[基础科学]27细菌分析方法总括.doc

ISO9000质量管理体系 青岛多福康食品有限公司 细 菌 检 测 方 法抽样调查A 确认检测样品品名 制造年月日 检测目的 检测项目B 选取检测样品a) 样品要每批抽样检测。b) 抽取样品时不要混入异物，避免微生物的二次污染。c) 检测细菌抽样时一定要用灭菌的器具和容器，做到无菌操作。d) 装样品最好采用方便于搬运、洗涤、灭菌的容器适用于样品种类、形状、检测项目。e) 抽取的样品要贴上标签，写上必要事项(品名、制造年月日等等)。f) 检测前，抽取的样品要冷冻保管。灭菌法细菌检测时,采用直接接触稀释液或其他样品的器具必须要充分完全灭菌。高压蒸汽灭菌(高压灭菌器) A: 用于对培养基和稀释水的灭菌.培养基: 121 / 20分 稀释水: 121 / 15分B:干热灭菌(干燥器): 用于对均质器、吸量管器具的灭菌。 干燥器内180/10分钟自然冷却。C: 火焰灭菌(煤气喷灯): 用于镍铬丝(金属棒)、镍铬环(金属环)的灭菌 用煤气喷灯将白铁丝和圈加热到变红进行杀菌。培养基配制使用市面上销售的粉末状培养基，把粉末培养基和一定量的水加入烧杯中加温溶解，根据使用目的分别注入试管里.A: 液体培养基：把培养基和定量的水加入试管里加温溶解后灭菌。B：液体培养基裝入三角烧瓶中。 平板培养基1) 加温熔解后灭菌，冷却到50。2) 分别注入灭菌后的平皿中15到20毫升,快速使之冷却凝固。3) 待培养基的表面凝固后放入恒温箱中进行培养。样品液的准备1) 被冷冻的样品在2-4.4状态下,18小时以内解冻检测.(短时间解冻的时在以下在分钟之内进行)。2) 装入样品的容器用7075%的酒精仔细擦拭,采用灭过菌的器具开封。3) 固体物用杀菌过的剪刀类的工具切成细条或碎块。4) 随机取25克样品放进均质器的杯里。5) 倒225克杀菌磷酸稀释水调整均质器使之均匀化.(按照每分钟/rpm进行2分钟)10倍稀释液6) 把10毫升10培液加入90毫升灭菌磷酸稀释水混合100倍稀释液7) 把1毫升培液加入9毫升灭菌磷酸稀释水混合倍稀释液8) 把1毫升1000培液加入9毫升灭菌磷酸稀释水混合.10000倍稀释液9) 依此类推往下都是十进制杀菌磷酸稀释水的配制a) 将34克磷酸二氢钾用500毫升溶解，再加入175毫升1mol/l的氢氧化钠溶液,随后定溶1000毫升蒸溜水。b) 把PH调整到7.2作为原液。 原液放在阴冷处保管1N氢氧化钠:精确计量42克氢氧化钠(分析纯)用蒸溜水溶解定容1000毫升。 稀释水：取储存液1.25ml，用蒸馏水稀释至1 000ml，分装每瓶100ml或每管10ml，121/15分钟进行高压蒸汽杀菌，杀菌后用水快速冷却。 菌落总数A: 培养基的配制 标准琼脂培养基(22.5g/1000ml)取适当量加入三角烧瓶里(200到300毫升的)加温溶解后121/15分钟杀菌.B: 检测1) 稀释倍数的确定预测样品的细菌污染程度，设定1毫升中生菌仅仅30到300个存在.假设某样品的生菌数为500000/g,如果做这种试料样品的10000倍稀释液时,其中就包含了个的生菌数.因此,要前后设置10倍的空间来设定倍、倍、倍三个稀释倍数。2) 检测:a) 在第一阶段准备个平皿分别接种毫升调整的稀释溶液.b) 把保持4550的标准琼脂培养基分别注入上述浅底盘里15到20毫升，混合均匀后放置凝固.c) 凝固后同样在其表面再倒入几层五毫升左右的培养基.d) 在培养箱内将其颠倒放置,351的温度培养482小时e) 培养后,采用菌落计数来数发生的菌落数.每枚平板的菌落数稀释倍数等于生菌数/g*生菌数的计算法另记大肠菌群大肠菌群的检测是根据检体样品的种类的不同而异.