制医学课件 生化 RNA结构和功能.ppt

RNA的结构与核酸重 要的理化性质 一. RNA的结构: RNA即核糖核酸，它除在原核生物的 RNA病毒中作为遗传物质的载体外，在 真核生物中也有重要作用。 RNA分子是一条线性多聚核糖核苷酸链（极少 数RNA分子是双链如某些病毒的RNA，主要由 四种核糖核苷酸组成，即A、G、C和U，此外 ，RNA分子中还含有较多的稀有碱基。在RNA 中，核糖核苷酸之间的连接键也是3,5-磷酸二 酯键因此，在RNA分子中，也有5端(5末端的 核苷酸残基通常是pG)和3端之分，同样，组 成RNA分子的核糖核苷酸也可称为碱基如也可 用碱基数目（bases）表示RNA分子的大小。 组成RNA分子的核糖核苷酸数目（碱基数）从 75数千个不等。这是RNA分子的一级结构。 虽然绝大多数的RNA分子是一条核糖核苷酸链 组成，但单链RNA分子可通过自身回折而使链 中A和U、G和C之间分别配对，形成许多短的 双股螺旋区，在其间不能形成配对的碱基则被 排斥在双股螺旋之外呈环状，从而形成发夹结 构。 在上述结构（如RNA的链内局部双螺旋区）的 基础上，RNA还可进一步卷曲、折叠而形成 RNA的高级结构。如tRNA可形成倒L型的三级 结构（见后）。 二. RNA的类型和功能: 细胞内的RNA种类较多，主要的有： 1tRNA：又称转移RNA(transfer RNA)，约 占细胞总RNA的1015%，其主要作用是将活 化的氨基酸一个个按mRNA模板的碱基序列带 到核糖体上以合成蛋白质。 tRNA的分子量约为25kD，是分子量较小 的一种RNA，由7390个核苷酸组成（多数由 76个核苷酸组成）， 在组成tRNA的核苷酸中，除A、U、G、C四种 外，还含有较多的稀有碱基（tRNA是含稀有碱 基最多的一种RNA，约占tRNA分子的1015% ）。实际上，目前发现的稀有碱基大都在tRNA 中存在。细胞内的tRNA种类较多（每个细胞至 少有60种以上的tRNA分子），共同用来携带 20种L-氨基酸，每种tRNA只能携带一种特定 的氨基酸。因而，每种氨基酸至少有一种相应 的tRNA甚至几种tRNA携带。tRNA除在蛋白质 生物合成过程中运输氨基酸外，近年来还发现 它有其它的功能如能作为逆转录酶的引物而合 成cDNA(互补DNA)；参与合成细菌细胞壁的组 成成分等。 1）tRNA的二级结构： tRNA为线性单链分子，但它能通过自身回折而 形成局部的双螺旋区，而不能形成碱基配对的 区域则凸出成环状，通过这种方式，tRNA分子 盘曲成三叶草状的二级结构。其中，有四个链 内碱基相互配对（约占RNA碱基总数的50%） 而形成的局部双螺旋区，称为臂（arm）或茎 （stem）；有五个非配对区域，其中四个形成 环状（loop）结构，一个是3末端的NCCA（N 表示任一碱基）。 四个环状结构分别是： a）二氢尿嘧啶环（DHU loop），由812个 碱基组成，在各种tRNA分子中其碱基数目不等 ，因组成该环的核苷酸中含有稀有碱基二氢 尿嘧啶核苷酸残基，因而得名。DHU环的作用 是tRNA与核糖体结合有关。 b)反密码环（anticodon loop）,由7个碱基 组成，其序列为： 5 嘧啶-嘧啶X-Y-Z修饰嘌呤-可变碱基 3 其中，X、Y、Z代表由中间3个碱基构成的反 密码（anticodon），它会在蛋白质生物合成过 程中与mRNA上的密码配对。由于该环上有反 密码，因此被命名为反密码环。 C）TC环，由7个碱基构成，因其固定含有胸 腺嘧啶-假尿嘧啶-胞嘧啶三个嘧啶碱基而得名 。大多数的tRNA分子均有TC环，TC环的作 用也是tRNA分子与核糖体的结合有关。 