[理学]晶体学课程课件.ppt

蛋白质晶体学 一、几何晶体学 1.点阵结构及晶胞 l(1)点阵结构定义： l 任何能为平移复原的结构称点阵结构。能使 一点阵结构复原的全部平移形成一个平移群 ua+vb+wc，称为该结构的平移群。u，v，w 为整 数，a，b，c 为三个非共面的向量。 l 点阵结构与其相应的平移群必存在下列关系： l (1)从点阵结构中某一点指向点阵结构中的每 一点的向量都在平移群中。 l (2)以点阵结构中任一点为起点时，平移群中 每一个向量都指向结构中一个点。 晶体的点阵结构 点阵分类： 分布在同一直线上的 叫直线点阵; 分布在同一平面的叫 平面点阵； 分布在三维空间的叫 空间点阵。 晶胞和晶格 l从一个空间点阵结构中一定可以划出一个平行六面 体，这一平行六面体称为晶胞。晶胞由晶体空间点 阵中3个不共面的单位矢量a，b，c所规定，其大小 形状用晶胞参数a，b，c，,表示。空间点阵按照 确定的平行六面体单位划分后，称为晶格。 晶格中的一个晶胞 晶格是晶胞在三维空间中的堆积 晶面指标 晶体的空间点阵可划分为一组平行而等 间距的平面点阵。晶体外形中每个晶面都和 一组平面点阵平行，可根据晶面和晶轴相互 间的取向关系，用晶面指标标记同一晶体内 不同方向的平面点阵族或晶体外形的晶面。 晶面指标 设有一平面点阵和3个坐标轴x,y,z相 交，在3个坐标轴上的截数分别为 r,s,t（以a,b,c为单位的截距数目） 截数之比即可反映出平面点阵的方 向。但直接由截数之比r：s：t表示 时，当平面点阵和某一坐标轴平行 ，截数将出现，为了避免数， 规定用截数的倒数之比 1r:1s:1t作平面点阵的指标 。由于点阵的特性，这个比值一定 可化成互质的整数之比 1r:1s:1th:k:l,所以平面 点阵的取向就用指标（hkl）表示。 r：s：t=3:3:5 1r:1s:1t=1/3:1/3:1/5 =5:5:3 晶面指标 l由平面（100），（010）， （001）围成的单个晶胞。用 100,010和001表示a、b、 c三个方向。实际晶体中的几个晶面。 晶面交角不变定理 2.最基本的对称元素 点阵结构是很有规律的结构，除了 上述的平移群能使它复原外，还存在 另外一些能使其复原的对称元素，如 对称中心（倒反），镜面，旋转轴， 旋转反轴，空间点阵结构中只能容纳 有限的几种旋转轴，即二重轴、三重 轴、四重轴及六重轴，所以其最基本 的对称元素只有七种。 旋转操作n旋转轴Ln l以一个假想直线为轴，绕此直线旋转一定 的角度可使图形相同部分重合。直线称为 对称轴，以L表示，分为n重旋转轴，其中 n360/, 为旋转角度。受点阵结构的限 制，晶体中只存在1，2，3，4，6几种旋 转轴，用L1， L2 ，L3， L4， L6 表示。 旋转轴 1.2.3.4.6重轴 1 6 234 镜面m和倒反操作i 镜面：镜像关系 倒反：类似于相机（ 凸透镜）等大成像 旋转反演操作反轴Lin l旋转倒反 i m 3i 3m 基本对称元素名称，矩阵表达式及其等效点表 l 名称 符号 矩阵表达式 等效点 l(1) 对称中心 i -1 0 0 X -X l 0 -1 0 Y -Y l 0 0 -1 Z -Z l(2) 镜面 m 1 0 0 X X l 0 -1 0 Y -Y l 0 0 1 Z Z l(3) 二重轴 2 -1 0 0 X -X l 0 1 0 Y Y l 0 0 -1 Z -Z l(4) 三重轴 3 0 -1 0 X -Y Y-X l 1 -1 0 Y X-Y -X l 0 0 1 Z Z Z l(5) 四重轴 4 0 -1 0 X -Y -X Y l 1 0 0 Y X -Y -X l 0 0 1 Z Z Z Z l(6) 四重反轴 4 0 1 0 X Y -X -Y l -1 0 0 Y -X -Y X l 0 0 -1 Z -Z Z -Z l(7) 六重轴 6 0 1 0 X Y Y-X -X -Y X-Y -1 1 0 Y Y-X -X -Y X-Y X l 0 0 1 Z Z Z Z Z Z 3.