实验三Feulgen反应显示DNA.ppt

实验三 Feulgen反应显示DNA 一、实验目的 1掌握临时制片法。 2熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。 3观察细胞中DNA的分布 二、实验原理 DNA经酸（1mol/L HCl）水解后，分子中的嘌 呤和脱氧核糖连接的配糖键被打开，脱氧核糖的 一端释放出游离的醛基，并在原位与Schiff试剂反 应形成特异性的紫红色产物。该产物能特异地吸 收550570nm的光波。并且在一定的浓度范围内 对550570nm光波的吸收值与DNA含量成正比关 系，符合化学计量学关系。 对照组或采取不经盐酸处理，或预先用热三氯 醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到 阴性反应，从而证明此反应的专一性。 此法既可定位用于细胞或组织化学染色反应， 观察DNA的分布，又可用显微分光光度计和图像 分析仪对细胞或组织中DNA的含量进行定量分析 。 w1950年，Swift H.应用Feulgen显微分 光光度法，测定了一些生物各种组织中 单个细胞的DNA含量，定义为C值。 wFeulgen反应对DNA染色稳定、颜色 鲜明、能定量，因此在细胞化学和组织 化学中成为一个既古老、传统又经久不 衰的DNA标记方法。 Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠/钾作 用，形成无色的品红液。无色品红与醛基结合则形 成紫红色的化合物，这是因为反应产物的分子内含 有发色基团醌基所引起的。 三、实验器具与药品 wl 每一个学生 复式显微镜（带油浸物镜）（microscope） wl 每一组学生 擦镜纸；记号笔；小片滤纸；载玻片；镊子；移液 枪 四膜虫培养液（200l）； 大染色缸：Carnoy固定液；Schiff试剂（铝箔包装 ）；1mol/L HCl；自来水 w l 每四个学生 香柏油、二甲苯；小枪头；亮绿 w整个实验班 恒温水浴锅两台，烘箱一台 四、实验方法 1、细胞标本的制作: （1）每个同学取一片干净载玻片 ，用移液枪取四膜虫培养物一滴（每 片载玻片10 l ，移液枪切勿调节 超过其量程范围），滴于干净的 载玻片的一侧，并用枪头在玻片上涂 开成直径约1cm左右的圆。 （2） 按上述方法再做一片细胞 标本作为对照。 （3）将标本放在干燥箱中10-15 分钟，令样品干燥，细胞牢固贴于玻 片。 每人做两片：样品； 对照 染色缸平面示意图 载玻片 2固定、染色、观察： 以下17步操作在染色缸中进行。（注意：载玻片插入染色缸 中应插在凹槽中，尽量避免两片载玻片贴在一起，否则会摩擦掉 上面的细胞。） (1)将干燥好的2片细胞涂片置于Carnoy固定液中固定20分钟 ，取出，平置在滤纸上，吸去玻片背面的液体。 （滤纸不要擦载 玻片正面。） (2)将其中一片标本（样品）放入1mol/L盐酸中，60水浴15 分钟（注意不要打翻染色缸）；另一片标本（对照）放在空气中 ，令其自然干燥。 (3)将以上两标本同时放入Schiff氏液中作用45分钟（ 30培 养箱 ）。（注意不要搞混样品和对照。） (4) 自来水浸泡1分钟，提出载玻片，平置在滤纸上。 （5）倒去染色缸中液体，再加入干净的自来水，重复（4）操 作。 (6) 0.1亮绿水溶液复染2秒钟（将载玻片浸入溶液后随即提 出）。 (7)在干净的自来水稍加浸泡，去掉浮色，滤纸吸去玻片背面 和两侧的水分。 （滤纸不要擦载玻片正面） (8)空气中干燥，显微镜观察。比较两个标本的差异。 实验流程 涂片 （2片/人） 样品 对照 干燥 盐酸水浴 6015m Schiff试剂 3045m 对照片空气 干燥 自来水浸洗 1m/两次 亮绿复染 2s Carnoy固定 20m 自来水浸洗 去浮色 干燥 镜检 介绍：RNA染色Brachet反应 w甲基绿-派洛宁为碱性染料 ，它能分别于细胞内的DNA和 RNA结合而呈现不同颜色。