[医药]现代生物技术在动物药分离研究中的应用.doc

现代生物技术在动物药分离研究中的应用陈毓（江苏畜牧兽医职业技术学院药学系，江苏 泰州 225300）摘 要 ：动物药是我国医药宝库的重要组成部分，在临床有着广泛的应用，但动物药基础研究薄弱, 研究人才匮乏，导致动物药研究发展缓慢。如何借鉴现代科学技术找到适合动物药研究的新方法和新模式，是动物药发展的关键所在。本文通过查阅文献，综述了现代生物技术如色谱分离技术、电泳技术、蛋白组学技术、DNA分子标记、生物芯片、免疫技术等在动物药化学成分分离、鉴别、质量评价等研究中的应用，以期为动物药研究提供参考。关键词：生物技术；动物药；分离动物药是我国医药宝库的重要组成部分，是中药三大来源之一，由于其活性强、资源广、疗效高而备受历代医药学家的重视和青睐，祖国医药学应用动物药防治疾病具有悠久的历史。 为了解动物药在中国药典中的收载情况，查阅并统计了1990年至2010年二十年间我国出版的5版药典，结果见表1。结果可以看出，每版药典所收载的动物药药材及其制剂的比例变化不大，收载的动物药药材约占总收录药材和饮片的平均比例为8.9%，含动物药的制剂占单味及成方制剂总和的比例为32.0%。药典中收载的动物药药材比例只有十分之一，但在制剂中的使用比例却达到了三分之一，可见动物药在临床实际应用中还是比较广泛的。但近些年以来，动物药基础研究薄弱, 研究人才匮乏，导致动物药的研究发展缓慢。因此，有必要进一步加强对动物药的研究和开发。表1 19902010年中国药典中动物药药材及其制剂收载情况序号版本（年版）药材+饮片（味）动物药（味）比例（%）单味及成方制剂（种）含动物药制剂（种）比例（%）12010616538.6 86931235.922005553519.2 57016529.032000534478.8 45815333.441995517428.1 398 12130.451990509499.6 275 8731.6 动物药研究起步较晚，其系统研究整理工作始于20世纪60年代，基础薄弱，存在较多空白，加之传统动物药研究理论不完善，符合动物药研究特色的方法学尚未建立，如何合理有效的借鉴现代技术手段也不明确1。动物药传统研究思路是以中医理论为指导，重点研究临床应用等相关方面，主要包括:本草考证、资源调查、基源鉴定、动物药化学、加工炮制、药效研究、品质评价等2，而动物药基础理论研究相对较少，如动物药成分分离纯化研究、效应物质基础研究、药效机理研究、代谢动力学研究等。动物药研究是中药研究领域特有的分支，是具有独特体系的学科，其药用部位为动物的器官、组织或代谢产物，来源、组成、成分与植物药大相径庭，因此采用目前相对较成熟的植物药研究思路去探索动物药的道路是很难走通的。尽管如此，随着生物领域技术的发展，现代生物技术已逐渐广泛应用于动物药化学成分分离、鉴别、质量评价等研究领域，并取得了可喜的进展。1生化分离技术 动物药中除了含有氨基酸、核酸、甾醇、生物碱等小分子物质外，还含有大量与生命活动密切相关的蛋白质、多肽、酶等成分，常用动物药中的蛋白质和多肽类成分具有抗凝抗血栓、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等功效3，这些成分可能正是动物药主要物质基础所在。对于中药动物药的分离纯化方法，不能采用传统中药植物药的研究方法，而应将现代生化分离技术引入动物药的研究，并加以充分利用。生化分离技术主要包括:色谱分离、电泳分离、沉淀分离、膜分离等技术。1.1色谱分离技术 色谱分离技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱、亲和色谱等。对于生物大分子的分离，只使用单一的色谱方法很难将待分离物质完全分离，通常将几种原理不同的色谱技术组合起来以获得理想的纯化效果。Cao等4利用凝胶过滤、离子交换、制备型反相色谱法从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化了Mar-tentoxin I、Martentoxin、BmK AngM1等多肽。Zhen等5利用丙酮分级沉淀、超滤、凝胶过滤色谱等方法从鲨鱼软骨中分离纯化得到一种新型抗血管生成多肽。