七个晶系 根据晶胞形状，也就是六个晶胞参数 ，以及晶胞中所容纳的特征对称元素，可 以把不同的晶胞分成七个类型，即七个晶 系。晶胞参数的特征是各个晶系的宏观表 现，是区分七个不同晶系的必要条件但不 是充分的条件，只有特征对称元素是区分 晶系的关键所在。 七个晶系及其特征对称元素 l晶系 特征对称元素 晶胞参数对称元素方向 l立方 4个按立方体的对角线 abca a+b+c a+b l 取向的三重轴 90 l六方 六重轴（平行于C轴） abc c a 2ab l 或六重反轴 90 l 120 l四方 四重轴（平行于C轴） abc c a ab l 或四重反轴 =90 l三方 三重轴（平行于C轴， abcc a l 按六方取）或三重 90 l 反轴 120 l正交 二个互相垂直的对称 abca b c l 面或三个互相垂直的 90 l 二重轴 l单斜 一个二重轴或对称面 abcb l 90 l三斜 无或仅有一个对称中心 abc l 4.32个点群 两个对称元素的结合就会产生新的对称 元素，在七个晶系中把特征对称元素与基本 对称元素进行组合，就会产生32种不同的对 称元素组合，这就是32个点群。 二重轴和镜面对称元素的结合 1.两个相交的二重轴必在它的垂直方向产生第 三个旋转轴。新轴的基转角是两个相交二重 轴夹角的两倍，即2。由于晶体学中 只有2，3，4，6重轴，因此只能是30， 45，60，90。 2.两个镜面相交，其交线是一旋转轴，旋转轴 的基转角是两个相交镜面夹角的2倍。所 以也只能是30，45，60，90。 3.二重轴与垂直它的镜面结合，其交点是一对 称中心。 5.14个布拉菲格子 l 有时为了获得较高的对称性， 把原有晶胞扩大，使成为带心的晶 胞，由此在七个晶系中可以得到14 种不同的布拉菲格子，不带心的晶 胞称为素晶胞（P），带心的称为 复晶胞（I，F，C）。 素晶胞（简单晶胞）和复晶胞 素晶胞带底心的晶胞 在选取复杂点 阵时，除了平 行六面体的顶 点外，只能在 体心或面心有 附加阵点，否 则将违背空间 点阵的周期性 ，所以只能出 现这四类晶胞 。 1. 简单三斜aP 2. 简单单斜mP 3. 底心单斜 mC(mA,mB) 4. 简单正交oP 5. C心正交 oC(oA.oB) 6. 体心正交oI 7. 面心正交oF Bravais lattice： 8. R心六方hR 9. 棱方hP 10.简单四方tP 11.体心四方tI 12. 简单立方cP 13. 体心立方cI 14.面心立方cF 可以发现，除了在正交 晶系中四类晶胞可同时出现外，在其他晶系中由于受到 对称性的限制或是不同类型阵点可相互转换的缘故，都不能同时出现。 如：立方晶系中，底心点阵与该晶系的对称性不符（在4个按立方体对角线排列的方向上有 三重轴），所以不能存在。 6.230个空间群 对称元素和平移向量相结合，可以得到一类 含有平移的新的对称元素，即螺旋轴和滑移面。 旋转轴和平移向量结合得到螺旋轴 对称面与平移向量结合得到滑移面 各种对称元素的符号图示 把所有类型的对称元素与32个点群、14个布拉 菲格子，按照一定规则的组合就可得到230个空 间群。 