出素法冷冻食品 FD制品BGLB法浓缩汁、粉末调味料、鲸鱼制品、AD热风烘干片MPN法FD制品出素法A: 培养基的配制a) 去氧胆酸盐琼脂(40g/1000ml) 取适量培养基放入三角烧瓶里(到毫升的)加温溶解，放进4550的温水中保温不要让之凝固。b) EMB培养基(40.1g/1000ml)取适量培养基放入三角烧瓶里(到毫升)加温熔解后， /15分钟杀菌. c) 乳糖培养基(18g/100ml)把加温溶解的培养基分别注入试管10毫升，/15分钟杀菌快速冷却.B: 检测1) 准备2只培养皿，分别接种1毫升的样品10倍稀释液,预先加温溶解,再把4550保温的培养基分别注入15到20毫升混合均匀后让其凝固.2) 凝固后再同样在其表面倒入几层5毫升的培养基.3) 在培养箱内颠倒放置用351/24H培养。4) 培养后,把认可的典型的群体(红色，直径0.5mm以上)推定为阳性,计算菌落数的同时,选出数个菌落进行确认试验.5) 大肠菌群数的计算和一般生菌数同样计算.C: 确认检测a) 根据培养基发生的典型菌落用金属环挑菌，在EMB培养基平板上画线,在351培养24小时.b) 有典型的菌落(黑色且有黄金色光泽)时,从一个菌落里移种在乳糖肉汤上画线在351状态培养24小时.(在典型的菌落没有得到认可的时候,从非典型的菌落类似的菌落里移种个以上同样操作)c) 没有发生乳糖肉汤气体的,再继续培养24小时,无气体发生的时判定为阴性.BGLB法A: 培养基的调整煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）培养基(40g/1000ml)称取标准培养基加温溶解后，在装入发酵管的试管里分别接种10ml,/ 15分钟杀菌快速冷却。B: 检测a) 每个稀释倍数分别接种个BGLB培养基发酵管，分别接种10ml样品液351状态培养.b) 24小时到小时之内观察，如果个都没有气体发生,则推定大肠菌为阴性.c) 在24小时或者48小时后有气体发生(个以上),继续进行阳性进行确认试验。C: 确认检测 从确认气体发生的BGLB培养基用接种环在EMB培养基上画线，之后和出素法的确认检测一样进行同样的检测.MPN 法(FD长葱、FD青梗菜的检测)A: 培养基的配制BGLB培养基(40g/1000ml)称取定量培养基加温溶解，分别接种装有发酵管的试管里10ml,/15分钟杀菌快速冷却.B: 检测a) 预先从袋子的外侧仔细取样。b) 在装有90ml的灭菌稀释水里加入10g样品.c) 为了让样品均匀分散在稀释水里，将装有样品的瓶子振荡次/7S.d) 把1ml10倍溶液在2只BGLB培养基上接种.(10倍稀释液)e) 把0.1ml10倍液在2只BGLB培养基上接种.(100倍稀释液)f) 把10倍液1ml在装有99ml杀菌稀释水的三角烧瓶里接种,为了让这种接种液分散在稀释水里,用30cm的毛巾在将装有试料的烧瓶振荡25次/7S.(1000倍稀释液)。g) 把1000倍稀释液样品在2个BGLB培养基上接种.h) 在351/483小时培养.k) 在BGLB培养基的发酵管里发生1/10以上的气体时可推断为阳性,记录在各个稀释阶段中的气体发生的个数,从MPN表计算菌数.大肠杆菌A: 培养基的调整 EC培养基(37g/1000ml) 加温溶解后分别注入装有发酵管的试管里10ml/15分钟杀菌快速冷却.B: 检测a) 在3个的EC培养基上分别把样品的10倍稀释液接种1ml.b) 在44.50.2的恒温水槽里培养24小时.c) 培养后，在没有得到认可的气体产生时即断定为大肠菌阴性.d) 培养后,个中即使1个也没有气体产生时,可作为推定试验阳性进行确认试验.C: 确认检测 从有气体产生的EC培养基用接种环在EMB培养基上画线，按照和出素法确认同样的方法进行检测。