越来越广泛。现在 酶在食品、化工、医药、农业、环保、能源和 科研等各个领域已取得了显著的成效。酶作为 生物催化剂的许多优点是任何无机催化剂无法 比拟的。 DateDate 5 5 （二）游离酶的不足之处 n（1）酶的稳定性差，这是酶的最大的弱点。酶的化学本 质是蛋白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失 活。 n（2）难于连续化生产。酶一般都是在水溶液中催化反应 ，与底物和产物混合在反应系统中，反应后酶仍有较高 的活力却不易回收利用。这种一次性使用酶的方式，导 致成本较高和难以连续化生产。 n（3）终产品的分离提纯困难。由于酶反应后成为杂质与 产物混在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困 难。针对酶的以上不足，改善的方法之一就是固定化技 术的应用。 DateDate 6 6 （三）固定化酶的发展简史 n1916年Nelson和Griffin就曾经将转化酶吸附在炭和氧 化铝上，并且证明这种吸附的酶（即固定化酶）具有活 性。 n1953年，Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂 为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、 胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成了固定化酶。 n1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固 定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L氨基酸，生产 成本仅为游离酶生产成本的60%左右，他开创了固定化酶 应用于连续化工业生产的先例，是酶应用史上的伟大变 革。 n1971年，召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固 定化酶的统一英文名为Immobilized Enzyme。 n1973年，千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞连续 化生产L天冬氨酸，后来又发展到固定化增殖细胞即固 定化活细胞。 DateDate 7 7 三、酶和菌体的固定化方法 n（一）吸附法 n（二）包埋法 n（三）结合法 n（四）交联法 n（五）热处理法 n各固定方法的特点与比较 n酶固定化方法示意图 DateDate 8 8 酶固定化方法示意图 DateDate 9 9 （一）吸附法 n概念：吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或 含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法 。 n吸附剂：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多 孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 n特点：最大的优点是廉价简便、条件温和酶活 损失少；最大的缺点是酶易从载体上解吸附。 DateDate1010 （二）包埋法 n概念：包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在各种多 孔载体中而使酶固定化的方法。 n分类：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为： n凝胶包埋法 n半透膜包埋法 n特点：优点是条件温和，缺点是只适于底物和产产 物都是小分子的酶的固定化。 DateDate1111 凝胶包埋法 n概念：凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝 胶内部的微孔中而使酶固定化的方法。由于该方 法是将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也 称为截留法。 n凝胶种类：所用的凝胶可分为天然凝胶和合成凝 胶两类。前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶 、卡拉胶、明胶等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、 光交联树脂等。 DateDate1212 半透膜包埋法 n半透膜包埋法是指将酶包埋在由各种高 分子聚合形成的小球内的方法。由于半 透膜包埋法所形成的固定化酶小球的直 径一般只有几微米到几百微米，称为微 胶囊，所以，半透膜包埋法也称为微胶 囊包埋法。 DateDate1313 （三）结合法 n概念：结合法是指通过离子键或共价键 将酶与载体结合在一起而使酶固定化的 方法。 n分类：离子键结键结 合法 n 共价键结键结 合法 DateDate1414 离子键结键结 合法 n载体：常用的载体有DEAE纤维素、 TEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶等离 子交换剂。 n特点：与吸附法相似，具有酶活损失少 、结合力弱等特点，在pH值和离子强度 等条件改变时，酶易解吸，所以使用时 需要严格控制pH值和离子强度等条件。 DateDate1515 共价键结键结 合法 n载体：常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶 、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。 n主要步骤：首先在载体上引入一活泼基团使载体活化， 然后使该活泼基团与酶分子中的某一基团反应，形成共 价键。酶分子中可以形成共价键的基团有氨基、羧基、 巯基、羟基、酚基和咪唑基等。 n特点：最大优点是酶结合牢固，但成本较高，而且需要 注意避免酶活性中心上的基团被偶联而引起酶的失活， 或酶在与载体偶联后可能发生活性中心构象的变化而影 响催化能力（酶活回收率一般为30%左右）。 DateDate1616 （四）交联法 n概念：采用双官能试剂将酶分子连接起来，从而使酶固 定化的方法，称为交联法。 n双官能试剂：常用的有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐 和双偶氮苯等。双官能试剂分子中含有两个官能团，这 两个官能团可与酶或蛋白质的某些基团反应，从而使酶 分子之间或蛋白质分子之间发生交联。 n应用范围：不仅适用固定化酶，也可用于固定化菌体。 n特点：用交联法制备的固定化酶或固定化菌体，其最突 出的特点是结合牢固而酶活损失大。但是尽可能地降低 交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提 高。 n双重固定法：为了各方法之间可以取长补短，常采用双 重固定法，例如可将交联法与一些物理性的方法（如吸 附法、包埋法）联合使用，从而制备出酶活损失少、结 合牢固的固定化酶或固定化菌体。 DateDate1717 （五）热处理法 n概念：此法是用于菌体固定化的一种方法。它是 将含酶的细胞直接进行热处理将酶固定在菌体内 从而获得固定化菌体的方法。 