《分子标记的类型》PPT课件.ppt

LOGO Molecular Markers 分子标记的各种类型 分子标记标记 是以个体间遗传间遗传 物质质内核苷酸序列变变异为为基 础础的遗传标记遗传标记 ，是DNA水平遗传遗传 多态态性的直接的反映 。与其他几种遗传标记遗传标记 形态态学标记标记 、生物化学标标 记记、细细胞学标记标记 相比，DNA分子标记标记 具有的优优越性有 ：大多数分子标记为标记为 共显显性，对隐对隐 性的性状的选择选择 十分 便利；基因组变组变 异极其丰富，分子标记标记 的数量几乎是无 限的；在生物发发育的不同阶阶段，不同组织组织 的DNA都可用 于标记标记 分析；分子标记标记 揭示来自DNA的变变异；表现为现为 中性，不影响目标标性状的表达，与不良性状无连锁连锁 ；检检 测测手段简单简单 、迅速。随着分子生物学技术术的发发展，现现在 DNA分子标记标记 技术术已有数十种，广泛应应用于遗传遗传 育种、 基因组组作图图、基因定位、物种亲缘亲缘 关系鉴别鉴别 、基因库库构 建、基因克隆等方面。 Company Logo Company Logo Molecular Markers 限制性片段长度多态性（） 1 随机圹圹增多态态性（）2 简单 重复序列（）3 扩增片段长度多态性（）4 其他种类的分子标记 5 Company Logo 限制性片段长长度多态态性（） v RFLP标记标记是发发展最早的DNA标记标记技术术。RFLP是指基因型之间间限制性片段长长度的差 异，这这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变变所引起的。 vRFLP技术术主要包括以下基本步骤骤： v DNA提取用限制性内切酶酶切DNA用凝胶电电泳分开DNA片段把DNA片段转转移 到滤滤膜上利用放射性标记标记的探针杂针杂交显显示特定的DNA片段（Southern杂杂交）和结结果分 析。 v RFLP遍布整个基因组组，并且非常稳稳定，但RFLP实验实验操作繁琐琐，检测检测周期长长，成本高 昂，不适于大规规模的分子育种，在植物分子标记辅标记辅 助育种中需要将RFLP转换转换成以PCR为为 基础础的标记标记。 v RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma）限制性内切酶片段长长 度多态态性)作为为第一代分子生物学标记标记自问问世以来已广泛运用于多门门生物学科研究中，但它 运用于植物抗性研究还还只是近几年的事。RFLP能对对植物的抗性基因进进行定位和分离，利用 RFLP技术术，对对于核基因组组或叶绿绿体基因组组、尤其是后者，若能提取纯净纯净DNA，则则可直接 从酶切后的电电泳图谱图谱看出其多态态性，利用这这一方法可以测测定种群内、种群间间不同水平的物 种在污污染环环境下抗性分化进进化水平上的差异。 v 与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许许多非常繁琐琐工序，但相对对RAPD 而言 ，RFLP方法更费时费时、费费力，需要进进行DNA多种酶切、转转膜以及探针针的制备备等多个步骤骤， 仅对仅对基因组单组单拷贝贝序列进进行鉴鉴定。但RFLP又有比RAPD优优越之处处， 它可以用来测测定多态态 性是由父本还还是母本产产生的，也可用来测测定由多态态性产产生的突变类变类型究竟是由碱基突变变或 倒位、 还还是由缺失、插入造成的。 限制性片段长长度多态态性（） 基本原理： 特定生物类型的基因组 DNA经限制性内切酶（ restriction enzymes,RE） 酶切消化后，会产生数万条 DNA片段，通过琼脂糖电泳将 这些片段按大小顺序分离开 ，转移到尼龙膜或硝酸纤维 素膜上；用放射性同位素或 非放射性物质标记的DNA作为 探针，与膜上的DNA进行杂交 ，若某一位置上的DNA片段与 探针的序列相似，则探针就 结合到这个位置上，通过放 射性自显影或酶学检测，可 以显示出不同材料含有与探 针序列同源的酶切片段在长 度上的差异，即多态性。 限制性片段 长长度多态态性 （ ） 特点: 具有共显性的特点； RFLP标记具有种族特异性， 对于分析一个分离群体的不同 来源的染色体片段具有重要价 值； RFLP标记遍及整个基因组； 不足：主要表现在所需DNA量 大，步骤复杂，需要的仪器、 设备较多，周期长，成本高， 检测中利用放射性的同位素， 易造成环境污染； Company Logo 随机圹圹增多态态性（） RAPD 技术是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整 个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板, 以单个 人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物, 在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下, 进行PCR 扩增1。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电 泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了 基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化 关系 RAPD标记原理: RAPD标记的原理与PCR技术原理相同。在模板DNA、引物和4种碱基存在的条件下 ，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，以合成特异DNA片段的一种方法。PCR反应分 变性（denaturation）、复性（annealling）、延伸（extension）三步。 PCR原理: 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据 碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以 发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制 。 