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贵州大学生命科学院逆流色谱技术进展及其在生物多糖分离中的应用色谱技术课程综述题目：逆流色谱技术进展及其在生物多糖分离中的应用 学 院：生命科学学院班 级：09级药物化学姓 名：彭梅学 号：20090214662010年 4月22 日逆流色谱技术进展及其在生物多糖分离中的应用摘要:逆流色谱技术是近年发展起来的一种新型的色谱技术,在天然产物的分离纯化方面已表现出其独特的优越性。文章综述了逆流色谱技术的研究进展及其在生物多糖领域的应用前景。关键词:逆流色谱,进展,生物多糖一：简介随着人类基因工程提前完成和其他生物基因测序工作的开展,以及基因的克隆和表达研究的深入,生物学的研究进入了后基因组学的阶段。21世纪生命科学研究的焦点是对多细胞生物的高层次生命现象的解释，因此，对生物体内细胞识别和调控过程信息分子-糖类的研究时必不可少的1。糖介导生物体的受精、发生、发育、分化、成长、老化、凋亡过程，作用于神经系统、免疫系统的正常维持。糖关联着疾病的发生与发展，糖参与炎症的发生、肿瘤和癌细胞的增生与转移、HIV(human mmunodeficiency virus)等病原体的感染。糖的种类繁多、复杂多变，从结构上看有戊糖、己糖、吡喃环糖、呋喃环糖、脱氧糖、氨基糖、糖醛酸、甲基化糖、硫酸化糖、磷酸化糖、型糖、型糖、直链式糖、支链式糖、同多糖、杂多糖等。生物多糖是高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中的天然分子化合物,具有提高机体免疫力、增强机体耐缺氧能力、清除自由基、抑制肿瘤等生理活性,可用于治疗高血压、高血脂、糖尿病、乙型肝炎等多种现代医学中的疑难病症 23 ,已有香菇多糖、灵芝多糖等应用于临床。 多糖的分离有分级沉淀法、季铵盐沉淀法、透析法、金属盐沉淀法、色谱法和制备性区域电泳等,目前大多采用各种不同类型的凝胶柱色谱、离子交换色DEAE-凝胶色谱法。常用的凝胶有葡聚糖凝胶( Sephadex)和琼脂糖凝胶( Sepharose) 以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂,从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化,但此法不适合粘多糖的分离。且普通凝胶柱色谱载样量少,难以达到较大规模的分离,有效的多糖分离技术依然有待探索并加以利用。二: 逆流色谱技术的发展逆流色谱技术( Countercurrent Chromatography,简称CCC)是20世纪70年代发展起来的一种无固体载体的连续液-液分配色谱新技术,可以在短时间内实现高效分离和制备 4 ,同其它色谱技术的根本差别在于,它不采用任何固相载体(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜等) ,从而完全排除了固相载体对样品的不可逆吸附、污染、变性、失活等影响,并可以实现高纯度、高回收率、高重现性以及超负荷、制备量较大的分离纯化 5 ,可从粗制样品中制备高纯度单体化合物。该技术适用大规模制备,已广泛用于生化工程、医药、天然产物、食品等领域。三: 逆流色谱技术特点利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡,当其一相作为固定相,另一相作为流动相,在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相,物质的分离据其在两相中分配系数的不同而实现。它同其他各种色谱分离技术的根本差别在于它不采用任何固态的支撑体(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜等) ,因此它完全排除了因不可逆吸附而引起的样品污染、变性、失活等,不仅使样品能够全部回收,回收的样品也能反映其本来的特性,特别适合于天然产物活性成分的分离。