螺旋旋转操作螺旋轴nm l旋转平移 螺旋旋转操作螺旋轴nm l旋转平移（n为轴次，m为滑移量，mn） 图：三重轴（左）和三重螺转轴（右 ）；后者通过将一个分子旋转120后 再平移半个晶胞距离与另一个分子相 关联。 31 11种螺旋轴 21 31，32 41，42，43 61，62，63，64，65 反映滑移操作滑移面g l反映平移 5种滑移面 a,b,c,n,d 空间群的记号及其意义 P1 C2 P212121 I4122 R3 P6122 P23 第一个字母表示Bravias格子类型，接着是 对称元素的记号，对称元素所在的位置表示 该对称元素在相应晶系中的方向。 如何从空间群（Space group）记号知道晶系： 1.如果在第一位出现高次轴（3、3、4、4、6、6） 就相应于三方、四方、六方晶系 2.如果只有一个方向有对称元素且不是高次轴则 ()有2或21轴或镜面滑移面的是单斜晶系 ()仅有i或无对称元素的是三斜晶系 3.如果三个方向都有对称元素且仅仅是2，21镜面或 滑移面的则是正交晶系 4.如果在第二位方向上有3或3的则是立方晶系 不对称单位 由于晶胞中有对称元素，所以不是整个晶胞内对 象都是独立的，晶胞中最基本的独立单元叫不对称 单位。 不对称单位内的所有对象通过晶胞所具有的对称 元素的操作可得到整个晶胞所包含的对象。 一个晶胞可以有多种不同形状的不对称单位，但 它们的体积是相等的，等于晶胞体积除以等效点数 二、X射线晶体学 Bragg定律 lBragg定律 l晶体对X-射线的衍射可以看成晶体中原子平 面对X-射线的反射。在同一晶面中所有原子 的反射线的相位是相同的，与该晶面平行的 一组平面上的原子，要满足Bragg方程时才 有相同相位的反射。 l2dhklsin =n l图 l l2dhklsin =n l对某一晶体来 说dhkl是确定不 变的，当一定 时只有特定的 值才能满足以 上方程，也就 是说只有晶体 处于某一方位 时才能产生衍 射。 1.倒易点阵 倒易点阵简便而又形象地说就是衍射 照片上的一组点，晶胞（又称正空间）中 的点用XYZ来表示，倒易点阵（又称倒易空 间）中的点用HKL来表示。 X射线晶体学处理倒易点阵的对称性。 2.11个劳埃群 在倒易点阵的对称性中，几何晶体学 中的七个晶系和基本对称元素都不变，在 不考虑反常散射效应的情况下，晶体衍射 对称性均较原晶体的几何晶体学对称性多 一个对称中心，这样使几何晶体学中的32 个点群变成X射线晶体学中的11个Laue群 。 3.120个衍射群 几何晶体学中带有平移向量的对称元素即螺旋 轴、滑移面，会使衍射照片中的特定的点的强度为 零，也就是说这些衍射点，在照片中消失了，称为 系统消光。 复晶胞也就是带心的Bravais格子，也会使一些 特定的点强度为零，产生系统消光。 通过系统消光规律的辨识，就可知道几何晶体学 中的230个空间群。遗憾的是，不是所有的空间群都 能通过系统消光规律的辨识来唯一确定，通过衍射 试验只能把230个空间群分成120个不同的衍射群， 也就是说同一个衍射群有可能对应于几个空间群。 system absence of lattic type condition Bravie lattic all hkl 1. h+k+l=2n I 2. h+k=2n h,k,l h+l=2n or all odd F k+l=2n all even 3. h+k=2n C (h+l=2n) (B) (k+l=2n) (A) 4. -h+k+l+3n R system absence of screw axis h00 h=2n 21,42 h00 h=4n 41,43 0k0 k=2n 21,42 0k0 k=4n 41,43 00l l=2n 21,42,63 00l l=3n 31,32,62,64 00l l=6n 61,65 三、晶体结构测定 1.