Company Logo 随机圹圹增多态态性（） DNA 的 制备备 RAPD 扩扩增 数据处理 RAPD 技术术的步骤骤 检测未知序列的基因组DNA RAPD标记为显性标记，极少数为共显 性标记 引物无种族特异性 RAPD技术简单 RAPD标记的最大缺点是再现性差 特点 SSLP(simple sequence length polymorphism) 即简单简单 序列长长度多态态性 ，是由于简单简单 序列的重复次数不同，导导致扩扩 增片段长长度的不同而产产生的多态态性。 简单简单 重复序列（） SSR标记标记 的特点 v 数量几乎无限，检测检测 出多态态性的频频率极高； v SSR技术检测术检测 到的是一个单单一的多等位基因位 点； v SSR标记为标记为 共显显性标记标记 ，可鉴别鉴别 出纯纯合和杂杂 合基因型； v 结结果重复性高，稳稳定可靠； v 兼具PCR反应应的优优点，所需DNA量少，对对 DNA质质量要求不高； 扩扩增片段长长度多态态性（） v AFLP（Amplified Fragments Length Polymorphism）即扩增片 段长度多态性，是由Zabeau 和Vos（1993）发明的一种利用PCR技 术检测DNA多态性的方法。AFLP 结合了RFLP的稳定性和PCR技术 高效性的特点。AFLP的多态性极高，一次可以检测到100150个扩 增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及进行分类研究。 v AFLP标记的原理 ： v 植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切，其中包括一个酶切位点 稀有的内切酶（识别位点一般为6个碱基或8个碱基）和一个酶切位 点丰富的内切酶（识别位点一般为4个碱基）的酶切组合，形成分子 量大小不等的随机限制性片段。酶切片段先与有共同粘性末端的人 工接头（artificial adapter）连接，连接后的粘性末端顺序和接头顺 序作为PCR反应的引物结合位点，通过PCR反应把酶切片段扩增， 然后将扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，其多 态性即以扩增片段的长度不同而被检测出来。 Company Logo AFLP标记的特点 AFLP标记的限制性内切酶与选择性碱基组合的数目和 种类很多,AFLP标记产生的标记数目是无限的； AFLP标记多态性远远超过其它分子标记，一次PCR反 应可以同时检测多个遗传位点； AFLP标记多数为显性标记，表现孟德尔遗传； AFLP标记具有模板用量少的特点，并且对模板浓度变化 不明显； AFLP标记用特定引物扩增，退火温度高，假阳性低； AFLP技术受专利保护。 Company Logo 其他种类的 分子标记 SCAR CAPS STS ESTS 特点 SNP LOGO Molecular Markers 重要农艺性状基因定位的 原理和方法 班级：作物生物技术07 姓名：陈文堂 学好：0701103046 Company Logo 基因定位: 将具有某一表现现型性状的基因或与基 因有关的标记标记 定位在遗传连锁图遗传连锁图 或相应应 的染色体上，称作基因定位（或遗传遗传 作 图图）。 Cms-C Mo17（rf4rf4rf5rf5)凤凤可1（Rf4Rf4Rf5Rf5) Cms-C Mo17 F1 BC1F2 3 : 1 15 : 1 例：玉米C型胞质雄性不育恢复基因的定位 (1)初部定位：构造F2和BC1分离群 体如下： 可得： 玉米C型胞质质 雄性不育的恢 复存在两对对重 叠恢复主基因 ，并且是位于 两条染色体上 。 初步定位BSA 分群法 在作图群体中，依据目标性状表型的相对差异（如抗病与 感病），将个体或株系分成两组，然后分别将两组中的个体 或株系的DNA混合，形成相对的DNA池。根据亲本与DNA池 扩增带型之间的差异，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记 。 可以推测，这两个DNA池之间除了在目标基因座所在的染 色体区域的DNA组成上存在差异之外，来自基因组其它部分 的DNA组成是完全相同的，都是该作图群体基因库的一个随 机样本。 假如电泳结果如下： 标记 F SP1P2 1 2 3 4 5 选出与目标性状可能连锁的标记如2、3、4 将筛选得到标记去跑所有的BC1、F2群体。 可得结果如下： 植株1植株2植株3植株4植株5 2 3 4 根据上面的结结果将F2当成一个标记标记 ，通过软过软 件计计 算任意两个标记间标记间 的交换值换值 ，从而确定目标标基因 所在的染色体。假如在5、9号染色体上： 2 Rf4 3 5号染 色体 4 Rf5 8 9 号染 色体 初步定位，将两个基因分开研究 其效应 在F3中保存具有Rf4_rf5rf5 和rf4fr4Rf5_的植株， 利用进进等基因系的方法，进进行自交、杂杂交如下： P1(rf4fr4fr5fr5)P2(Rf4_rf5fr5) F2 P1F1 F3 P1(rf4fr4fr5fr5)P2(rf4rf4rRf5_) F2 P1F1 F3 精细定位 利用目标标基因区域的已有序列开发发 如果在5、9号染色体上存在已知序列，可 根据已知序列来设计设计 引物进进行标记标记 ，就可 获获得目标标基因。 LOGO 分子标记技术的发展为作物育 种工作注入了新的活力 Company Logo 分子标记 在杂种优 势 研究 中的应用 分子标记 在种子生 产中的应 用 基因聚合 MAS 分子标记用 于转基因作 物后代的选 择与检测 Company Logo Dream 分子标记辅 助选择(MAS) 1 在一个有100个个体 的回交后代群体中，借 助100个RFLP标记选标记选 择择，只需3代就可使后 代的基因型回复到轮轮回 亲亲本的99.2，而利用 常规规回交转转育的方法则则 需要选择选择 7代才能达到 ，大大缩缩短了育种时间时间 。 基因聚合 将多个基因利用分子标标 记辅记辅 助选择选择 的方法，整 合到一个新的材料中， 从而创创造一个含有多个 有利基因的新材料或自 交系的方法。如： 目目标标标标基因的定位与基因的定位与标 标标标 记辅记辅记辅记辅 助回交育种相助回交育种相结结结结合合 3 分子标记在种子生 产中的应用 品种鉴鉴定 品种保护护中的 应应用 2 4 。 。 www.themegaller