《醋酸纤维电泳法》word版.doc

南京大学医学院生化实验报告 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质一 实验目的1. 学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和方法2. 学习蛋白质染色的方法3. 了解电泳法分离血清蛋白质的临床意义二 实验原理电泳（electrophoresis）法：在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子带电荷的蛋白质，在电场中将向着与其所带电荷电性相反的电极泳动这种现象称为电泳。电泳影响因素：蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量及质点的大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的PH、离子强度及电渗等。常见的有：醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等。以醇酸纤维等制成薄膜作为支持体的电泳仪称为薄膜电泳。在一定酸碱度条件下，蛋白质分子由于基团电离而带有一定的电荷，在含有缓冲液的薄膜上，受电场力作用以一定的速度向一定的方向移动。不同的蛋白质分子，由于所带电荷的不同，移动的速度和方向也不同，从而达到分离。这种薄膜对蛋白质样品的吸附作用小，几乎完全消除纸蛋白质电泳中出现的拖尾现象，又因为薄膜的亲属性比较小，它所容纳的缓冲液也少。电泳是的电流大部分是样品在传导，因此具有简单，快速，区带清晰，灵敏度高，易于定量和便于保存的特点。本方法样品用量少，5ug的蛋白质就能得到满意的结果。因此特别适合于病理情况下微量蛋白检测。以广泛用于蛋白质和同工酶的分离分析，也可以用于免疫电泳等方面。蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.88690001-球蛋白5.062000002-球蛋白5.06300000-球蛋白5.1290000150000-球蛋白6.857.50156000300000在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时1、2、球蛋白升高，-球蛋白降低。肝硬化时2、-球蛋白降低，而1、-球蛋白升高。三 实验器材醋酸纤维薄膜（2cm8cm）常压电泳仪 点样器（盖玻片）培养皿（染色及漂洗用） 粗滤纸玻璃板 竹镊子白磁反应板人血清或鸡血清 四 实验试剂巴比妥缓冲液（PH8.6，离子强度0.06mol/L）：称取巴比妥钠（A.R.）12.76克和巴比妥（A.R.）1.66克，溶于蒸馏水水并稀释至1000ml。用pH计校正后使用。染色液：氨基黑10B0.25克，甲醇（A.R.）50毫升，冰醋酸（A.R.）10毫升，水40毫升，混匀即可（可重复使用）。漂洗液：95%甲醇（A.R.）45毫升，冰醋酸（A.R.）5毫升，加蒸馏水50毫升，混匀即可。透明液：冰乙酸（），无水乙醇（），混匀即可。 五 实验操作1浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20分钟。2点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端23厘米处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。3电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。）膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V，电流强度0.40.7毫安/厘米膜宽，电泳时间约为60分钟。4染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。5漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次（4-5次）至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。6透明：配制好透明液，用镊子将薄膜取出，贴在容器壁上（烧杯壁或培养皿上等），注意不可有气泡，用吹风机稍吹干薄膜，用胶头滴管淋洗薄膜，将每组20ml透明液淋洗玩即可，再用吹风机将薄膜彻底吹干，此时薄膜透明，小心将薄膜自容器壁上取下。六 结果处理七 注意事项1、醋酸纤维素薄膜的预处理：市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。 2、缓冲液的选择：醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm0.5mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。 3、加样量：加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1l0.5l约相当于5g1000g蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1l，相当于60g80g的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。 4、电量的选择：电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。 5、染色液的选择：对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