《CR扩增实验》PPT课件.ppt

聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCRPCR） （以酵母菌（以酵母菌 16SrRNA 16SrRNA 序列扩增为例）序列扩增为例） 食品微生物实验食品微生物实验 实验目的实验目的 l l 了解了解PCRPCR反应原理反应原理 l l 熟悉熟悉PCRPCR反应流程反应流程 l l 掌握掌握PCRPCR基本实验操作及步骤基本实验操作及步骤 l l 掌握掌握DNADNA的琼脂糖凝胶电泳法的琼脂糖凝胶电泳法 实验原理 PCRPCR概述概述 PCRPCR原理原理 PCRPCR的特点的特点 PCRPCR反应过程反应过程 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)(Polymerase Chain Reaction, PCR) 一种在体外模拟自然一种在体外模拟自然DNADNA复制过程的复制过程的 核酸扩增技术。以双链核酸扩增技术。以双链DNADNA为模板，由引为模板，由引 物介导，在物介导，在DNADNA聚合酶作用下，扩增目标聚合酶作用下，扩增目标 基因片段。基因片段。 PCR原理 vv DNADNA的的半保留复制半保留复制进行复制进行复制。双链。双链DNADNA在多在多 种酶的作用下可以变性种酶的作用下可以变性解旋解旋成单链，在成单链，在DNADNA聚合酶聚合酶 的参与下，根据的参与下，根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则复制成同样的两复制成同样的两 分子拷贝。分子拷贝。 vv 在实验中发现，在实验中发现，DNADNA在高温时也可以发生变性在高温时也可以发生变性 解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此， 通过温度变化控制通过温度变化控制DNADNA的变性和复性，加入设计的变性和复性，加入设计引引 物物，DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP就可以完成特定基因的体就可以完成特定基因的体 外扩增。外扩增。 DNA体内外扩增条件对比 模板原料酶能量引物 DNA体内 扩扩增 基因组组4种dNTP 解旋酶 DNA/RNA聚 合酶 连连接酶 ATP 提供3端 羟羟基的 RNA片段 DNA的 PCR扩扩增 目的基因 或DNA片 段 4种dNTP Taq酶（耐热热 DNA聚合酶 ） 热热能 上下游引 物（单链单链 DNA） 其他 体内 环环境 缓缓冲 液、 Mg2+ PCRPCR的特点的特点 特异性强特异性强 PCRPCR特异性决定因素：特异性决定因素： 引物与模板引物与模板DNADNA特异正确的结合；特异正确的结合； 碱基配对原则；碱基配对原则； TaqTaq DNA DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。靶基因的特异性与保守性。 灵敏度高灵敏度高 皮克皮克(pg=10(pg=10-12 -12) )量级扩增到微克 量级扩增到微克( (ugug=10=10-6 -6) )水平 水平 能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测灵敏度达病毒检测灵敏度达3 3个个RFURFU 细菌最小检出率为细菌最小检出率为3 3个细菌个细菌 快速、简便快速、简便 一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 1010 扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul10ul 4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 200umol/L200umol/L 引物引物 1010100pmol100pmol 模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ug TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5u MgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L 加双或三蒸水加双或三蒸水 100ul100ul 标准的PCR反应体系 12345 22 55 72 94 时间（min） 温度 （） PCRPCR反应过程反应过程 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复13步 2530轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 单链 与引 物复 性 DNA 变性 形成 二条 单链 子链 延伸 DNA 加倍 模板DNA 95 PCR的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 50 引物1 引物2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 72 第1轮结束 95 