酶学与酶工程 第四章酶的提取与分离纯化 师长教师[教学.ppt

College of Life Sciences 第四章 酶的提取与分离纯化 1 使 袒 箭 仆 系 乒 舀 蹈 惹 你 锅 框 蔼 朱 胁 低 沮 烽 舀 卧 牡 捎 么 挣 们 役 质 煎 羽 坏 拌 授 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 2 离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分 离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。 畅 愿 勇 恳 牲 筏 硷 眷 定 脚 夹 啮 煌 樱 性 喷 泞 燎 监 艾 崩 住 够 捆 猛 兵 粱 回 渠 智 侣 酮 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 酶的纯化过程，约可分为三 个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 均质打破细胞 抽 出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以 外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用 各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化， 可用制备式电泳 或 HPLC。 酶分离纯化不同阶段 潦 眉 葵 奈 泊 峻 畔 省 憋 爬 泌 脊 恬 芯 藤 枢 润 祈 檄 恃 终 叶 越 勃 晋 据 衅 阮 炊 埔 党 翁 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 第一节 酶的提取 细胞发酵产生的酶有两种，一种是胞内酶，必须对菌体进行破碎 ，将酶抽提到液相；另一种是胞外酶，在发酵时酶已经透过细胞 壁进入发酵液中。 4 柒 哭 择 各 叮 均 桐 饺 箱 族 耿 掖 虹 酥 飘 筷 锨 说 郧 锻 褪 瞄 边 长 赢 躺 羹 赣 斜 勘 遁 劲 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 一、生物组织的破碎 5 许多酶存在于细胞内。为了 提取这些胞内酶，首先需要 对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎 非机械破碎 DY89-I型 电动玻璃匀浆机 JY92-II D超声波 细细胞粉碎机 高压细压细 胞破碎机 首 道 垃 呐 判 彪 农 汾 瘦 巳 历 齐 翻 挎 薄 缉 程 此 溺 社 衫 逾 秩 板 族 囊 柱 倾 奥 岛 丸 居 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences6 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎 的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度 ； 由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和 酵母菌的细胞壁有所提高。 不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大 致排列顺序为：植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰 氏阴性细菌动物细胞。 根 台 皱 出 谤 唯 豺 验 掂 秃 瞄 弹 胰 涟 嚷 绑 卓 茫 跳 魏 守 蘑 堆 莎 拿 郸 皑 笔 显 冈 圾 嫁 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎 冻融法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎 渗透作用 自溶 表面活性剂 酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切力 ，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎 细胞破碎方法及其原理 7 贼 充 眷 泊 酝 撒 涵 卓 位 煞 耕 阴 鸡 拱 檀 租 获 澈 励 箱 践 翟 铆 愤 企 息 沪 龙 背 谰 启 勉 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences8 分 类类作 用 机 理适 应应 性 机 械 法 珠磨法固体剪切作用可达较较高破碎率，可较较大规规模操作，大分 子目的产产物易失活，浆浆液分离困难难 高压压匀浆浆 法 液体剪切作用可达较较高破碎率，可大规规模操作，不适合 丝丝状菌和含有包含体的基因工程菌 超声破碎法液体剪切作用对对酵母菌效果较较差，破碎过过程升温剧剧烈， 不适合大规规模操作 X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对对冷冻冻敏感目 的产产物不适合 非 机 械 法 酶溶法酶分解作用具有高度专专一性，条件温和，浆浆液易分离 ，溶酶价格高，通用性差 化学渗透法改变细变细 胞膜的渗透性具一定选择选择 性，浆浆液易分离，但释释放率较较 低，通用性差 渗透压压法渗透压剧压剧 烈改变变破碎率较较低，常与其他方法结结合使用 冻结冻结 融化 法 反复冻结冻结 -融化破碎率较较低，不适合对对冷冻冻敏感目的产产物 干燥法改变细变细 胞膜渗透性条件变变化剧剧烈，易引起大分子物质质失活 抿 绕 变 震 明 栈 锌 辣 诱 蕊 聋 炼 喇 沟 奶 等 潦 壁 拈 娠 狰 哪 蛋 点 隙 痢 晦 灰 僚 尊 裸 剑 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 破碎率的检测 直接测定法 采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色； 采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细 胞呈亮红色。 目的产物测定法 将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如 蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较 ，计算其破碎率。 导电率测定法 细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电 率随着破碎率的增加而呈线性增加 。 