它所有的优点都源于其不用固体固定相,有广泛的溶剂体系可供选择,它独特的优点概括起来为:1) 逆流色谱不用固体支撑体,避免了由于样品与固定相发生作用而导致的不可逆吸附、污染、变性等缺点;2) 分离过程不是吸附与淋洗的过程,而是对流穿透的过程,所以能节省昂贵的填料费用,节约溶剂的消耗;3) 滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收;4) 柱子可以用合适的溶剂(如甲醇) 很容易地清洗,用空气或氮气干燥,然后注入新的溶剂后构成新的柱体,可重复使用;5) 粗样可直接上样而不会对柱子造成任何损害。四: 溶剂体系的选择7溶剂体系是构成逆流色谱柱的固定相和流动相,其选择是逆流色谱分离中首要和关键环节。于不同的中药化学成分而言,采用何种两相溶剂系统、如何调整各种溶剂的比例才能得到相应的分配系数,是CCC 方法学研究中的重要问题。五: 溶剂体系的选择原则 好的溶剂体系需满足以下条件:1) 溶剂系统不会造成样品的分解或变性;2) 足够高的样品溶解度;3) 溶剂系统不会干扰样品的检测。如果溶剂在选定波长有吸收,会造成基线的漂移;4) 各个组分在其两相的分配系数在0155 之间,且有一定的差值。如果分配系数过小,组分易混入无保留的杂质,但是分配系数过大又会延长分离时间;5) 溶剂系统的分相时间不超过30 s。如果分相时间过长,进入HSCCC 的高速旋转的环境下会出现更严重的混溶,影响固定相的保留,从而影响分离;6) 尽量采用沸点低的溶剂,以方便后续处理。因为分离后收集到的组分要去除溶剂后再进行纯度测定和结构鉴定。如果溶剂的沸点很高,会给组分的干燥带来麻烦;7) 尽量避免使用毒性大的溶剂。六: 逆流色谱技术在多糖类物质分离中的应用逆流色谱在小分子物质的分离中应用较多,在分离大分子天然产物时,由于需使用双水相体系及特殊装置,关的研究及应用报道不多。近年来, Ito、等利用正交轴CPC设备已经成功地进行了一些生物大分子如蛋白质分离纯化。巢志茂等 8 以1215%聚乙二醇( PEG) 1000与16%磷酸钾缓冲溶液(pH618) 组成的水性二相系统,在X- axis CPC高速逆流色谱仪上,对牛膝的高分子物质进行分离纯化,成功分离出多糖部分和蛋白多糖部分。孙达远 9采用氯仿-乙醇-水(712 8) 溶剂系统,从芦荟冷冻粉中分离出2, 3-乙酰化-( 14) - D-甘聚糖、6 -乙酰化-(14)- D-甘聚糖和(14)-葡萄糖甘露聚以及芦荟苷。七:结论 多糖化合物因具有一定的生理活性，极具研究潜力，因此，探索此类化台物的提取、制备及检测方法，具有一定的现实意义。逆流色谱是一种独特的、不用固态载体的液相分配色谱技术,是一种能实现连续、有效分离的实用分离制备技术,且在天然药物活性成分研究中获得了广泛的应用。快速高效、节省能源、简便易行的新型分离工艺对多糖的研究有重要意义, 合理使用CCC等新技术可以有效改善多糖的提取与纯化效果,使多糖制向高效节能、绿色、现代化的方向发展。相信随着液相色谱技术的迅猛发展, CCC将不断完善,日趋完美,验目的明确，将合成、分离、分析形成合理的操作规程，实验操作简便、快速，成本低廉、分离效率高，能够分离并制备更多更纯的样品，对色谱法在糖苷类化合物的提取，合成及研究具有重要的意义。参考文献:1 颜军,徐光域,郭晓强,等1 银耳粗多糖的纯化及抗氧化活性研究 J 1食品科学, 2005, 26 (9) : 16917212 Wasser S P1Meducinalmushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides J 1 App l Microbial Biotechnol, 2002 (6) : 25827413 Michinori I, Kotaro S, Hideya Y, et al1 Influence of type2 diabetes mellitus on cardiovasculars disease mortality: findings from the Hawaii - LosAngeles - Hiroshima study J 1 DiabetesResearch and Clinical Practice, 2002, 57: 6114 张奇,杜琪珍1逆流色谱技术进展及其在食品工业中的应用 J 1现代食品科技, 2007, 21 (3) : 15916115 张天佑1 逆流色谱技术M 1 北京: 科学技术出版社, 199116 戴德舜,王义明,罗国安1高速逆流色谱研究进展 J 1分析化学, 2001, 29 (5) : 586