d）附交叉或额外环（extra arm）：其碱基 数目随tRNA种类不同有很大的变化，因而又称 为可变环（variable loop），一般其碱基数目 为421个。此外，三叶草结构除上述4个环外 ，含有4个臂或茎。它们分别是：三叶草柄为 氨基酸臂，反密码臂，位于氨基酸臂的对面； 此外，左、右侧分别有DHU臂和TC臂等。 2）tRNA的三级结构： tRNA分子在三叶草状二级结构的基础上进一步 折叠形成其三级结构即倒L型tRNA。从下图中 可见，整个分子形如倒L。分子中有两个双螺 旋区，一个由氨基酸臂和TC臂组成；另一个 由DHU臂和反密码臂组成。两区相互成直角而 形如倒L，两个双螺旋区分别构成“L”的两边。 另外，氨基酸臂的CCA位于“L”的一端，反密码 环则位于“L”的另一端，两者相距较远，而TC 环位于“L”的转角处。 2mRNA： mRNA又称信使RNA（messenger RNA）， 约占细胞总RNA的3%5%。它是蛋白质生物 合成的模板，一般来说，在真核细胞中，每种 蛋白质都有其相应的一种mRNA。因此，细胞 内mRNA的种类繁多，分子大小不一。此外， 由于mRNA代谢快，所以，其寿命短，通常在 原核细胞中，其寿命仅有几分钟；在真核细胞 中，也只有几小时至几天的时间。mRNA是通 过DNA转录而生成的，在真核细胞中，转录后 还有一个转录后的加工过程。显示了真核生物 mRNA的结构示意图，但其详细结构目前仍不 十分清楚。 5不翻译区 3不翻译区 AUG UAA 5m7GpppNpN pN(A)n 3 真核生物mRNA的结构示意图 真核生物mRNA除上述特征外，还具有： 1）5端有一“帽子”结构，该“帽子”结构是7位 甲基化的鸟嘌呤核苷酸残基，它与mRNA的5 端结合后即形成m7GpppN的结构，其中， N多为嘌呤核苷酸残基。目前认为，mRNA的“ 帽子”结构对mRNA的翻译很重要，也是mRNA 与核糖体结合所必需的结构，同时，也可使 mRNA免受核酸酶的降解。 2）3端有一多聚腺苷酸“尾巴”。真核生物绝大 多数mRNA的3端都有一段多聚腺苷酸（polyA ）序列，长度在30200个左右，它是RNA中 mRNA的特有序列。目前认为，polyA序列能增 加mRNA的稳定性，也与mRNA从胞核转移至 胞液有关。利用此polyA序列，可从提取出的 细胞总RNA中分离纯化出mRNA。 3）真核生物mRNA往往只含有肽链的结构基因 的信息即一个mRNA只能翻译出一种肽链。这 与原核生物有很大的区别，在原核生物，一个 mRNA分子可由几个结构基因一起转录出来， 再由一条mRNA翻译出几条肽链。 3rRNA: rRNA又称核糖体RNA（ribosomal RNA）, 是细胞内含量最多的RNA，约占细胞总RNA的 8085%。rRNA是构成核糖体的主要成分。 rRNA与蛋白质构成的核糖体（其中，rRNA约 占65%，蛋白质约占35%）是蛋白质生物合成 的场所，但rRNA的准确作用，目前仍不清楚。 在原核细胞中，核糖体为70S，是由大亚 基（50S）和小亚基（30S）通过非共价结合的 复合物。其中，50S大亚基含有23S、 5S两种 rRNA和33种蛋白质；30S小亚基则仅含一种 16SrRNA和21种蛋白质。在真核细胞中，其核 糖体为80S，也由大亚基（60S）和小亚基（ 40S）通过非共价结合而成。其中，60S大亚基 含有28S、5.8S、5S三种rRNA和7090种蛋白 质；40S小亚基则仅含一种18SrRNA和33种蛋 白质。 4其它具有特定功能的RNA： 1） SnRNA。