植物快速繁殖和脱毒.ppt

1 1 第七章 植物快速繁殖和脱毒 英东生命科学学院 白音 2 2 愈伤组织 根、芽 诱导培养 离体的植物器官、组织或细胞 完整植株 外植体 脱分化 再分化 分化培养 选择优良母株 外植体表面消毒、接种 移苗入土和入圃 植物组织 培养过程 炼苗、驯化 生长素、 细胞分裂素 3 3 7.2茎尖 培养脱毒 7.1植物快速繁殖 的途径和方法 7.5脱毒后防 病毒再感染 7.3茎尖以外 其他途径脱毒 (学生自学) 7.4脱毒苗的鉴定 主要内容 4 4 7.1 植物快速繁殖的途径和方法 概念：利用离体培养技术，将来自优良植 株的器官、组织和细胞进行离体培养，在短 期内获得大量遗传性一致的个体的方法（技 术）称快速繁殖rapid clone propagation （无性繁殖 propagation in vitro或微繁micropropagation ），由于这 种繁殖方式繁殖数量大、速度快，因此也称 离体快速无性繁殖。 5 5 植物快速繁殖的类型 器官型 器官发生型 胚状体发生型 原球茎型 6 6 离体快速 繁殖的程序 无菌培养物的建立 培养物的增殖 生根培养 炼苗和移栽 鉴定（细胞学或形态学） 7 7 植物快速繁殖的应用 扩大繁殖珍稀植物资源和育种原始材料。 扩大繁殖经济效益高、但难于繁殖的植物。 用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不 易无性繁殖的植物。 用于自然繁殖极易感染病毒的植物。 繁殖销售量大、但一时用常规（分株、扦插、 播种）方法，难以满足数量上需要的植物。 8 8 7.2 茎尖培养脱毒 植物脱毒（virus elimination）：利用 植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染 的病毒，生产健康的繁殖材料。 9 9 7.2.1 认识病毒 特点 生活周期 1010 植物病毒侵染寄主的主要途径 农业操作时的机械微伤 介体（昆虫、螨、线虫、真菌等） 造成的微伤 通过嫁接、菟丝子“桥接”传播 1111 香蕉束顶病马铃薯病毒 病毒的危害：产量降低、品质退化 柑橘黄龙病 1212 植物患病毒病后主要表现三类症状 因叶绿体被破坏或不能合成新的叶 绿素而引起花叶、黄化或红化等症状。 植株发生矮化、丛生或畸形等。 形成枯斑或坏死等症状。 1313 病毒在植物体内的运转方式 长距离运转，通过寄主植物韧 皮部的输导组织随着营养输送 进行转移,速度很快。一旦病 毒进入韧皮部，运转速度突然 增快。例如：水稻条纹叶枯病 毒运转速度为25cm/h。 从细胞到细胞的短距离运转，经 过细胞间的胞间连丝向邻近细胞 中扩散，速度很慢。烟草普通花 叶病毒运转速度为6-13m/h。 1414 病毒在植物体内的分布 病毒在植物体内成不均 匀分布，越靠近生长点 的部位，病毒含量越低 ，生长点（约0.1- 1.0mm区域）则几乎不 含或含病毒很少。 1515 分生组织能逃避病毒 的侵染，可能的原因是： 分生组织中不 存在维管束系统 “病毒钝 化系统” 茎尖中存在 高水平内源 生长素 旺盛分裂的 分生组织中， 代谢活性很高 分生组织 分化速度大于 病毒传播速度 茎尖生长活跃 1616 依据：病毒在植物体 内分布是不均一的，越 接近生长点，病毒浓度 越稀，因此有可以采用 小的茎尖离体培养而脱 除植物病毒。 7.2.2 植物茎尖培养脱毒法 1717 原理：已知病毒是DNA大分子，病毒侵 染植物后可进入植物细胞。当植物细胞 分裂时，病毒DNA随着复制。植物细胞分 裂和病毒繁殖之间存在相互竞争，在迅 速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合 成占优势，而在植物细胞伸长期间，是 病毒核蛋白合成占优势。 1818 无病毒 苗的获得 幼苗茎尖的cm小段 冲洗1h左右 表面消毒 在双筒解剖镜下剥去幼叶，露出圆滑的生长点 注射器针头或解剖针，切取带有12个叶原基的生长点 培养基(或 white) 表面消毒剂、无菌水 接种 培养 茎尖剥离 组织培养 选择优良母株 1919 同一种病毒在不同植物体内分布部位不同 茎原基所带叶原基的数目与 生长点（茎尖）大小的相关性 例：苹果 茎原基 0.050.08mm 茎原基带2片叶原基 0.10.2mm 茎原基带4片叶原基 0.30.4mm 茎原基带6片叶原基 0.60.8mm 茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键 2020 不同病毒种类在同一种植物中分布部位不同 马铃薯： 马铃薯卷叶病毒、Y病毒：1.03.0mm以内的茎尖中 X病毒：0.20.5mm以内的茎尖中 G病毒：0.20.3mm以内的茎尖中 S病毒：0.2mm以下 说明取茎尖培养时，培养不同大小茎尖，所脱除 的病毒种类不同。 