相角问题 从晶体X衍射图的形状及对称性可 以推算晶胞的大小和空间群（可能不 是唯一的）。用X衍射方法解晶体结构 就是要进一步知道晶胞中原子的分布 也就是原子坐标。 根据上述公式只要知道每一衍射点的|Fhkl|和 (hkl)就可算出晶胞中每一点的电子密度，从 中就可得到原子坐标。在衍射实验中每一衍射点 的实验强度信息可以记录，由此可以推出|Fhkl| ，但每一衍射点的相角信息(hkl)却丢失了。 因此解晶体结构的关键是相角问题，有了相角， 原子坐标就迎刃而解了。 2.Patterson法 (1)Patterson函数 其意义是晶胞中相距为向量(uvw)二点的电 子密度乘积的平均，显然如果两个原子间的 距离正好是向量(uvw)，那么它的p(uvw)值 最大，所以Patterson函数图上的峰反映了 原子间的向量，由于计算p(uvw)时没有相角 问题，有了实验测得的强度就可以算。问题 是如何从(uvw)峰得到原子坐标。 (2)Patterson峰的特性 A.峰的数目 N(N-1)+1。 B.峰的高度 与两个原子的原子序数ZiZj成正比。 C.对称性总具有对称中心 i，对称元素的平移部分 消失即螺旋轴、滑移面变成旋转轴、镜面，所以只 有24种类型（11 Laue群加上各个 Laue群可能的格 子类型）。 D.Harker截面，Harker峰。等效点之间的向量峰， 称Harker峰，Harker峰所在的平面，称Harker截面 。由旋转轴联系的两个原子向量峰一定落在一个特 殊的Harker截面，由镜面、滑移面联系的两个原子 向量峰一定落在一条特殊的线上。 3)Patterson法解结构一般步骤 A.测定晶胞参数及空间群 B.测定晶胞中分子数 n（根据晶体密度计算或估计） C.根据空间群的等效点列出Patterson峰表Harker峰 D.计算 Patterson 函数（矢量图） E.根据峰表解出重原子坐标 F.由重原子(或已知坐标的原子)计算相角和电子密度 图 G.从电子密度图找出未知原子的坐标 H.重复 F.G. 直到找出全部原子坐标 I.结构修正 3.直接法简介 我们说从衍射实验中，强度信息可以记录， 相角信息丢失了，但我们仅仅从衍射强度最终又 可得到原子坐标，说明实际相角没有真正的丢失 ，只是不能像强度那样直接记录，变成显而易见 的，它是隐含在强度信息之中的，因此选择一些 较强的衍射点，通过这些衍射点之间的相角关系 信息，最终导出这些衍射点的相角，然而用这些 衍射点计算E图（类似于电子密度图），就可以 得到某些原子的坐标信息，利用这些原子坐标可 以计算所有衍射点的初步相角及电子密度图，最 终解出全部结构。 四、蛋白质晶体学 4.1 蛋白质分子与小分子差别 (1)蛋白质分子大多是C、H、O、N、S组成，少数 有金属离子如Cu、Zn等，因此，想用 Patterson 法来解大分子结构要在晶体中引入定位的重原子 。 (2)组成蛋白质大分子的单个氨基酸有不对称碳 原子，而蛋白分子中又只有L型氨基酸，因此蛋 白质晶体的对称元素只有对称轴，而没有 m、i 。这样230空间群，在蛋白质晶体中只有65种仅 含对称轴的空间群。 (3)蛋白质分子分子量较大，因此，不能用简单 的重原子的相角代替全体原子贡献的相角。 4.2蛋白质晶体结构测定基本步骤 1结晶 2数据收集与处理 3相角测定 4相角改进 5电子密度计算和解释 6修正 4.3结晶 4.3.1结晶过程相图 4.3.2影响结晶的因素 蛋白质纯度,微观均匀性. 