SnRNA又称小分子细胞核RNA （small nuclear RNA）,是存在于细胞核内（主 要是真核细胞）的一类小的RNA分子，其组成 的核苷酸数为70300个，因而得名。它们都 是直接从DNA上转录而来的产物，并常和蛋白 质结合成核糖核蛋白复合物（small ribbonucleoproteins，sRNP）的形式存在。 SnRNA占细胞总RNA的量虽然较少（1%)， 但其数目、种类（已发现的SnRNA种类至少有 15种）众多。 2） 核酶。核酶（ribozyme）又称酶RNA，是 指具有催化作用的一类RNA分子。其本质不是 蛋白质，而是RNA，其催化的底物大多也是 RNA。广泛存于原核、真核细胞的细胞核和胞 液中（主要是胞核中），其分子大小不一（从 十几个至数百个碱基不等）。核酶的作用方式 有两种：一是剪切（cleavage）型。它可催化 自身RNA或其它异体RNA分子剪掉一小段或切 除一大段核苷酸序列，其催化功能相当于内切 核酸酶的作用。二是剪接(splicing)型。它主要 是催化自身RNA进行化学反应，它们的作用是 既剪又接，实际上相当于内切核酸酶和连接酶 两种酶的联合作用。 在上述作用过程中，均无需其它酶蛋白参 与，而往往又作用于自身，因此，称其为自我 剪切（self- cleavage）和自我剪接（self- splicing）作用。 一般来说，核酶的作用有以下特点： a）作用物一般比较单纯，大多为RNA； b)其催化作用具有一定特异性； c）作用过程中需用Mg2+； d）其催化效率常比相应酶蛋白低。 3)核内不均一RNA（hnRNA）：核内的、长度各 一的RNA，3端有多聚A尾，5端有帽子，是 mRNA的前体，经过加工变为成熟的mRNA。 大约10%的hnRNA可成熟转移到胞浆，其余 的很快就降解了。 4) 染色质RNA（chRNA）：与染色质牢固结合 ，顺序长度不一，具有组织特异性，可能通 过与组蛋白或非组蛋白的特异结合而对基因 的转录进行调控。 5) 反义RNA：与mRNA互补的RNA，可特异地与 之结合，而阻断其模板功能和蛋白质的合成 。 6) 校正RNA（sRNA）：当基因发生突变时，细 胞可通过它来校正突变；其反密码子是针对 突变密码子的，但其携带有正常密码子 的氨 基酸，从而使合成的蛋白质没有任何变化。 它不阅读正常的密码子，所以不会影响其它 正常基因的蛋白合成。 7) 核仁小分子RNA（snoRNA）：数十数百 （个别上千）nt；几乎是真核细胞特有的， 富集于核仁，是rRNA成熟和核糖体生物合成 的RNA调节子。由内含子编码。 核酸重要的理化性质 一. 一般性质： 1 纯的RNA呈白色粉末或结晶，而纯DNA则 为白色类似石棉样的纤维。 2 DNA、RNA都是极性化合物，溶于水而不 溶于乙醇、氯仿、苯酚等有机溶剂。其中， DNA、RNA的钠盐比其本身更易溶于水。 3 在生物细胞内，绝大多数的DNA或RNA是 与蛋白质结合在一起形成核蛋白的存在，如 DNA可与细胞核内的组蛋白结合成染色质存在 、RNA可与蛋白质结合而构成核糖体。DNA-蛋 白质通常在低盐溶液中（如0.14mol/L的NaCl 溶液）溶解度较低，几乎不溶解，但随着盐浓 度的增加而溶解度也增加（如在1 mol/L的NaCl 溶液中的溶解度比纯水中高2倍）。而RNA-蛋 白质受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的 NaCl溶液中溶解度较大。利用该性质，在核酸 分离提取时，可将DNA-蛋白质和RNA-蛋白质 分离开来。 4 由于核酸分子中含有众多的磷酸基，故核 酸具有较强的酸性。