《westernblot讲解》PPT课件.pptx

WESTERN BLOT 赵树琪 综合介绍 操作步骤 分析讨论 Western Blot又称蛋白质印迹，其过程与 southern印迹相似，是一种常用于目的蛋白质 定位检测的实验方法。Western印迹是将蛋白 质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋 白质的检测方法。 WESTERN BLOT基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽 从凝胶转移至一种固相支持体，然后 用这种多肽的特异抗体来检测。 方法是：从生物细胞中提取总蛋白质，并将其 溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质按分子量大小分 离，再把分离的各蛋白质条带原位转移至固定 相上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中 温育，以封闭其特异性位点。然后加入特异性 抗体（一抗），膜上的目的蛋白与一抗结合后 ，再加入能与一抗结合的带标记的二抗。最后 通过二抗上的标记物的特异性反应进行检测。 Western blot采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 被检测的是蛋白质，“探针”是抗体，显色用 所标记的二抗，固定相载体通常为硝酸纤维素 膜或尼龙膜。显色方法有放射自显影、底物化 学放光ECL、底物荧光ECF、底物DAB显色等。 操作步骤 试剂及仪器准备 样品制备 含量测定 电泳 转膜 免疫反应 化学发光 图像分析 试剂及仪器准备 试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10分离胶、4浓缩校、G250考 马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（ 5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲 液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、 洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化 学发光试剂。 仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。 样品制备 样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。 不同蛋白质样品，提取方法不同。注意细胞裂 解及离心要彻底，提取操作在冰上进行，样品 提取后放在20C保存。 含量测定 先配制不同浓度的标准液，用考马斯亮蓝 G250作为显色剂，通过生物分光光度计检测 吸光度，绘制标准曲线，然后同样方法测定所 提取的样品的吸光度，根据标准曲线得出含 量。 注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇 洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样 品再一起测，这样对测大量样品可节省很多时 间。测得的结果是5ml样品含的蛋白量。 电泳 制胶 1、将玻璃板对齐后放入夹中夹紧，然后垂直放在架子 上； 2、配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀。用10ml枪 吸取5ml胶灌入玻璃板夹缝中，液面上升到白线时停 止。然后在胶上加层水封住； 3、0.5h后，分离胶凝固，吸取上层水。配制浓缩胶， 加入TEMED后用相同方法灌胶，灌胶完成后在胶上面 垂直插入梳子； 4、0.5h后，浓缩胶即可凝固，小心拔出梳子，并将整 个装置放入电泳槽中，小玻璃板向内，大玻璃板向外 ，缓冲液要没过凝胶。 电泳 点样 取上样样品至0.5ml离心管中，加入5XSDS上 样缓冲液至终浓度为1X，混匀后，取15l加到 点样孔中，点样前要将样品在沸水中煮沸 5min使蛋白变性。 电泳 电泳 上样完成后，接通电源即可电泳。电泳一般采 用4060V，时间为45h。电泳到溴酚蓝刚跑 出凝胶时停止，然后进行转膜。 注意：不同样品对分离胶和浓缩胶要求不同， 实际工作中，根据需要配制不同浓度的胶 转膜 1、将夹子打开使黑面朝上保持水平。垫一层海绵并用玻璃 棒赶出气泡。 2、将玻璃板撬掉后，把胶剥下来。撬的时候小心，不要损 坏胶和玻璃板。将浓缩胶刮去，不要把分离胶损害。然后 把胶盖在滤纸上，对齐并赶出气泡，最后盖上海绵垫，除 去气泡后即可合上夹子。上下的滤纸不能接触，以免短 路。整个操作要在转移液中进行，并不断赶出气泡。 3、将夹子放入转移槽中，使黑面对槽的黑面，。在槽的一 边放一块冰来降温，防止转移时过热。一般60V转移2h， 40V转移3h。 4、转完后将膜用1X丽春红染色5min，摇床上摇，然后用 水冲去多余的染液。将膜晾干备用。 免疫反应 1、用TBS自上而下将膜浸湿后，移至含有封 闭液的平皿中，脱色摇床上摇动封闭1h。 2、将一抗用TBST稀释至适当浓度，在实验台 上铺一层保鲜膜，将抗体加到保鲜膜上。从封 闭液中取出膜，吸走残留封闭液，将膜蛋白面 朝下放于抗体液面上，赶出气泡，室温孵育1 2h，用TBST脱色摇床上洗两次，每次10min 。 3、同样方法，将膜与二抗接触，进行化学发 光反应。 化学发光 A和B两种试剂，在保鲜膜上等体积混合， 1min后，膜蛋白朝下，与混合液接触。1min 后转移至另一保鲜膜上，去除残液，包好，放 入右光片甲中。用1X显影液和定影液分别显 影和定位。在红灯下，取出X光片，裁剪适当 大小，放在膜上，观赏X光片，讯速浸入显 影液中。带条带明显后，停止显影 显影时间 12min。低温，延长，显影结束后，把X光 片浸入定影液中。定影时间510min，以胶片 透明为主。 图像分析 将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。 注释 SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-de/do=K-D K和为常熟，de为蛋白质移动距离，do为小 分子示踪物的移动距离。 TEMED即N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N,N-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵从 而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手 套,戴口罩操作。 10%过硫酸铵 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