蛋白质浓度 沉淀剂浓度 (NH4)2SO4，各种分子量的PEG、 MPD (二甲基 2,4戊烷二醇). 影响有效浓度 添加剂 去污剂、金属离子、还原剂 DTT， 针对蛋白本身 性能 pH 缓冲液类型 有机缓冲液现更常用，磷酸缓冲液易生成 磷酸盐。影响残基的解离常数 离子强度 影响静电相互作用 盐析盐溶也是影响有效浓度 温度 一般不敏感 生复合物晶体 抑制剂、辅因子、底物、Fab片段 截去柔性过大的C端或N端，以甘油作辅助溶剂 长突变体蛋白 如何选择突变位点是关键 4.3.3结晶方法 最常用的气相扩散法(悬滴、坐滴)， 平衡透析法 4.4数据收集与处理 4.4.1历史发展 4.4.2数据收集时考虑的参数 晶体到探测器的距离：晶胞越大该距离应加大， 以免衍射点重叠。 分辨率：晶体衍射能力强则应收高分辨率数据， 角大分辨率高但收高分辨率数据时必定会牺牲 低分辨率数据质量。所以对一个新蛋白来说，也 可先收一次中等分辨率的数据，以满足起始工作 的要求。如用分子置换法，则最初用4A数据也可 以了。多对同晶置换法跟踪肽链走向时有3A电子 密度图也足够了。低分辨率电子密度图比高分辨 率电子密度图连续性好，当然粘连也严重。 徊摆角度：在不增加衍射点重叠条件下，徊摆角 尽量大，这与晶胞大小有关。100A左右大约每幅 画面12 曝光时间：取决于晶体衍射能力和晶体在X射 线下的寿命（或稳定性）。如果衍射能力弱，寿 命又短，则要在这二者之间取得平衡，减少曝光 时间可收集更多画面得到一套完整的数据，但衍 射点强度相对弱，数据误差可能大一些。加长曝 光时间可能要两颗晶体才能收集一套完整数据， 则数据合并时也会加大数据的误差。 4.4.3数据收集中的一些技巧 在一定分辨率下衍射点数的估算 (4/3)(1/dm)3/(1/v)n = (4/3)(v/dm) 减少盲区：用较短的波长（这在同步辐射中能实现 ）或把晶体对称轴略偏旋转轴几度（这比较费时 ，不值得尝试） 最有效的收集数据，主对称轴为徊摆轴，间隔地 分段收集，减少晶体损伤与吸收，用较短波长 增大反常散射效应 用接近元素吸收边的波长 4.4.4数据处理（Denzo程序） 我们知道每幅画面上的衍射点的位置及其指标 是有许多因素决定的。当然晶体的晶胞参数是最重 要的决定因素，其次是晶体对X射线的取向。另外 晶体的镶嵌度(mosaicity)，入射线的位置，每幅 画面迥摆角的范围，晶体到IP的距离等各种因素都 对衍射点的位置有影响。这些参数有的是完全不知 道的，有些虽知道但还需更精确的数值，以便使预 测点和实际点更符合。为了得到正确的衍射强度， 要选择适当的衍射点大小(spot)和积分面积(box) 。执行Denzo程序就能使未知的参数如晶胞参数晶 体取向参数变成已知，不精确的参数更精确了。 使用Denzo一般分三步. 第一步自动指标化，得到晶体的格子类型，晶 胞参数，晶体取向参数，X射线位置座标等信息。 如果显示的预测点和实际衍射点基本一致，则自 动指标化过程正常。并输出14种格子和晶胞参数 变形表，晶体取向参数等信息。选取最高对称性 而又有最小变形的格子，作为你的晶体可能的格 子类型。 第二步用Fit命令修正有关的参数。一般先修 正晶体取向参数，晶胞参数和射线位置参数，并 从中等分辨率逐渐向高分辨率扩展。注意有些参 数是高度相关的，不要同时修正，除非你有高质 量高分辨率的数据。当某些参数不再需要修正时 ，也可固定这些参数，修正其它参数。 第三步调节镶嵌度和点的形状和大小，以求得 衍射点的积分强度。如果实际衍射点多于预测点则 增加镶嵌度值，反之则减小。