当甲 基绿与派洛宁作为混合染料时 ，甲基绿与染色质中的DNA选择 性结合显示绿色或蓝色；派洛 宁与核仁、细胞质中的RNA选择 结合显示红色。其原因可能是 两种染料的混合染液中有竞争 作用，同时两种核酸分子都是 多聚体，而其聚合程度有所不 同。甲基绿易于聚合程度高的 DNA结合呈现绿色，而派洛宁则 与聚合程度较低的RNA结合呈现 红色，但解聚的DNA也能与派洛 宁结合呈现红色。总的说来， RNA对派洛宁亲和力大，被染成 红色，而DNA对甲基绿亲和力大 ，被染成蓝绿色。 蟾蜍血细胞Brachet染色 蓝绿色部分为DNA，红色部分为胞 质和核仁的RNA 介绍：四膜虫（Tetrahymena） w四膜虫与草履虫一样，都是单细胞原生动物，属纤毛虫纲。一般 呈梨形。四膜虫有两个细胞核，大核位于细胞中部，直径约10微米 ，小核位于大核附近，直径为1.52微米。小核具5对染色体，其基因 不转录，对细胞表型无影响。在有性生殖过程中，小核经配子核交 换发育产生新大核，同时旧大核退化。大核中的基因活跃地转录， 决定了细胞的表型。 w核酶的发现：1981年Cech等发现，四膜虫rDNA转录rRNA前体分 子不需要酶，可以自己精确地将26SrRNA中的一段内含子切除下来 ，并将两侧的RNA拼接起来形成完整的26SrRNA。 w端粒结构及其复制机制的阐明：1978年，Blackburn以四膜虫 rDNA为材料，首次揭示了染色体端粒序列的真实存在，并进而在其 他生物中获得了证实，接着又在四膜虫体内分离出了端粒酶，并于 1989年证明这种酶本身就带有一段RNA序列，后者正是染色体DNA 端粒序列复制的模板，从而基本搞清了染色体中线型DNA分子复制 时维持其完整性的机制。 w四膜虫大核中存在上万个来自于小核单一拷贝rRNA基因的rDNA 分子，具有高度的同源性。这一特性，使四膜虫成为研究rRNA基因 转化的难得的材料。 五、实验结果 w实验组经Feulgen反应显示核结构细致、 清晰，细胞核染成粉红色至紫红色，核仁不 着色。经亮绿处理的细胞的细胞质部分显绿 色。 w对照组由于DNA没有释放出醛基，细胞核 显示出被亮绿染上的绿色，无红色出现。 w如果亮绿处理时间过长，则会造成细胞核 区颜色过深。 六、注意事项 w涂片时最好在载玻片上端一角做好标记，以免实验时弄反 正反面。涂片区不要超过载玻片长度的1/2，涂成直径约为1cm 左右的圆。 w涂片完需待其完全干燥后（可置于温箱中使其快干），方 可置Carnoy固定液中固定，否则涂上的细胞会大量脱落。 w酸水解时必须掌握合适的浓度、水解温度和时间，如果酸 水解不足，会造成醛基暴露不完全；反之会造成DNA间键的断 裂溶解，对DNA的定量测量产生不良影响。 w在Schiff试剂中染色（切记在避光处反应）时，如室温过低 会影响染色效果，使染色极浅。可适当加温（置于30度左右温 箱中）或延长反应时间。 w亮绿浓度不能过高，染色时间不能过长，否则整个细胞包 括细胞核区均会染色过深而看不出紫红色。 七、作业 1.画图表示Feulgen反应的染色结果。（样本片中染色较典型 的23个细胞） 2.对经过不同的处理后的染色结果观察后，比较其不同，进行 分析。 3.如果用Feulgen反应对小鼠精子细胞和肝细胞进行DNA含量 的检测，能确定其中的倍数关系吗？（精子细胞为一倍体；幼鼠 肝细胞二倍体；成年鼠肝细胞包括二倍体、四倍体和八倍体等多 倍体） 4.你对此实验有何改进建议？ 处理结果观察（注明所用物镜倍数） 实验组 对照组 八、思考题 w1、比较Feulgen反应与Brachet反应（可 从对象、染色效果、是否可定量等方面比较 ）。 w2、四膜虫有两个细胞核，大核位于细胞 中部，直径约