CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗的研究进展和展望文献综述.docx

生物工程文献综述中国药科大学生 物 工 程 文 献 综 述综述题目 CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗的研究进展和展望 英文题目 Current situation and development trend of CAR- T cell for tumor immunotheraphy 专 业 生物制药（卓越工程师） 院 部 生命科学与技术学院 学 号 14404806 姓 名 龙益如 CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗的研究进展和展望14404806 龙益如摘要：嵌合抗原受体修饰的细胞（CAR-T）治疗是一种新型的肿瘤免疫治疗方法。在多种血液肿瘤的临床试验中，CAR-T细胞疗法取得重大突破，在实体瘤的临床试验中也初见成效。但在获得显著疗效的同时, CAR-T也存在持久性、归巢、脱靶效应、神经毒性、细胞因子风暴、插入突变、对实体肿瘤疗效有限等问题。现就CAR-T技术的最新进展及该领域有待解决的问题进行综述，以期初步了解该技术的发展前景及问题分析。 关键词：嵌合抗原受体修饰的T细胞；肿瘤；免疫治疗 Current situation and development trend of CAR-T cell for tumor immunotheraphyAbstract：A lot of remarkable results suggested that the modification of T-cells with CARs could be a powerful approach for developing safe and effective cancer therapeutics .A novel breakthrough has been made in CAR-T treatment of hematologic tumors and therapeutic potential in clinical studies of solid tumors has been achieved , although there are still many problem for CAR-T on the clinical application such as off-target effect, cytokine storm ,insertion mutagenesis, limited effects for solid tumors. Here, we reviewed the recent advances of CAR-T and problems that need to be solved in this flied. Keyword: Chimeric antigen receptor T cells ; Tumor ;Immunotheraphy前言现当代社会，癌症是世界四大致死率最高的非传染性疾病（心血管疾病、癌症、糖尿病和慢性肺疾病）之一。据世界卫生组织统计，每年约880万人死于癌症。人类抗肿瘤历史已经100多年，取得了显著的成就，然而离攻克肿瘤难题仍然任重道远。免疫学研究的蓬勃发展为肿瘤诊疗策略的革新带来了许多振奋人心的突破。免疫疗法成为国际公认的继外科手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗模式，被成功用于多种肿瘤的治疗。自1985年来，美国国立卫生研究院（National Institutes of Heath,NIH）就把肿瘤的生物治疗列为肿瘤综合治疗第四大方式。2000年举行的国际肿瘤生物基因治疗年会也指出：“ 生物治疗是目前知道的唯一有望完全消灭癌细胞的治疗手段，21世纪是肿瘤生物治疗的世纪”。2011年国际权威杂志自然及临床肿瘤学分别发表题为“ 肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章，指出未来免疫细胞治疗可能在肿瘤综合治疗中占据非常重要的位置。美国科学杂志更是将肿瘤免疫治疗列在2013年度突破性研究进展第一位，认为其是肿瘤治疗的重大转折点。