预测点的形状和大小 是否与实际点吻合，可通过Image Window窗口考察 ，并改变椭球长短轴的值使两者更好的吻合。 执行Denzo程序输出一个文件叫“.x”，它含有 一些参数及衍射点指标hkl，强度I等13项信息。修 正结果好的话2值应接近1或在2以下。当你第一幅 画面处理完後，可用批处理方式处理所有其它画面 。得到一系列的“.x”文件，供Scalepack程序用 。 Scalepack 的说明 由于数据收集过程中晶体衍射能力有衰减，不同方位 时晶体对射线的吸收情况也不同，以及射线强度的涨落 等因素，所以对称性联系起来的等效衍射点，它们之间 的强度并不相等。因此，要选择一幅画面作为参考，计 算每一幅画面的比例因子k和B因子，用k因子B因子校正 後，把Denzo输出的所有“.x”文件中的等效点进行平均 和合并；并用全部数据对晶胞参数，晶体取向，镶嵌度 进行更精确的修正。最後给出一套完整的数据文件 “.sca” 及对数据的统计分析。Scalepack不仅可以比 例合并从一个晶体来的衍射数据，也可有其它的应用。 用于重原子衍生物的搜寻，即收集几幅衍生物的画面与 母体数据相比，以检验是否是一个有用的衍生物；多套 母体数据的合并；对某些空间群与另一套数据合并时的 重新指标化；完整的两套数据比较；反常散射信息的探 测；高分辨率数据和低分辨率数据的合并。决定晶体所 属的空间群。 4.4.5数据质量评价 完整度（completeness）:80%以上，分 壳层完整度随分辨率降低 丰度（redundancy）：23倍以上 Rmerge:总体3-11% 分壳层的R随分辨率 而升高，但最高壳层不应超过25为好 4.5相角测定 多对同晶置换法 分子置换法 多波长反常散射法 直接法 4.5.1多对同晶置换法 多对同晶置换法基本原理 FpFhFph |Fp|、|Fph|可从实验得到。设法解得Fh |Fh|exp(ih)有了|Fp|、|Fph|、|Fh|及h理论上 可以得到二个 Fp的解，如果有两个以上的重原子 衍生物，即有|Fph1|、|Fph2|就有可能得唯一的Fp 了。这就是多对同晶置换原理的基本思想。 一般步骤：1用浸泡法制备重原子衍生物 2收集母体和重原子衍生物的衍射数据 3确定重原子位置 4修正重原子参数 5计算相角及电子密度图 4.5.1.1重原子衍生物制备 基本上靠运气和经验。可以从蛋白质分子的 氨基酸组成来考虑。自由巯基常是Hg试剂的结合 位点，His也常是重原子的配体，Met中S常和Pt 试剂结合，镧系锕系的金属离子与Glu，Asp 重原子衍生物鉴定 同晶度好 强度变化明显且衍 射强度的平均变化不随分辨率提高而增加，结合 位点少而每个结合位点占有率高 4.5.1.2确定重原子位置 由于大分子和小分子的明显差别，不 能用小分子的传统Patterson法测定 大分子中重原子的位置。一般要用各 种差值 Patterson，衍生物和母体蛋 白的强度差。想象为只有重原子在蛋 白质分子晶胞内。 为了求差一定得把两套强度数据统一 在同一水平上才能相减 同晶差值Patterson法 (Fiso)2=(kFPH - FP)2FH2Cos2(PH -H) 反常差值Patterson法 (Fano)2=(FPH(+) - FP(-)2FH2Sin2(PH-H) 优点是同一晶体的数据与比例因子无关，缺点是反常差 一般比同晶差小，要求强度测量更精确 加和差值Patterson法 (Fiso)2 + (Fano)2FH2 这两者的加和近似一常数。同晶差贡献小的衍射点则反 常差贡献就大。两者结合比单独使用任一种函数要好。 