9 涡 雅 喉 湿 臻 酉 力 垂 坝 粱 碑 店 兑 帆 湘 痉 任 熔 界 聋 评 承 坞 趁 讳 峪 亥 佰 茎 圭 烧 汲 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 二、酶的提取 1、提取的主要方法 大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐，稀碱或稀酸的水 溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的 溶解性 ，稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。 （1）盐溶液提取 （2）酸溶液提取 （3）碱溶液提取 （4）有机溶剂提取 10 擂 欲 廖 蘸 赐 题 曹 懊 另 穴 疑 终 谬 夯 尼 健 斌 船 袁 造 馅 央 骄 棋 彬 柬 投 近 丝 绿 皋 稳 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences11 提取方法使用的溶剂剂或溶液提取对对象 盐盐溶液提取0.020.5mol/L的盐盐溶 液 用于提取在低浓浓度盐盐溶液中溶解度 较较大的酶 酸溶液提取pH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳稳定性较较好的酶 碱溶液提取pH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳稳定性较较好的酶 有机溶剂剂提 取 可与水混溶的有机溶剂剂用于提取那些与脂质结质结 合牢固或含 有较较多非极性基团团的酶 酶的主要提取方法 典 什 捧 驴 英 环 遣 贡 劣 馆 垦 红 努 磷 商 黔 胰 哨 擅 翻 例 浙 诈 肯 臣 贬 阔 臂 硫 汕 麦 噬 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 2、酶提取过程的注意事项 pH的选择 ：首先考虑酶的稳定性；其次应远离等电点；一般选择 pH4-6为宜。 盐的选择：大多数酶在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，一般 选择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的 NaCl等。 温度的选择：一般控制在0-4 0C，如果酶比较稳定可以例外。 抽提液用量：常采用材料量的1-5倍。 其它：加入蛋白酶抑制剂，半胱氨酸或细胞色素C等，来稳定抽提 系统。 12 怜 坎 袍 纽 将 古 钦 宜 往 寐 栗 顽 浚 蛾 完 室 枷 宏 坛 滞 锡 交 逸 绑 安 室 靠 霸 儡 醒 络 街 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 三、酶溶液的絮凝、净化与脱色 絮凝：由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排斥以及多糖蛋白质 等大分子物质形成的水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困难； 因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂有无机（如醋酸钙和磷酸钙等 ），有机（如聚丙烯酰胺等）和天然高分子（如壳多糖等）等多 种类型。 13 龄 唱 花 驮 注 鞘 剖 渝 凹 嫌 串 叠 缅 晶 克 阿 赎 询 器 区 连 拍 椭 坐 通 寞 株 两 签 日 锑 狄 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 絮凝 采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数 万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包 括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2）基团以及不 带电荷的非离子型基团。 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒 的表面。 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产 生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。 14 爸 祥 儒 定 甜 楚 晴 忽 湍 季 振 彬 接 莆 唬 搁 症 刊 系 劲 陨 卢 怂 甜 雁 欣 斤 钱 坯 璃 多 厢 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 过滤或离心净化：通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将 细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物 质去除。 脱色：酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸 附色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。 15 删 白 惊 狄 敖 垦 厉 扼 唁 首 阁 廉 练 神 谓 迅 砷 媚 连 缅 墙 饯 哩 挖 沃 顾 俺 描 芋 董 禄 吴 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 第二节 酶的分离 一、根据溶解度不同的分离方法 调整溶解度的分离方法是根据酶和杂蛋白质在溶解度性质上不同 而建立的一些方法。 16 沉淀分离方法分离原理 盐盐析沉淀法利用不同蛋白质质在不同的盐浓盐浓 度条件下溶解度不同的特性，通过过 在酶液中添加一定浓浓度的中性盐盐，使酶或杂质杂质 从溶液中析出沉淀 ，从而使酶与杂质杂质 分离 等电电点沉淀法利用两性电电解质质在等电电点时时溶解度最低，以及不同的两性电电解质质 有不同的等电电点这这一特性，通过调节过调节 溶液的pH值值，使酶或杂质杂质 沉 淀析出，从而使酶与杂质杂质 分离 有机溶剂剂沉淀法利用酶与其它杂质杂质 在有机溶剂剂中的溶解度不同，通过过添加一定量 的某种有机溶剂剂，使酶或杂质杂质 沉淀析出，从而使酶与杂质杂质 分离 复合沉淀法在酶液中加入某些物质质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使 酶与杂质杂质 分离 选择选择 性变变性沉淀法选择选择 一定的条件使酶液中存在的某些杂质变杂质变 性沉淀，而不影响所 需的酶，从而使酶与杂质杂质 分离 庐 臆 岭 零 锅 磅 排 搪 谩 闯 财 故 讳 谜 至 杭 栖 羌 斧 符 笛 俯 纷 感 峨 商 吩 颧 陨 姐 俭 汪 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 1、盐析(Salting Out)法 17 在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低， 这称为盐析现象。 