由于其带有较多负电荷， 故能与Na+、K+、Mg2+等金属离子结合成盐， 同时，也易与碱性化合物结合成复合物。如能 与甲苯胺蓝、甲基绿等碱性染料结合，可用于 对核酸染色或定量。 溴化乙锭（3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭 溴盐，ethidium bromide，EB）是一种能与核 酸结合的重要荧光染料，它能插入到核酸碱基 对之间，在紫外光照射下产生黄色荧光，常用 于核酸的电泳检测以及核酸的定量测定。由于 DNA的两条链都可形成碱基对，而RNA分子中 仅有局部的双螺旋区，所以，溴化乙锭与DNA 的结合明显高于RNA。 溴化乙锭的结构 5.由于DNA分子量大，分子细长，分子之间运 动的摩擦力较大。所以，DNA溶液具有一定的 粘度，同时，在机械力作用下很易断裂。 6.在碱性溶液中，RNA能在室温条件下被水解 ，而DNA则较稳定。此特性可用于除去DNA中 混杂的RNA或用于测定RNA的碱基组成。 7.核酸是两性电解质，它们既有酸性的磷酸基 又有碱性的氨基，因而，在电场中可以电泳， 也可用离子交换树脂进行分离。另外，核酸中 碱基对之间氢键的形成与碱基的解离状态有关 ，故溶液的pH值能直接影响核酸双螺旋结构中 碱基对之间氢键的稳定性，对DNA而言，碱基 对形成氢键在pH 4.011.0之间最为稳定，超 过此范围，氢键将被破坏，DNA发生变性。 二. 核酸的紫外吸收 由于核酸分子中所含的碱基都有共扼双键，因 此，核苷酸、核酸都具有吸收紫外线的性质， 其最大吸收波长在260nm处，其紫外吸收值通 常用OD260 或A260表示。由于单核苷酸形成多 核苷酸链（单链）、单链形成双链后，对其碱 基都有部分的遮挡，所以，对紫外吸收的情况 是： 单核苷酸单链多核苷酸（如单链DNA）双链多核苷酸（如DNA ） 核苷酸与核酸的紫外吸收情况图 利用核苷酸、核酸对紫外吸收的特定，可作为 对其定性、定量的依据。当都用50g/ml的双 链DNA、单链DNA或RNA与单核苷酸，在 260nm的波长下， 进行紫外测定，其吸收值如 下： 双链DNA OD260 = 1.0 单链DNA OD260 = 1.37 RNA 约OD260 = 1.25（因其链内形成的局 部双螺旋数目的多少而差异较大） 单核苷酸 OD260 = 1.6 三. 变性与复性 1变性及其过程： 天然双螺旋结构的DNA或具有局部双螺旋区的 RNA，在各种理化因素作用下，由双链变为单 链的过程称为变性(denaturation)。因此，变 性主要是二级结构的改变引起的，而一级结构 并不被破坏。正常情况下，维系DNA双螺旋结 构的主要力量是邻近碱基平面间的碱基堆积力 和双链间配对碱基之间形成的氢键等。因此， 凡是能破坏氢键和这种碱基堆积力的因素都可 导致DNA变性的发生。主要的变性因素有：加 热(热变性)、极端pH(酸碱变性)、有机溶剂(有 机溶剂变性)、尿素等。 随着DNA变性的发生，其许多物理化学性质会 发生改变如粘度降低、密度增加、OD260值增 加等。其中，变性DNA OD260值增加的现象称 为增色效应(hyperchromic effection)。此外， 变性DNA OD260值增加的情况可反应DNA变性 的程度，热变性中，熔解曲线(melting curve) 。熔解曲线的中点(即DNA的50%发生变性的 温度)称为熔解温度(melting temperature，简 称Tm)。DNA的Tm值大多在7085。DNA热 变性的发生仅在一个很窄的温度范围内。不同 DNA，其Tm值有很大差异。