联合差值（Matthews加和） |FH|2=|FP|2+|FPH|22|FP|FPH|1-(f/f)( FPH(+) - FPH(-)/2|FP|1/2 4.5.1.3共同原点 由于各衍生物在确定重原子位置时所取的坐标原点不同 ，它们对相角会有影响，解决办法 1 用第一个重原子衍生物得到母体蛋白的初步相角，然后用 差值Fourier方法确定第二个重原子衍生物的重原子位置，此 时所得的第二个衍生物中重原子位置与第一个衍生物有相同 的原点。 (xyz)=|FPH2| - |FP|exp-2i(hx+ky+lz) + iP 2 Rossmann法计算以(|FPH2|-|FPH1|)2为系数的Patterson加和 (|FPH2|-|FPH1|)2=(|FPH2|-|FP|)-(|FPH1|- |FP|)2 =(|F|iso)2 - (|F|iso)12 这类Patterson图中有每个衍生物中的重原子自身的向量峰， 而两种衍生物中的重原子间交叉向量表现为负峰，找到该交 叉向量就可推出第二个衍生物中重原子按第一个衍生物所取 的原点为原点时的正确位置。 4.5.1.4重原子参数的修正 1 有好的FH(obs)则可用简单的最小二乘法修 正，即令 WFH(obs)-FH(calc)2为极小值。 2 相角修正。如果有初步的蛋白质相角P, 则用WFPH(obs) - FPH(calc)2为极小值 ,FPH(calc)=| FP(calc) + FH(calc)| 4.5.1.5蛋白质相角 按照一定的间隔（如30）计算不同 p值下的该相角的几率，然后在最大几率 的角度附近再按每5的间隔计算该相角的 几率，最终确定同晶置换相角。 4.5.2分子置换法 用已知的同源蛋白的分子结构，置换到待测晶体中目标分 子的位置，得到晶体结构的初步模型，计算它的相角，再 从电子密度图进一步改进模型。 空间两个相同的分子X2，X1，一定可以通过旋转和平移使 两个分子重合。 X2CX1d C就是旋转矩阵，d就是平移向量。 模型分子的选取，根据氨基酸序例比较，同源性越高得到 正确解的可能性越大。模型分子结构精度越高越容易得到 正确解。残基不同则可用ALA或GLY取代。如果有大段的插 入，则可把它删去。 由于目标分子结构并不知道，所以不可能用相应原子的坐 标去叠合，只能用分子的某些特性去叠合。分子置换法就 是利用分子内原子间的向量峰来叠合，如果两个分子相似 ，则它们分子内原子间向量峰就很相似。 4.5.2.1旋转函数 R(,)vP1(X)P2(CX)dX P1是已知分子结构的模型晶胞的Patterson函数 P2是待测分子的晶胞的Patterson函数 这是交叉旋转函数，就是将两个Patterson矢量峰叠合， 当两个分子取向一致时两个Patterson函数的乘积就会得 到最大值，形成高峰。 自身旋转函数。如果P1，P2都是目标晶胞的Patterson函 数，则称为自身旋转函数。它可用来研究不对称单位内 有多个分子或亚基时的取向关系，也就是非晶体学对称 性。 自身向量峰即一个分子内的原子间向量峰，这是最能反 映分子本身结构特点的向量峰。旋转函数计算时要要尽 量避免交叉向量峰，即分子间的原子间的向量峰。 如何避免交叉向量峰？ 模型晶胞的选取：模型晶胞越大，则它的分子 间Patterson向量峰离原点越远，因此，在一 定的积分半径范围内，分子间的交叉向量峰越 少，但计算工作量加大。这两者要取得平衡。 一般取分子最小径线积分半径分辨率 积分半径：分子线度60-80%，分子直径75-80% 在计算交叉旋转函数时一般用尤拉角坐标系 1，2，3 在计算自身旋转函数时一般用球极 坐标系 (,) 4.5.2.2平移函数 当分子取向决定后，就要找到分子在晶胞 中的确切位置，平移函数的计算就是为了确定 分子在晶胞中的位置。 