Guan等6利用阳离子交换、凝胶过滤色谱从梅花鹿茸中分离得到具有抗肝纤维化作用的新型多肽。魏金荣等7采用一步亲和色谱法分离纯化了白眉蝮蛇蛇毒中的降纤酶，得到的降纤酶纯度高达99%以上。1.2电泳技术 电泳技术是一种广泛使用的蛋白质和核酸分离分析技术。凝胶电泳是一种杰出的分析手段,是蛋白质纯化过程中重要的监测手段。通过电泳可以准确简便的比较大量样品,并获得蛋白质图谱。将两种基于不同分离原理的电泳方法进行组合能大大提高分离效果,如双向电泳。目前电泳技术已经广泛应用于动物药的鉴定研究。利用动物药药材中的不同组分具有不同的电荷特性,在同一电场下泳动距离存在差异而实现鉴定。史克莉等8利用SDS-PAGE技术对3种蜂王浆、牛血清蛋白、金钱白花蛇、乌梢蛇、鹿蹄筋、炮制前后的蝎子进行了鉴别分析。仲昭庆等9采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对马鹿、梅花鹿、驼鹿、牛的鞭进行了比较鉴别，为鹿鞭的真伪鉴别提供了依据。李仁茂等10利用SDS-PAGE对梅花鹿筋、羊筋、牛筋等动物筋进行了电泳分析。结果表明，鹿筋与其他种动物筋间存在着显著的电泳图谱差异和明显的鉴别区带。 毛细管电泳可减少电泳扩散,速度快,灵敏度高,分辨率强,在多肽、蛋白质、核酸、手性化合物等生物活性物质的分离中显示出广阔的前景。蔡梅等11采用毛细管区带电泳法建立了河豚毒素的测定方法,方法简单、准确、方便、取样少。古今等12应用高效毛细管电泳技术鉴别了冬虫夏草及其伪品,方法简便、快速、准确,可作为冬虫夏草及其伪品的有效鉴别方法。1.3其他分离技术 沉淀分离、膜分离、离心分离、泡沫分离等技术作为常用生化分离制备手段的必要补充在动物药研究中的应用同样重要。2蛋白质组学技术的应用 蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出,意指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质,是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体,而不是局限于一个或几个蛋白质,蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体。而蛋白质组学(proteomics)是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学,其研究目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律13。蛋白质组研究的三大关键核心技术包括蛋白质双向凝胶电泳技术(two-dimen-sional electrophoresis,2-DE)、质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库(蛋白质信息学)14。动物药药材来源广泛，资源丰富，药用动物物种从单细胞动物到哺乳动物跨度大，种类繁多，而即使是同一物种，也因其所处发育阶段、生理条件、栖息环境等不同，使得动物药药材中的蛋白质组成不尽相同，各有特点。黄春洪等15利用双向电泳和二维色谱有效分析了尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质组和生物活性。蛋白组学技术在研究蛋白质、多肽等复杂体系方面有其独到之处，必将会给动物药的研究带来良好的应用前景。3DNA标记、分析技术DNA是生物群体细胞中的遗传物质，具有遗传稳定性，代表了该种群的基本遗传特征，对其标记，制定出其正品的标准DNA指纹图谱，为鉴别不同类别中药提供了方便快捷的方法。王义权等16报道了中药材品种鉴别的一种新方法PCR鉴别技术。该方法根据对正品药材及其混伪品药材原动物的特定区域的DNA片段的序列研究，设计出一对高度特异性的鉴别引物，该对引物只能扩增正品药材DNA模板的特定区域，而对混伪品DNA模板的相应区域不能扩增。当有样品需要鉴定时，只需提取少量DNA，用鉴别引物进行一次PCR扩增，电泳检测便可准确鉴别样品的真伪。应用此法，王义权等17、刘忠权等18,19准确鉴定了金钱白花蛇、乌梢蛇、龟板、蛤蚜等药材。