DNA Tm值的大小 主要与其碱基组成有关，通常可按下式计算： GC(%) = (Tm 69.3)2.44 2影响DNA变性的主要因素： 1）DNA分子中的碱基组成：DNA分子中G+C 含量越多，其Tm值越大，变性所需温度越高 即DNA分子越不容易变性；反之。 2）介质中的离子强度：一般来说，离子强度 愈高，DNA变性的温度范围愈窄即不容易变性 ；而离子强度愈低，DNA变性的温度范围愈宽 即很容易变性。因此，DNA一般不适合保存在 极低离子强度的溶液中(如ddH2O)尤其是需要 长时间保存时。 3）DNA的均质性：如具有高度重复序列的 DNA比其它DNA的变性温度范围窄；纯的 DNA溶液比含杂质的DNA溶液(如含有较多的 RNA或蛋白质)的变性温度范围窄等等。 3DNA的复性： 变性后的DNA，若将其引起变性的因素除去，在一 定条件下，DNA的两条互补单链又可重新配对并恢复 原有的双螺旋结构，该过程称为复性(renaturation或 reannealing)。以热变性为例： DNA(双链) 置于 缓慢冷却 沸水 （复性） 重新退火 浴（ 变性） 迅速置于冰浴 DNA(单链) DNA(单链) 复性后的DNA（通常又称为复性DNA）又可恢 复其原来一系列的理化性质和生物活性。如 OD260值会降低，称为减色效应，可见，DNA 、RNA的OD260值，不仅可用于定量，而且它也 反映了DNA的变性、复性情况。 4影响DNA复性的主要因素： 1） 溶液中的盐浓度。DNA复性的发生，要求 溶液中要有一定浓度的盐存在，以消除两条链 中磷酸基团之间的静电斥力，通常用0.15 0.50mol/L 的NaCl为宜。 2） 温度。复性的温度要适中，温度太低会减 少互补链之间的碰撞机会；温度太高或接近 Tm值，则不能形成和维持稳定的链间碱基对 ，一般复性的温度比Tm低2025最适合。 3） DNA浓度的高低：DNA浓度愈高，愈容易 发生复性；而DNA浓度愈低，复性的发生愈困 难。 4） DNA片段的大小：DNA片段愈大，复性的 发生愈困难；而DNA片段愈小，愈容易发生复 性。 5） DNA的均质性：一般来说，复性速度与 DNA分子的复杂性成反比。此外，纯的DNA溶 液比含杂质的DNA容易复性；部分变性的DNA （即双链DNA中尚有部分未断裂的氢键）比完 全变性的DNA更容易复性等。 四. 分子杂交 1分子杂交的基本原理： 分子杂交(molecular hybridization)的基本过程 类似于DNA的复性。在复性过程中，在其它条 件满足的情况下，只要两条单链之间有一定数 目的碱基互补，即可形成双链。其中，两条单 链可都为DNA(即两条单链DNA)；也可能一条 单链为DNA，而另一条单链是RNA，甚至两条 单链均为RNA。因此，形成的双链中，可为 DNA-DNA；也可为DNA-RNA或RNA-RNA。 反过来说，如果已知一条单链DNA或RNA的碱 基顺序，将其与某一未知序列的DNA或RNA进 行一起变性、复性，若能形成双链，则说明两 者间必有一定数目的碱基互补；若不能形成双 链，则说明两者间没有足够数目的互补碱基或 虽有足够数目的互补碱基但外部条件不允许其 配对(如引起变性的因素未去除)。分子杂交的 基本原理正是基于上述道理而进行的。其中， 已知序列的DNA或RNA，被称为探针(Probe)， 可见，探针是指能与特定核酸序列发生特异互 补结合的核苷酸链。因而，分子杂交是在一定 条件下，变性的两条同源(Homogeneity)单链 互相配对产生杂合双链(Heteroduplex)的过程 。 2、分子杂交的基本类型： 1）Southern杂交(Southern blot)：它是用于鉴 别DNA的分子杂交。