2015年美国临床肿瘤学会年会发布的ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展中，将嵌合抗原受体基因修饰T细胞治疗技术作为实现复发性白血病治疗突破的前兆。近期，麻省理工科技评论公布了“2016年十大突破技术”，这些技术代表了当前世界科技的发展前沿和未来发展方向，反映了近年来世界科技发展的新特点和新趋势；而“ 免疫工程-杀伤性T细胞”位居榜首。本文将以介绍CAR-T细胞疗法的发展现状为基础，并分析CAR-T细胞疗法所存在的问题、可能的解决方法及机遇展望。1 CAR-T细胞的概念和发展历程1.1 CAR-T细胞的概念嵌合抗原受体修饰的T细胞（Chimeric antigen receptor for T cells , CAR-T）疗法是将抗体对抗原的高度特异性和T细胞对靶细胞的细胞毒活性相结合的一种方法：通过基因重组获得表达嵌合抗原受体的T细胞，经过纯化、体外扩增和活化，输注回患者体内行使杀灭肿瘤细胞的功能。CAR-T细胞通过其表达的CAR能特异性地识别并杀伤肿瘤细胞，属于精准肿瘤免疫细胞治疗。目前已有大量研究针对不同肿瘤靶点设计出相应的CAR-T，在临床研究中验证其可行性，取得了显著疗效。CAR的基础设计中包括一个胞外的肿瘤相关抗原（ Tumor-associated antigen , TAA）结合区，通常来源于多克隆抗体抗原结合区域的scFv（ Single-chain variable fragment），一个穿膜区和一个胞内信号区，将其有序地结合在一起，并组装在T细胞上。当CAR受到特异性抗原识别后可为T细胞提供活化信号并通过胞内结构域转导该信号，引起T细胞的活化，从而发挥T细胞杀伤作用，并释放大量细胞因子对肿瘤细胞进行攻击。1.2 CAR-T细胞治疗的抗肿瘤机制和发展历程1.2.1 CAR-T细胞治疗技术的发展历程目前针对T细胞的肿瘤免疫治疗主要包括免疫检查点抑制剂疗法和T细胞过继疗法两大类，CAR-T细胞疗法属于后者。传统的过继免疫治疗主要采用肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes ,TIL）。这种免疫治疗策略有一定的疗效，但是获得新鲜的肿瘤组织并分离和扩增TIL具有难度，回输的TIL细胞功能受损，在体内往往不能有效识别肿瘤细胞；同时，肿瘤中强大的免疫抑制微环境降低回输细胞的杀伤能力，这些问题限制了TIL疗法的广泛应用，仅对黑色素瘤等少数肿瘤有一定疗效，对大多数肿瘤疗效欠佳。随着T细胞过继疗法的发展，具有高效特异性、杀伤活性和持久性的CAR-T细胞疗法应运而生，成为肿瘤免疫治疗的新星.目前，CAR-T细胞治疗技术可分为四代，主要是依据其胞内信号结构域的差异来划分，我们将在下文中提及。1.2.2 CAR-T细胞治疗的抗肿瘤机制理解CAR-T的抗肿瘤机制，首先需了解T细胞是如何活化并杀伤肿瘤细胞的。T细胞的活化需要双信号途径。第一信号为细胞表面受体（T cell receptor , TCRs）与抗原递呈细胞上的主要组织相容性复合物（MHC）结合，第二信号为抗原递呈细胞上的共刺激分子B7家族分子与T细胞上的配体CD28分子结合，产生协同刺激信号。在双信号共同刺激下，T细胞活化增殖为细胞毒细（cytotoxic T cell，CTL）。当CTL再次遇到携带相同抗原肽复合体的肿瘤细胞时，就会与之结合，并分泌穿孔素、颗粒酶，直接介导肿瘤细胞溶解，也可诱导巨噬细胞分泌促炎因子IL-12等，间接影响肿瘤细胞的生长。CAR-T细胞免疫治疗是利用基因工程的方法，将识别目标抗原的单链抗体与间隔区、跨膜基序和T细胞活化基序等结合为一体，利用融合基因修饰的T细胞特异性杀伤肿瘤细胞。1.2.3 CAR-T的结构CARs是靶向目标表面分子的重组受体，其结构主要包括胞外抗原结合域、跨膜区和胞内信号区三部分,如下图所示：胞外抗原结合域为单克隆抗体的单链可变区，负责识别抗原。不同于生理性的TCR，重组CARs与抗原的结合不需要依赖于MHC的递呈，有效避免了肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制；同时，CARs不仅能够与蛋白质结合，还能识别糖类、神经节苷脂、蛋白多糖、高度糖基化的蛋白，更加广谱地杀伤肿瘤细胞。