T(t) P0(u)P(ut)du 平移函数一般在二维平面内计算，两个不 同方向的截面可确定三个分量，平移函数的峰 值主要由分子间的向量峰决定的（附图）。另 外，R值的搜索也可确定平移向量。 4.5.3多波长反常散射法 4.5.3.1反常散射确定蛋白质相角 单对同晶置换加反常散射法确定蛋白质相角 有反常散射原子的原子散射因子 f=f0+f+if 图9.2 图9.3 这两个图都说明利用一个重原子衍生物的 数据可以唯一确定蛋白质的相角，但是这两套 蛋白质相角是不同的，原因是重原子的位置不 同（xyz）与（-x,-y,-z）。 4.5.3.2利用反常散射确定分子绝对构型 先在正确的右手坐标系中确定F(hkl)和F(-h,-k,-l)，然 后分别用两套坐标(即一为xiyizi另一为-xi,-yi,-zi)计算 Fc(hkl)和Fc(-h,-k,-l)，最后比较Fc（h）/Fc（-h），Fo（h ）/Fo（-h）大于1或小于1，若两者一致，则所选绝对构型是 正确的。对大分子情况更复杂。以上节为例作一说明。利用 这两套不同的相角，对第二个重原子衍生物做差值Fourier图 。 |FPH2|FP|一套相角 |FPH2|FP|另一套相角 正确的绝对构型会在第二个重原子衍生物的重原子位置显 示最高的峰。 磷酯酶晶体用第一个Pt衍生物得到的两套相角SIRAS对第 二个Hg衍生物作差值Fourier图。 Hg1（峰高）Hg2 (1)错误构型342616 (2)正确构型5011036 4.5.3.3多波长反常散射法应用前提 Se代甲硫氨酸，每150a.a一个Se就可成功应 用此法。 要求：有可调波长同步辐射源，要精确测量 Friedel点对的反常差，也就是数据精度要高， 波长选择近重原子吸收边，另外两个波长的强度 差别也要大，F = |F(i)| - |F(j)|， |F(i)|（1/2）|Fh|Fh| 4.5.3.4多波长反常散射法基本原理 结构中所有原子的非反常散射部分与反常散射部分分开 最后推出 |F|2=|FBA|2+p|FA|2+|FBA|FA|qcos(BA-A)+rsin(BA- A) p=(f) 2+( f)/( f0) 2, q=2f/ f0，r=2 f/ f0 p，q，r是函数，从原子吸收系数得到 |F|2可从实验测得对每一Friedel点对即(hkl)(-h,-k,- l)，|FBA|，|FA|，(BA-A)是不知道的，但它们与 无关，对Friedel点对是相等的，仅BA-A符号不同。 一个对这三个未知数给出二套等式，所以原则上用两 个不同波长可以解出每一反射的FBA，|FA|和(BA-A) 。 要计算蛋白质电子密度图需要BA。 用|FA|2作系数计算Patterson图，解出重原子A 位置，然后由A的位置计算A，再从(BA-A) 值和A得到BA。 由于在计算A结构时没有考虑反常散射，所以 得到的是两种对映体的结构都可能的。（也即 原子位置可以是（xyz）也可以是（-x,-y,-z ） 每个波长的f，f是原子吸收系数的函数 ，原子吸收系数可从实验测得。 4.6相角改进 4.6.1溶剂平滑化 方法基础是蛋白质分子有较高的电子密度，而 溶剂区电子密度很低，对电子密度作一改造 i=kwii 先确定分子边界，溶剂体积开始时比估算的要 略小1015，以后逐步增加，至少比估算值 低5，这是为了避免把分子表面的loop区去掉 ，在溶剂区给予溶剂密度的平均值，然后从图 反变换得到相角。 流程图 4.6.2分子平均 如果不对称单位内有多个分子，则可利用 非晶体学对称性对多