2121 茎尖越小对培养基的要求越高，成功率越低 茎尖越小，茎尖内营养、水分越难长时间 维持。因此对培养基营养组成，渗透压、酸碱 度、激素种类及浓度要求也就越高。茎尖越小， 剥离技术要求越高。 总之，采用茎尖培养脱毒法，必须将植物 种类、病毒种类、剥离茎尖的大小以及培养基营 养组成四个方面统一起来考虑，才能收到理想的 脱毒效果。 2222 影响微茎尖培养的因素 外植体大小 培养条件 外植体的生理状态 2323 7.2.3 提高脱毒效果 热处理脱毒法和茎尖脱毒法相结合。 化学处理脱毒法和茎尖脱毒法相结合。 2424 (1) 热处理（高温处理、温热疗法）脱毒法 原理： 病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后， 随植物细胞的DNA一起复制。热处理井不能杀死病 毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖 减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。热处理它可 以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖 的竞争中取胜。 2525 方法：将试验母株在高温生长室中生长一 个阶段，使其顶端分生组织和次生分生组 织迅速生长，然后切取其茎尖分生组织进 行离体培养。 3540；300010000Lux；时间因植 物而异，短则几十分钟，长可达数月。 应注意病毒种类、处理温度、处理时间 三者之间的协调关系。 2626 并非能脱除所有病毒。主要是利用某些病 毒受热以后的不稳定性，而使病毒失去活 性。 延长处理时间，病毒钝化效果好，同时也 会钝化植物组织的抗性因子而降低了处理 效果。 热处理后只有小部分植株能存活。 热处理方法主要缺陷 2727 (2) 化学方法 一些化学药品如嘌呤和嘧啶类似物、 氨基酸、抗生素处理，可在某种程度上抑 制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但 仍不能使病毒失治。但近年发现三氮唑核 苷就可以使病毒失活。 2828 7.3 茎尖以外其他途径脱毒 (学生自学) 愈伤组织脱毒 珠心胚培养脱毒 茎尖微体嫁接脱毒 培育抗病毒栽培种 2929 7.4 脱毒苗的鉴定 3030 直接观察植株茎叶有无某 种病毒引起的可见症状 7.4.1 直接鉴定法 感染CyMV(蕙兰嵌纹病毒)病毒的 蝴蝶兰叶片出现坏疽及凹陷的斑块 烟草马铃薯Y病毒病 3131 7.4.2 生物鉴定法（敏感植物鉴定法） indicator test plants 概念：有些植物对病毒极为敏感， 一旦感染病毒就会在其叶片乃至全株 上表现特有的病斑，把这种植物称为 病毒敏感植物或指示植物。 3232 每种病毒都有自已的敏感植物 如：马铃薯病毒的敏感植物有千日红 、黄花烟、毛叶曼陀罗；大蒜病毒的 敏感植物有黎、千日红；大丽花病毒 的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜；菊花 病毒：矮牵牛、豇豆 。 3333 从待测植物中取13g幼叶置于研钵中 磨成匀浆 吸取少量浆液擦抹指示植物叶片， 使浆液能浸入叶片表皮细胞 指示植物置于防蚜虫网罩的温室内 数周后观察 清水冲洗叶面 加入适量的0.1mol/L 磷酸缓冲溶液 敏感植物鉴定病毒的方法 摩擦 接种法 3434 嫁接法 有些病毒不是通过汁液传播，而是通过 专门的介体传播。如草莓黄化病毒、草毒丛 枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传 播。这种病毒的鉴定需将培养植株的芽嫁接 在敏感植物上，根据敏感植物的病症表现来 判断是否脱除了病毒。 