跨膜区连接胞外抗原结合域和胞内信号域，一般由二聚体膜蛋白组成，主要包括CD3、CD4、CD8、CD28等，能将CARs结构锚定于T细胞膜上。跨膜区不同的设计能影响导入的CAR基因的表达。有研究发现，CD28的跨膜区较CD3的跨膜区能更多地表达CAR基因。胞内信号域采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM），通常是TCR/CD3FcRI，当胞外区与其识别的抗原结合时，就会向胞内传导TCR样信号。根据胞内信号域结构的差异，CAR可划分为四代。第一代CAR结构只有一个胞内信号组分（TCR/CD3链和FcRI链），能够识别靶抗原并激活细胞，无共刺激分子，不能转导增殖信号和诱导细胞因子产生，T细胞无法增殖，因而杀伤肿瘤效果甚微。第二代CAR细胞内增加了一个共刺激分子，如CD28、CD27、41BB（CD137）、OX40（CD134）或者可诱导共刺激分子，即便没有外源性共刺激分子T细胞也能持续增殖并释放细胞因子。虽然二代CAR大大提高了T细胞抗肿瘤疗效，但仍未全面开启T细胞的杀伤能力，于是诞生了包含两个共刺激分子（CD28、41BB 和CD3）的第三代CAR。小鼠实验表明三代CAR能够增强细胞因子的分泌、抑制肿瘤生长。最近出现的第四代CAR又称TRUCKs，结构与前三代不同，引入促炎症细胞因子（目前主要是IL-12）和共刺激配体（41BBL和CD40L），可以在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中通过释放促炎性因子，招募并活化更多的免疫细胞而引起更为广泛的抗肿瘤免疫效应。并且，第四代CAR的出现可使患者免受回输前预处理治疗（全身照射或大剂量化疗）的不良反应，减少回输细胞总量，拓宽了CAR-T细胞的临床应用范围。2 CAR-T的基因转导稳定转染是效应细胞稳定表达CAR的前提。目前用于CAR-T的基因转导载体主要有逆转录病毒和慢病毒。如需获得短暂存在的CAR-T细胞，则用mRNA转染。不同于病毒载体长久地插入基因组，RNA转染是一种快速高效的转染方式。但由于细胞不能稳定持久存在，往往需要输注大量的T细胞以保证疗效。此类mRNA转染的CAR-T目前还处于早期临床试验中。3 CAR-T的生产培养患者或捐赠者的外周血是细胞的主要来源。一般而言，T细胞是在CD3和CD28的刺激下，或与外周血单个核细胞共培养，经过10d至3周的体外培养获得。IL-2是体外扩增中最常用的细胞因子。有研究显示，IL-7联合IL-15能扩增出干细胞样的记忆性T细胞，能在体内更好存活，具有更强的抗肿瘤效应。临床治疗过程中回输的CAR-T细胞数量目前尚无定论，有研究认为回输的T细胞数目越多疗效越好，也有研究认为回输CAR-T需要严格控制细胞数量，应从低剂量开始，降低严重不良反应发生的可能性。4 CAR-T的抗肿瘤效应和及临床转化4.1 抗血液肿瘤效果CAR技术在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的成绩。靶CD19的CAR-T细胞在临床上研究最多，在CAR-T靶点开发领域具有里程碑式的意义。2010年，美国国家癌症研究所的研究表明，CD19特异性的CAR-T用于治疗晚期淋巴瘤疗效明显。随后，靶向CD19的被用于治疗淋巴细胞白血病，Maude等的研究表明，CTL019（抗CD19的二代CAR-T）治疗30例复发难治急性淋巴细胞白血病，其中90达完全缓解。对于复发耐药的慢性淋巴细胞白血病，靶向CD19的CAR-T能稳定持久地清除体内肿瘤，总反应率达57。Garfall等报道了一例CD19特异性CAR-T联合自体移植治愈多发性骨髓瘤的病例，显示了其在多发性骨髓瘤中的治疗潜力。两家研究单位分别报道了靶向抗原Lewicy和CD33的CAR-T在急性髓细胞白血病中的临床小样本研究，前者例患者入组，1例达细胞学缓解，3例部分缓解疾病稳定，后者1例患者入组并获得细胞学缓解。中国人民解放军总医院的Dai等、北京大学第三医院的克晓燕分别总结了CAR-T细胞在治疗血液肿瘤中已发表的20篇临床试验结果及应用进展，可以看出CAR-T在治疗血液恶性肿瘤中疗效可观。4.2抗实体瘤效果CAR-T在血液肿瘤治疗中获得了突破，但由于受实体瘤中微环境复杂，免疫逃逸机制多样，肿瘤抗原靶点繁杂，且实体瘤体积大、CAR-T细胞难以归巢到肿瘤组织等多方面因素的影响，CAR-T在实体瘤的治疗实践中仍有部分障碍。