第2轮开始 PCR的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 95 50 72 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 72 第2轮结束 PCR的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 vvPCRPCR反应后，需要对反应产物进行鉴定；反应后，需要对反应产物进行鉴定； vv琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖琼脂糖作支持介质的一种电泳方法；作支持介质的一种电泳方法； vv“ “分子筛分子筛” ”和和“ “电泳电泳” ” 双重作用；双重作用； vv琼脂糖凝胶网使分子通过时会受阻，大分子在涌动受阻力大琼脂糖凝胶网使分子通过时会受阻，大分子在涌动受阻力大 ；因此在电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质；因此在电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质 和数量，而且还取决于分子大小；和数量，而且还取决于分子大小； vv核酸分子带核酸分子带负电负电，电泳时从负极向正极涌动。分子量较大的，电泳时从负极向正极涌动。分子量较大的 核酸涌动较慢，反之较快；核酸涌动较慢，反之较快； vvDNADNA电泳一定要使用电泳一定要使用DNA DNA MarkerMarker或已知大小的正对照或已知大小的正对照DNADNA 来估计来估计DNADNA片段大小片段大小 试剂试剂：2 2 Taq PCR Taq PCR MasterMixMasterMix（包含（包含dNTPdNTP 、MgMg2+ 2+ 、TaqTaq聚合酶、缓冲液等）聚合酶、缓冲液等）、酵母菌酵母菌 16SrRNA 16SrRNA 上下上下 游引物（游引物（updown primerupdown primer）、）、ddH2OddH2O、 酵母菌酵母菌 DNADNA模板、琼脂糖、模板、琼脂糖、GlodenViewGlodenView ； 缓冲液缓冲液：50TAE50TAE缓冲液；缓冲液； 仪器仪器：PCRPCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统；仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统； 材料材料：EPEP管、枪头、微量移液枪、制胶板、梳齿。管、枪头、微量移液枪、制胶板、梳齿。 实验材料实验材料 1 1、在、在EPEP管中，按下述体系依次加入管中，按下述体系依次加入PCRPCR试剂及模板：试剂及模板： 2Taq PCR 2Taq PCR MasterMixMasterMix 10 10 ulul ddH2O 8 ddH2O 8 ulul DNA template 1 DNA template 1 ulul 16SrRNA updown primer 16SrRNA updown primer 各各0.5 0.5 ulul 2 2、将加好样的、将加好样的EPEP管放入管放入PCRPCR仪器，按下述程序进行反应：仪器，按下述程序进行反应： 9494 5min 5min； 9494 15s 15s ，5656 20s 20s，7272 30s 30s，30 cycle30 cycle； 7272 8 min 8 min； 2525 实验步骤实验步骤 Total Volume 20 20 ulul 3 3、将、将 50TAE 50TAE 缓冲液稀释到缓冲液稀释到 1 1 TAETAE，备用；，备用； 例如：配置例如：配置 500ml 1500ml 1 TAETAE，需要，需要50TAE 10ml50TAE 10ml，加，加 蒸馏水蒸馏水490ml490ml； 4 4、用、用 1 1 TAE TAE 配置浓度为配置浓度为 0.8%1%0.8%1% 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 例如：配置例如：配置 100ml 100ml 琼脂糖凝胶即加入琼脂糖凝胶即加入 100ml 1100ml 1 TAE TAE , 0.8g , 0.8g 琼脂糖；琼脂糖； 5 5、在琼脂糖凝胶中加入、在琼脂糖凝胶中加入glodenviewglodenview（5 5ul / 100mlul / 100ml）； 实验步骤实验步骤 实验步骤实验步骤 6 6、将适量琼脂糖凝胶注入、将适量琼脂糖凝胶注入制胶槽制胶槽，插入梳齿，冷，插入梳齿，冷 却凝固；却凝固； 7 7、待、待PCRPCR反应完成后，在反应完成后，在电泳槽电泳槽中加入适量中加入适量 1 1 TAE TAE ，以放入琼脂糖凝胶后，刚好没过胶孔为，以放入琼脂糖凝胶后，刚好没过胶孔为 宜；宜； 8 8、将扩增产物加入胶槽，同时加入、将扩增产物加入胶槽，同时加入MarkerMarker； 9 9、将琼脂糖凝胶放入电泳槽，在、将琼脂糖凝胶放入电泳槽，在90V90V电压下电泳电压下电泳 3060min3060min； 1010、电泳完成后，用凝胶成像系统观察记录结果。、电泳完成后，用凝胶成像系统观