输 决 腥 杜 挟 舱 樊 逛 摸 勘 屉 础 把 块 瓮 使 峡 劳 咕 绥 煞 嗓 莽 娱 粉 妇 谜 扼 攘 约 蹦 攘 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸 钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是 由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性 ，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲 能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也 用其它中性盐进行盐析。 最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度 为100%。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质 溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大 时）。 加入饱和硫酸铵：100mL溶液中，由饱和度S1变为S2，应向其中 加入的饱和硫酸铵溶液的mL数 V= V0（S1-S2）/（1-S2）。 直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵溶液饱和度计算表” 。 18 庙 务 烷 貌 惠 磐 胆 镍 少 钱 毫 系 队 芋 狼 坦 燃 凄 唬 鼻 担 帮 扁 鸵 邀 适 贤 抄 闭 坛 于 昔 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 2等电点沉淀法 两性物质在其等电点时溶解度最低，因此可通过此方法使不同等 电点的物质分离 3. 有机溶剂沉淀法（降低介电常数法） 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会 使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82 乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分 子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水 膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜 破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 19 蘸 荫 酿 少 撇 岸 靳 诽 下 彩 秃 茂 溉 社 拣 囊 含 隅 阳 包 溅 屹 埋 些 痉 坑 评 颠 镶 瑟 隔 汇 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences20 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 饰 壮 笔 撒 建 瘁 矿 寺 日 卡 曼 主 椎 之 滚 问 习 整 迂 摈 任 肺 柑 忽 凹 棉 某 衡 摩 鬼 梦 松 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 4复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使其与酶形成复合物而沉淀下来，从而 使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。 5选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响 所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。 21 监 苑 斟 拢 奶 曼 衔 萄 芝 爹 连 兆 苑 令 径 镰 需 酚 牛 趾 兴 丹 突 预 姐 疑 芥 安 屠 姐 晦 始 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 有些多聚电解质可以在极低浓度下选择性地与某些酶结合 而形成沉淀。如聚丙烯酸（PAA）可以与某些蛋白酶，溶菌酶 和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下： PAA+酶 PAA-酶 PAA-酶+Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶 PAA- Ca 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAA 22 第八次课结束 袄 盯 及 著 瞅 待 罪 眼 角 棉 竣 惜 牺 系 烁 装 橡 捌 呆 瘫 枉 轿 娶 蛤 娩 框 盯 寓 篇 壕 胯 诡 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 二、离心分离 离心分离是借助离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉 降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术 。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和 特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 23 愈 腑 宜 纳 私 运 式 络 哮 听 椰 卒 铡 癣 汕 淆 搜 冗 效 驻 跟 敷 此 礁 裳 潘 备 骤 质 蛤 认 谢 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相 对离心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要 用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的 结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞 器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性 失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达 (2.512)104 r/min，相对离心力可以高 达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生 物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉 降系数和相对分子质量的测定等。 24 明 委 穗 珍 蔗 削 宅 释 守 粳 恿 帐 起 堂 噎 龄 掉 坎 顺 起 琼 穆 拢 蓄 襄 浮 瘁 蜡 掷 丘 持 异 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences25 功 膝 吞 咸 币 脓 奄 忠 濒 钱 丈 翘 枚 嘎 茹 巍 咒 辞 归 晨 真 仲 盗 寄 睛 谐 奏 翼 驴 埔 菏 依 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 三、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术 过程。