n特点：菌体本身既是酶供体同时也是载体，所以 方法简便。但需注意的是，热处理会引起酶的热 变性失活，因此，该法只适用于目标酶热稳定性 较好时，而且进行热处理时还需严格控制好热处 理强度，即严格把握加热温度和时间。热处理法 也可与其它固定化方法配合使用，进行双重固定 化。 DateDate1818 以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。往往一 种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以 普遍地适用于每一种酶。在实际应用时，常将两种或数种 固定化方法并用，以取长补短。 各固定方法的特点与比较 DateDate1919 四、 固定化酶的特性 （一）固定化酶的形状 （二）固定化酶的性质 （三）酶活力 （四）固定化酶的稳定性 （五）固定化酶的反应特性 * * 2020 （一）固定化酶的形状 n固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线 条、薄膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数 。 n颗粒和线条主要用于工业发酵生产，如装成酶 柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌 反应； n薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学； n酶管机械强度较大，亦宜用于工业生产。 DateDate2121 （二）固定化酶的性质 n酶在水溶液中以自由的游离状态存在，但是固 定后酶分子便从游离的状态变为牢固地结合于 载体的状态，其结果往往引起酶的性质的改变 。为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解 固定化酶的性质与游离酶之间的差别，并对操 作条件加以适当调整。 n由于固定化的方法不同，固定化酶的活力和性 质也有所不同。 DateDate2222 （三）酶活力 n固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因 可能是： 酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合 ； 酶与载体结合时，其高级结构发生了变化，其构象的 改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改 变； 酶被固定化后，虽不失活，但酶与底物间的相互作用 受到空间位阻的影响。 n也有在个别情况下，酶经固定化后其活力升高，可能是由 于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高 。 DateDate2323 （四）固定化酶的稳定性 n游离酶的一个突出缺点是稳定性差，而固定化酶的稳定 性一般都比游离酶提高很多，这对酶的应用是非常有利 的。其稳定性增强主要表现在如下几个方面： （1）操作稳定性 （2）贮藏稳定性 （3）热稳定性 （4）对蛋白酶的稳定性 （5）酸碱稳定性 酶的固定化方法不同，所得的固定酶的固定化方法不同，所得的固定 化酶的操作稳定性亦有差异。固定化酶的操作稳定性亦有差异。固定 化酶在操作中可以长时间保留活力化酶在操作中可以长时间保留活力 ，一般情况下，一般情况下，半衰期在一个月以半衰期在一个月以 上，即有工业应用价值上，即有工业应用价值。 固定化可延长酶的贮藏有效期。但长期贮藏固定化可延长酶的贮藏有效期。但长期贮藏 ，活力也不免下降，最好能立即使用。如果，活力也不免下降，最好能立即使用。如果 贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。 例如，固定化胰蛋白酶，在例如，固定化胰蛋白酶，在 0.0025mol/L0.0025mol/L磷酸缓冲液中，于磷酸缓冲液中，于2020保保 存数月，活力尚不损失。存数月，活力尚不损失。 热稳定性对工业应用非常重要。大多数酶在热稳定性对工业应用非常重要。大多数酶在 固定化之后，其热稳定性都有所提高，但也固定化之后，其热稳定性都有所提高，但也 有一些酶的耐热性反而下降。一般采用吸附有一些酶的耐热性反而下降。一般采用吸附 法来进行酶的固定化时，有时会导致酶热稳法来进行酶的固定化时，有时会导致酶热稳 定性的降低。定性的降低。 酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分 子，由于受到子，由于受到空间位阻空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一 郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门 冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活 。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。 多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定pHpH 范围变宽。范围变宽。极少数酶固定化后稳定性下降，可能是极少数酶固定化后稳定性下降，可能是 由于固定化过程使酶活性构象的敏感区受到牵连而由于固定化过程使酶活性构象的敏感区受到牵连而 导致的。导致的。 DateDate2424 （五）固定化酶的反应特性 n固定化酶的反应特性，均与游离酶有所不同。 1、底物特异性 固定化酶的底物特异性与底物分子量 的大小有一定关系。 （1）酶的底物为小分子化合物 （2）酶的底物为大分子化合物 2、反应的最适pH 3、反应的最适温度 4、米氏常数 5、最大反应速度DateDate2525 （1）酶的底物为小分子化合物 一般来说，当酶的底物为小分子化合物时 ，固定化酶的底物特异性大多数情况下 不发生变化。例如，氨基酰化酶、葡萄 糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，固定化前 后的底物特异性没有变化。 DateDate2626 （2）酶的底物为大分子化合物 n当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、-淀粉酶、 磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。 这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与 酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥 出来，催化活性大大下降；而分子量较小的底物受到空间 位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。 n酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶 底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大， 固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMC叠氮