耐热菌A: 培养基的配制标准琼脂培养基(23.5g/1000ml)在三角烧瓶里加入适当的量加温溶解后121/15分钟杀菌.B: 检测a) 取杀菌后样品的10倍稀释液10ml加入试管用硅胶塞塞住。b) 放进沸腾的水中加热10分钟(要保证沸腾水的高度要比试管内的液面高)。c) 加热后，用流水快速冷却.d) 每1检体准备2个盘子分别接种1ml.e) 把保持45的标准琼脂培养基分别注入平皿中1520ml,混合均匀后放置,使之凝固。f) 凝固后再把相同培养基做5ml左右的复层.g)在培养箱内倒放,351/培养482小时.h) 培养后,用菌落计数器数产生的菌落.每1枚平板菌落数稀释倍数=生菌数/gj) 耐热菌数的算出和一般生菌数按同样方法计算.黄色葡萄球菌A: 培养基的配制a) 食盐卵琼脂培养基(115g/1000ml)取适当数量的食盐卵琼脂培养基在三角烧瓶里加温溶解后，用121/ 15分钟杀菌，保温50,在50%的旦黄液里(在杀菌的塑料容器里装进无菌的新鲜鸡蛋的旦黄,再加入等量灭菌稀释水充分混合)加进10%的比例混合,分别注入平皿20ml作为平板(使用前,在培养箱内烘干培养基表面)b) 检测用兔血浆培养基(荣研)。（每瓶使用7ml的杀菌稀释水，在大约能保存个星期,但是有浑浊的不能使用.使用前到15分钟从冷藏库里拿出来恢复到室内温度后再使用)B: 检测a) 准备2只食盐卵琼脂培养基，把样品的10倍稀释液分别接种0.1ml,用玻棒涂抹.b) 在培养箱内倒置, 用351/ 24到48小时培养.c) 培养后,黄色葡萄球菌分解为甘露糖醇且黄色化,在菌落周围形成白色环.d) 清点旦黄反应(脂肪酶反应)阳性的菌落.e) 黄色葡萄球菌的计算方法与一般生菌数相同C: 确认试验a) 兔血浆培养基加入0.5ml的小试管里。b) 把推定试验阳性的菌(有旦黄反应物)用接种环移种、接种在有培养液的试管里并混合.c) 用培养3、6、24小时后再判定.d) 血浆凝固成果冻状或者把纤维蛋白析出的推定为阳性. 凝固的血浆有时破碎，血浆和水分离成纤维蛋白,为了不发生凝固,在观察时候注意不要用力摇晃试管. 由于菌产生的纤维蛋白一次熔解凝固的血浆且有时会错误的判断, 因此进行 以上培养时,一定要严守培养时间。 酵母/霉菌1 材料准备:1.1 恒温箱：天平、显微镜、玻塞三角瓶、试管、平皿：直径90mm、吸管：1ml及10ml、酒精灯、广口瓶、牛皮纸、 金属勺、试管架、 接种针、 橡皮乳头、 培养基和试剂、灭菌蒸馏水、75%乙醇。1.2 日本寒天培养基配制：取39g加蒸馏水1000ml加热溶解，再加1ml抗生素溶液(抗生素溶液的配制方法：抗生素（CHLORAMPHENICOL）2.5g加50ml99.5%的酒精溶解即可,剩余的放在冰箱中保存备用),121/15min灭菌后备用。2 操作步骤2.1 采样：取样时须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，采取有代表性的样品，样品采集后尽快检验。2.2以无菌操作称取样品5g，放入45ml无菌水的玻塞三角瓶中，振摇均匀，即为1：10稀释液。2.3 用灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入装有9ml灭菌水的试管中，迅速振摇均匀，制成1：100的样品。2.4 按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1