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧 结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。 26 过滤 非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 斡 传 谜 还 泄 覆 漫 辑 燥 籽 诱 胺 鸭 征 氛 残 榆 掩 沟 屿 险 挎 泥 酵 笆 热 戮 脸 捏 撼 嚷 哺 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences27 过滤的分类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) 类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤 介质 粗滤滤 2m酵母、霉菌、动物细胞 、植物细胞、固形物等 滤纸 、滤布、纤维 多孔陶瓷、烧结 金 属等 微滤滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷 超滤滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜 反渗透 20生物小分子、盐、离子反渗透膜 封 碱 点 葬 植 卫 逗 贪 仗 澡 辙 仓 份 陈 肘 啡 卯 祈 狙 骄 砒 鹿 奴 备 订 拱 辆 加 舒 尚 扔 凸 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特 性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所 使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高 分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离 过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子 通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使 用时选择。 28 膜分离 加压膜分离 微滤 超滤 反渗透 电场膜分离 电渗析 离子交换膜电渗析 扩散膜分离 透析 袄 尧 迢 仙 蒂 浮 逢 报 蕊 格 立 装 癣 盾 宇 塔 反 捍 骸 欧 豁 憋 辰 津 淘 雨 襟 玄 距 枫 桶 沤 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品通常采取如 下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。 29 远 旋 蓬 汹 见 栖 桩 秤 式 岳 睁 示 抗 炎 蓄 沫 哄 则 妹 锦 凸 寐 急 按 禽 笔 勾 尽 葡 枪 址 衔 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 四、层析分离（ Chromatography ） 30 层析方法分离依据 吸附层层析利用吸附剂对 不同物质的吸附力不同而使混合物中 各组分分离 分配层层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分 分离 离子交换层换层 析利用离子交换剂 上的可解离基团（活性基团）对各 种离子的亲亲和力不同而达到分离目的 凝胶层层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种 组分的相对对分子质质量不同而达到物质分离 亲亲和层层析利用生物分子与配基之间所具有的专专一而又可逆的 亲亲和力，使生物分子分离纯化 层层析聚焦将酶等两性物质的等电电点特性与离子交换层 析的特 性结合在一起，实现组 分分离 律 靖 付 苯 郑 柔 两 状 狠 装 夕 应 诀 箭 熄 晕 漫 郁 需 琢 孺 枚 揉 歉 穆 袄 观 糖 偶 咏 驭 捏 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences （一） 吸附层析 1. 概况 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混 合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布 在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过 此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离 。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富 、价格低廉、可再生，吸附设备简单。 31 传 干 阔 老 受 匹 七 骡 溅 萌 藏 桂 晃 窖 余 劣 岗 聪 炉 哑 盅 僳 厕 洋 巡 竹 譬 行 幽 跌 昔 三 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 2.原理 吸附作用是物体表面的一个重要性质，理论上任何两相都可以形 成界面，其中一相的物质或溶解在其中的溶质在另一相表面上发 生密集行为，称之为吸附。溶质从溶液中到停留在固体表面上的 过程，称为吸附现象。 在吸附柱层析中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附 剂表面存在许多吸附位点，这些位点通过物理的、化学的等各种 作用力与蛋白质和核酸等生物大分子结合，其结合力的大小与各 种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。在洗脱时，层析 柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。即被吸附在 吸附剂上的物质在洗脱剂的作用下解吸而随溶液向下移动，又遇 到新的吸附剂，被重新吸附，后面流下的洗脱液再把它解吸而向 下流动，然后再被下层的吸附剂吸附。如此反复进行，经过一段 时间以后，该物质向下移动段距离。 32 筏 邀 披 共 供 抡 咱 宪 赏 蒜 特 脂 汹 颧 磅 骚 逾 立 洋 襟 贞 晌 雀 歉 切 患 各 回 测 而 奖 独 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 3常用吸附介质及其性质 (1)活性炭： 活性炭的吸附原理：活性炭对化合物的吸附机制主要 是活性炭分子中的活性基团(如羟基等)与被分离物质分子中的某些 基团产生范德华力形成的吸附作用。 (2) 硅胶：硅胶是以硅酸盐为原料制成的。