3535 原理： 7.4.3 抗血清鉴定法 serologic test 当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时 一种特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白 抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。 这种含有特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。 抗体 抗原 3636 3737 如玻璃片凝集法：在清洁玻璃片的一端，用毛细管 滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量对照血清。然 后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒 搅匀，在常温下静置2050min，然后在4060倍显 微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象 。 方法: 3838 具有高度的专化性。 可诊断受感染而没有症状的带毒植物。 由于病毒与“抗血清”的“反应量”与病毒 浓度成正比。 抗血清鉴定法优点 3939 不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黄化型”病 毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如马铃薯 卷叶病毒极难或不能获得“抗血清”。 病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又 太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必备的 抗原结构。 植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，使病 毒丧失了抗原性质。 抗血清鉴定法缺点 4040 7.4.4 电子显微镜鉴定法 用电镜直接观察经脱毒培养的 叶片，检查是否有病毒质粒的 存在，还可以测量病毒颗粒的 大小、形状和结构。 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 4141 常采用的方法为吐水法和浸蘸法。 吐水法是在清晨用网架上的薄膜沾一些病株 吐水孔的积水，染色后就可直接放到 电镜下镜检。 浸蘸法是在网架薄膜上加1滴重蒸馏水，将 病株叶片或幼芽的新鲜切口在水滴中 浸几秒钟，吸去多余水分，再进行染 色，然后放到电镜下观察。 4242 7.4.5 分子检测法 如RT-PCR（反转录PCR）法：将待测样品 的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应， 合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列 设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主 中是否有病毒基因的存在及表达。 4343 PCR 琼脂糖凝胶电泳 最终产物紫外光观察 3-4 小时 4444 7.5 脱毒后防病毒再感染 4545 7.5.1 无病毒苗的隔离保存 通常无病毒苗原种要在隔离区，如海岛、山 地、新区等利用自然环境进行隔离种植保存 ，或采用隔虫网室种植保存。种植圃的土壤 也应该进行消毒，保证原种是在与病毒严密 隔离的条件栽培，并采用最优良的栽培技术 措施。同时要及时和定时对原种进行病毒的 检测和测定。可以保存利用510年 。 4646 针对病毒感染途径提出对应措施： 昆虫传染病毒，特别是蚜虫： 300目，孔径0.4-0.5mm。 土壤传染病毒（真菌和线虫为媒介）： 土壤要消毒，环境要整洁，及时打药。 接触传染病毒：贮存、运输和播种；工 具、衣服接触等。 4747 7.5.2 无病毒苗的长期保存 种苗经鉴定后，选择无病原种株系，回接于 试管内，长期保存无病毒原种。 方法： 培养基中加生长延缓剂：B9或矮壮剂，弱 光、低温、继代1次/2-3月。 低温保存：试管苗2cm，4，暗培养，可 保存1年左右。 超低温保存： -196，可长期保存。 4848 本章要点 本节课我们学习了植物快速繁殖的概念、方法 和步骤；植物病毒的特点、传染途径、运输方式和 对植物的危害性；茎尖培养脱除病毒的原理、获