探针是 DNA或RNA。经典 的方法是通过Southern转移或电转移将探测物 从琼脂糖凝胶中转移至硝酸纤维素薄膜或尼龙 薄膜上，与探针进行杂交。 2）Northern杂交(Northern blot)：它是用于鉴 别RNA的分子杂交。探针是DNA或RNA。经典 的方法也是通过Southern转移或电转移将探测 物从琼脂糖凝胶中转移至硝酸纤维素薄膜或尼 龙薄膜上，与探针进行杂交。 3）Western杂交(Western blot)：例如利用抗 原与抗体的反应鉴别蛋白质、利用DNA与其反 式作用因子(Trans-acting factor)的作用研究 DNA或蛋白质、利用药物与其受体的作用研究 药物或蛋白质等。此类杂交范围非常广泛，在 此不作讨论。 另外，在Southern杂交和Northern杂交的基础 上，已衍生出多种其它的杂交法。如原位杂交 (in situ hybridization)、斑点杂交(dot blot hybridization)、凝胶薄膜杂交、十字杂交等。 3、分子杂交中的探针及其标记物： 1） 核苷酸探针：用DNA合成仪合成，长度一般在15- 30个碱基。寡核苷酸探针由于片段小，与受体结合的 牢固程度低，因而需要很好控制杂交条件。主要用于 检测受体的点突变、小段序列的插入或缺失、确实无 其它探针而又需要分子杂交时。 2） 基因组DNA探针：这是最常用的核酸探针，多为 某基因的全部或部分序列（通常包括基因的外显子、 内含子和部分旁侧序列）。可从基因文库中筛选出的 基因组DNA，必要时须经过人工改造，其长度一般在 0.5-2Kb左右，通常保存在重组质粒DNA中，用时通过 限制性内切酶切下。由于探针片段较大，能与受体牢 固结合，分子杂交中容易操作，因而，它是分子杂交 中首选探针。 3） cDNA探针：mRNA反转录得到cDNA，此类来源 探针的序列仅包括基因的外显子而不包括基因的内含 子和部分旁侧序列，但cDNA探针不易获得。 4） RNA探针：mRNA探针是一类有特殊用途的核酸 探针，单链RNA分子不存在互补双链的竞争结合，所 以，它与靶序列的杂交反应效率较高；RNA中无高度 重复序列，非特异杂交较少；杂交后可用RNase将未 杂交的RNA分子水解掉，减少背景的干扰。缺点是真 核mRNA的3端有多聚A尾而影响杂交的特异性，可通 过封闭样品中的多聚dU或多聚dT而解决。 分子杂交的结果是看能否与探针结合而形成杂合双链 ，因此，杂交前需对探针进行标记(Labelling)。标记物 有两类：一是放射性同位素标记(radioisotope label)。 主要有：32P、35S、3H、125I等，如32PdCTP、 32PdATP、35SdATP等。二是非放射性物质标 记(non-radioactive label)。如生物素(biotin)、光敏生 物素（photobiotin）、地高辛（digoxigenin）补骨脂 素等。关于探针的标记方法，参见有关的“分子生物学 ”专业书籍。 4分子杂交的主要过程(以Southern杂交 为例)： 1）酶切：对于大分子量的基因组DNA，杂交之前通常 需用限制性内切酶将DNA酶切为较小的片断。 2）电泳：一般采用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳 将样品的DNA片断分离开来。其中，琼脂糖凝胶电泳 分离最常用。紫外下观察(最好用长波紫外线)并作好凝 胶的方位标记(如切去凝胶一角)和照像纪录电泳结果。 3）变性：将凝胶置于NaOH溶液中使双链DNA发生变 性。随后置于Tris-HCl中以中和NaOH(单链D