硅胶的吸附活性决定于 其含水量，不同类型的吸附层析所需硅胶的含水量不同。 (3) 羟基磷灰石（结晶磷酸钙）： 磷酸钙是一种极性吸附介质，适 于分离生物大分子(如蛋白质、核酸等)。 除了以上几种外，常见的还有氧化铝、聚丙烯酰胶、聚苯乙烯等 。 33 缕 实 烽 需 奠 西 治 恼 奥 醚 攘 尹 礼 窄 糖 盆 冉 暗 敲 察 擞 肚 堵 茸 纲 札 诉 瞳 裴 欣 燕 变 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 4吸附层析技术 (1) 吸附剂的选择 (2) 溶剂和洗脱剂的选择 吸附层析是各种层析技术 中应用最早的技术。吸附 剂来源丰富、价格低廉、 可再生，吸附设备简单。 34 湖 歼 禄 洲 会 效 匪 笑 姑 斋 脑 锄 器 唆 奇 注 檬 当 阐 调 晒 恕 堰 冤 渔 刺 枉 镐 月 吃 迁 吃 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences （二）分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分 离的方法。 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时 ，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。 分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力、等条件 的影响。 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻 土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中 始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂 可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经 固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。 纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析 35 天 歧 价 昂 埂 酶 穴 傣 字 帮 裳 褐 谷 衡 易 皆 矾 互 嘲 瞎 惋 规 龙 语 共 毗 掣 圆 拧 鹏 窘 擂 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences （三）离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对 各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不 溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而 制成。 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴 离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂 ，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 36 所 斥 惜 酗 墟 踌 挥 岛 派 锣 笨 馒 公 末 婶 陨 林 蚕 颖 脖 俱 防 但 誉 夜 进 彦 嚷 庐 锣 棋 给 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 离子交换剂的性质 溶胀系数 ：指每克干的离子交换剂吸附水后膨胀的体积，用mL/g 表示。 交换容量 ：指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的 能力。 比重：离子交换剂经过溶胀处理后其比重是恒定的 37 燕 句 密 棵 炕 祭 诞 檄 秆 改 劈 氢 肘 卞 棠 奢 母 猛 捅 姆 尹 浦 阑 缚 究 陇 念 框 赤 伍 沁 绳 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 离子交换剂的选择 1) 阴阳离子交换剂的选择 2) 强、弱离子交换剂的选择 3) 不同离子型交换剂的选择 4) 不同基质离子交换剂的选择 38 蔬 氧 山 郡 作 闹 馈 贿 勉 酒 载 脆 臆 喀 犁 纱 秸 澡 戮 甩 杖 痹 柬 俩 开 霍 桓 拨 暖 雹 绽 筛 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences39 离子交换层析的操作过程 1）装柱 2）上柱 3）洗脱和收集 4）再生 季 柜 逞 副 苯 滦 谱 茎 坊 示 妈 渊 民 附 秽 蒂 详 羹 秦 绑 荧 隐 现 名 淆 演 士 险 蜡 径 祸 勇 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences （四）凝胶层析 凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分 子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 1基本原理 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝 胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔 ，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较 小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔 内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从 而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流 出层析柱，而达到分离的目的。 40 厄 剃 灸 仑 魂 缆 憎 荐 靖 偶 严 仗 综 侨 戈 驱 赶 仰 忆 惹 姆 爵 邮 饰 姨 窑 抠 倪 崭 镶 膝 啃 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences41 肥 等 撑 草 涩 腺 单 圃 矮 歧 栽 融 桩 众 征 商 荫 颂 环 刻 蓝 扛 婿 捧 烁 诉 蜜 寝 岩 柳 了 体 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 2凝胶过滤技术 (1) 层析介质的选择 (2) 柱的选择 3凝胶过滤的应用 (1) 脱盐 (2) 用于分离提纯 (3) 测定高分子物质的相对分子质量 (4) 高分子溶液的浓缩 42 每 突 精 洪 酞 洁 德 笑 骚 锗 果 锥 海 乳 纤 柄 泥 蜗 陡 胖 昨 漳 瑚 奈 湍 悸 膜 靡 较 翱 梦 赘 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences43 常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 才 锻 墙 幽 怕 丝 百 至 漠 比 掂 廖 范 多 勾 承 锗 俭 韦 尤 螟 寻 奖 逆 培 辛 琳 磁 轴 幻 兜 犊 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences （五）亲和层析 1原理 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲 和力，而使生物分子分离纯化的技术。 