刘向华等20亦用此法对药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋及其混伪品进行了鉴定研究，建立了简便的鹿类中药材DNA分子标记鉴别方法。唐晓晶等21建立蕲蛇药材DNA分子标记鉴别方法，完成了蕲蛇及其7种常见混淆品的高特异性PCR鉴别。王晶娟等22对蜈蚣、全蝎、僵蚕、土鳖虫、蝉蜕进行了PCR扩增和18srRNA基因测序基础上的对切酶鉴别的初步研究。Hashimoto等23用PCR方法扩增了鹿茸的DNA并进行了测序分析，王建云等24也用DNA测序的方法鉴定了鹿鞭。但DNA测序法准确性高但成本也高，且技术复杂，实际应用有困难。随机引物扩增多态性(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)、限制性内切酶酶切片段长度多态性(restrict fragment length polymorphisim，RFLP)是以PCR为基础发展的灵敏度高、操作简便快速的方法。RAPD由Williams等在1990年发明，是一种遗传标记方法，其原理是用随机序列的910个核苷酸的引物，对基因组的DNA进行PCR扩增，再进行电泳分离和溴化乙锭染色。多态性的产生由互补核苷酸引物的碱基差别形成。RFLP是由于不同个体的等位基因之间碱基代换、重排、插入、缺失等引起的，限制性内切酶能把很大的DNA分子降解成小片段，所产生的DNA片段的数目和长度反映了限制性内切酶的切割位点在DNA分子上的分布。于超等25用RAPD方法对康定虫草、人工虫草及虫草发酵菌丝体进行指纹图谱的研究，为不同虫草的品质和药效差异提供了分子依据。4其他技术的应用4.1生物芯片技术 生物芯片根据所应用材料不同可以分为:基因芯片26，蛋白质芯片27，细胞芯片和组织芯片。生物芯片28是指通过微加工技术将生物材料如蛋白质、DNA、RNA、细胞、组织等有序的高密度的分布在一定的载体上如膜、玻璃片、硅片等表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，对样品分子进行定性、定量和结构分析，具快速、准确、自动化的优点。生物芯片可以广泛应用于中药材的真伪鉴定、有效成分筛选及药理药效研究等领域。生物芯片技术的出现有利于同时检测某一种药物或者中药对众多基因或靶蛋白的作用，从而缩短药物筛选的时间和成本，能够在药物和基因之间架起一座桥梁，从而在基因水平、分子水平上解释药物作用机理，有助于从分子水平阐明中药的治疗机制。4.2免疫技术免疫鉴别法是一种特异性很强的鉴别方法，以药材中含有的特异蛋白为抗原，制备出特异的抗体，再与检验品中的特异抗原结合产生沉淀反应，据此鉴别药材的真伪。丁培贤等29利用虎，豹等骨骼中的特异抗原成分制备虎、豹骨等多种动物骨骼的抗体，还能将豹骨进一步鉴别为雪豹、云豹或金钱豹。郭月秋等30,31根据抗原抗体反应的高度特异性，采用免疫凝集试验鉴别，快速、准确鉴别了鹿胎及其伪品牛、羊胎；还对鹿鞭及其伪品牛鞭、羊鞭进行了免疫凝集试验鉴别，获得了快速、准确鉴别鹿鞭真伪的试验结果，为鹿鞭真伪鉴别提供了一种新的手段。祖国医学有着数千年历史，虽然早在4000多年前的甲骨文就有关于动物药的记载，但是动物药研究水平却相对较低，动物药的自身特点使得动物药的化学组成、质量控制、效应物质基础等方面研究面临很多困难，加之动物药的研究缺乏与现代技术手段的有机结合，动物药效应物质基础研究相对薄弱。动物药来源于生命体，中医称之为“血肉有情之品”，与生命科学的紧密结合将是动物药发展的新方向，通过现代生物化学、分子生物学等学科的技术手段、思维方法阐释动物药科学内在规律，建立具有动物药研究特色的方法学，完善动物药科学评价体系，必将引导动物药研究达到新的高度。参考文献:1 李建平,林吉吉,邓明鲁.中国动物药概况J.中药研究与信息,2003,5(8):24-27.2 邓明鲁.中国动物药资源M.北京:中国中医药出版社,2007:341-345.3 朱雪妍,韦建华,韦汉燕,等.动物药中蛋白和多肽的研究与开发J.广西中医学院学报,2005,8(1):68-71.4 Cao 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