所谓亲和力，是指生物大分子和其配基之间形成可逆结合的能力 。 酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与 互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都 是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的 分离纯化中有重要应用。 44 罕 苛 花 俏 冠 盏 夜 叠 倘 翟 挎 材 坯 鸳 鸵 汉 涡 员 习 滤 晨 筹 撒 赔 平 涉 糙 砸 础 厦 兑 湾 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences45 竭 亮 钧 刚 肘 搂 啥 屋 慷 氖 矣 赴 悄 碴 京 徽 敲 名 虏 截 畅 文 叼 郁 汞 著 敖 翼 禄 锡 匀 敷 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 载体配体臂 待分离组分 亲和吸附 洗涤洗脱 再 生 杂蛋白 目的酶 图4-4 亲和分离原理示意图 栗 煤 挽 反 喻 疥 晤 板 冒 糯 绰 苹 泥 帽 亮 诉 郁 址 沮 邓 珠 暴 支 避 海 面 育 违 境 围 肌 显 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 2亲和介质 亲和层析法主要使用的载体有葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖、纤 维素、多孔硅胶、树脂等 3亲和层析方法 47 根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析 贯 芋 谊 倔 癌 沽 继 剿 沈 云 淫 霄 戴 影 舀 蝶 滋 液 繁 衔 授 碗 稳 汪 医 潦 衬 嘶 狱 往 映 谤 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 五、 电泳技术 电泳是指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方 向移动的过程。而电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移 速度的不同而对物质进行分离的实验技术。 （一）原理 带电粒子在电场中会受到一个电场力的作用，从而向与它所带电 荷性质相反电极的方向移动，同时它又会受到摩擦力的作用，当 这两种力的大小相等时，该粒子则以速度v移动。 48 蘸 斤 圈 核 成 透 庚 垛 贰 徽 摄 亿 凶 敬 里 翘 请 彝 臭 混 饼 具 缮 馋 啸 汪 蕴 欢 梨 保 甩 备 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences (二) 电泳种类 1按分离原理分类 区带电泳 移界电泳 稳态电泳 2 按有无固体支持物分类 自由电泳 支持物电泳 3 按电泳的方式分类 端电极电泳 搭桥电泳 潜水电泳 49 押 噬 掂 燃 涛 倪 境 帜 奶 磕 炽 片 蜜 擦 夜 袋 摘 涯 诬 委 浪 度 哲 业 无 亩 诉 董 陶 昭 然 撂 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences （三）影响电泳速度的因素 1电场强度 电场强度愈高，带电颗粒泳动速度愈快 2缓冲溶液的pH值 缓冲溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度 ，亦即决定其净电荷的量。 3缓冲溶液的离子强度 4电渗 在电场中液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 5焦耳热 50 驹 谈 矩 润 硕 蛰 怒 恶 婉 瞥 汪 换 肘 蚀 谈 女 般 逼 咱 巡 陛 潘 萄 亲 卡 乡 谭 涛 荷 监 涨 渡 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences （四）所用仪器 （五）聚丙烯酰胺凝胶电泳 1原理 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide，PAG)是由单体丙烯酰胺(Acrylamide, Acr)和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺(N，N mehylenebisacrylamNe，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而 成的三维网状结构的凝胶。 51 遂 深 抽 宅 芭 订 金 鞘 川 雄 藐 陵 子 迪 急 很 芦 熙 娱 觅 缔 涂 驰 登 疡 岂 窃 瞩 筐 岩 墒 酗 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences 2分离效应 (1) 浓缩放应 (2) 电荷效应 (3) 分子筛效应 52 3分类 连续凝胶电泳 不连续凝胶电泳 梯度凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 4操作 制胶 预电泳 样品的处理 电泳 染色脱色 保存 狄 榷 赤 评 堑 妙 豹 搪 梨 伤 绕 兵 恶 膜 整 帚 仰 吩 镑 急 挤 好 铂 一 滴 歹 下 规 免 捕 狄 累 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 College of Life Sciences （六）等电聚焦电泳 在电泳系统中，加进两性电解质载体。当接通直流电时，两性电 解质载体即形成个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。当酶或其 他两性电解质进入这个体系时，不同的两性电解质即移动到(聚焦 于)与其等电点相当的pH位置，从而使不同等电点的物质得以分离 。这种电泳技术称为等电点聚焦电泳。 等电点聚焦电泳的显著特点 等电点聚焦电泳的缺点 53 龟 赚 援 拘 劳 睹 脆 窑 追 铀 舀 韵 怂 步 雪 标 艳 椿 靛 尽 促 每 夫 褥 眩 辊 生 伟 蚁 撂 播 士 4 酶 学 与 酶 工 程 第 四 章 酶 的 提 取 与 分 离 纯 化 学 生 4 酶