一代CAR-T对实体肿瘤的治疗大多无效，但据此探索了CAR-T治疗的可行性和安全性标准。二至四代CAR-T在增殖、细胞因子释放等方面有了明显改进，在部分临床试验中也崭露头角，越来越多的临床试验正尝试CAR-T用于各种实体瘤的治疗。4.3妇科肿瘤卵巢癌是预后最差的妇科恶性肿瘤，近半个世纪以来其临床诊治无突破性进展，是最早尝试CAR-T治疗的实体瘤之一。叶酸受体（FR）是卵巢癌相关肿瘤抗原。2006年，研究者应用针对FR的一代CAR-T细胞治疗14例FR的复发性卵巢癌患者，所有患者均能耐受该治疗，但是没有患者从治疗中获益。究其原因在于：一代CAR-T细胞无法有效归巢至肿瘤组织，不能持续存在于患者体内从而发挥功能。MUC16是另一卵巢癌肿瘤相关抗原，其编码的CA125是临床用于卵巢癌诊断的较理想的标记物。纪念Sloan- Kettering癌症中心的BrentjensRJ团队设计了靶向MUC16的CAR-T细胞，基因编辑后的CAR-T细胞同时分泌IL-12并且表达人EGFRT。IL-12可以增强细胞的功能并改善抑制性的肿瘤微环境；人EGFRt是西妥昔单抗的靶标，使用西妥昔单抗可诱导CAR-T细胞凋亡，有助于控制不良反应。在临床前研究中，将MUC16特异性CAR-T细胞输注至移植了人卵巢癌细胞的免疫缺陷小鼠体内，CAR-T细胞能够持久存活并大量分泌IFN。鉴于此，该癌症中心于2015年启动了基于MUC16ecto靶点CAR-T治疗复发性卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌的期临床试NCT02498912，其结果如何，我们拭目以待。此外，较具潜力的卵巢癌相关抗原靶点还包括间皮素、HER2、L1-CAM、CD133等，这些抗原靶点结合新型的CAR-T技术在临床前研究中杀伤效果明显，期临床试验也陆续启动，有望成为卵巢癌治疗的新策略。宫颈癌及内膜癌患者临床上常常能早诊早治，预后较好。CAR-T用于治疗复发难治患者，其靶点多为实体瘤中表达较普遍的抗原，目前进入临床试验阶段的主要是mesothelin特异性的CAR-T。44其他实体瘤第一代CAR-T治疗实体瘤虽然总体未见突出疗效，但是仍有一项临床试验的结果令人鼓舞。2011年，识别神经节苷脂（GD2）的CAR-T用于治疗儿童神经母细胞瘤效果明显：接受治疗的19例患者中，3例获得完全缓解，且CAR-T细胞可在患者体内持续存在。二、三代CAR-T的治疗潜力仍在开发中。一项HER2特异性的二代CAR-T治疗HER2（）复发转移肉瘤的临床研究显示出好的疗效：19例接受治疗的患者中，4例病情稳定，存活时12周至14个月。而另一项靶向HER2的三代CAR-T在治疗1例结肠癌患者时，因发生强烈的细胞因子风暴致使患者死亡。可见二、三代CAR-T细胞活性高，应用需谨慎。目前世界范围内正在进行针对不同实体瘤抗原靶点的CAR-T细胞多中心临床研究。5 CAR-T细胞治疗肿瘤面临的挑战虽然CAR-T有诸多优点，但其仍存在一些明显缺陷。这里就目前需要解决的问题进行讨论，相信随着未来临床试验的增加，必然会出现更多实际应用问题，而随着问题的发现与解决，CAR-T细胞治疗技术将在世界范围内的研究者的努力下，日趋完善。脱靶效应理想的目标抗原仅在肿瘤细胞表达。暂未能发现仅在肿瘤细胞表达的特异性抗原，任何会在正常细胞表达的抗原都有被误伤的风险。实体瘤常常同时表达多个肿瘤抗原，通过设计多个抗原复合的CAR结构，识别抗原组合，能够提高杀伤的特异性，比如使用同时靶向抗原ErbB2和MUC1的CAR-T治疗乳腺癌。肿瘤细胞的基因常常不稳定，一旦靶抗原丢失就会逃离CAR的识别。间质细胞是肿瘤微环境的重要组分，直接影响肿瘤细胞，且基因表达稳定，故有研究选择基质细胞作为攻击对象，间接作用肿瘤细胞，以应对肿瘤细胞基因的不稳定突变。第二军医大学东方肝胆外科医院的章浩等发现，降低CAR-T细胞亲和力能提高杀伤特异性，减少脱靶效应，提高治疗的安全性。5.2细胞因子风暴在CAR-T抗肿瘤效应中，大量的细胞因子在其中发挥了重要作用，但也存在引发细胞因子风暴的隐患。细胞因子风暴是CAR-T细胞疗法常见且致死性的并发症。输注CAR-T细胞后，T细胞、B细胞、NK细胞以及单核巨噬细胞释放大量的炎性细胞因子，包括IL-6、TNF和IFN，这些炎性介质促发急性炎症反应诱导上皮及组织损伤，导致微血管渗漏，引起恶心、头痛、心动过速、呼吸急促等临床症状。细胞因子风暴的发生与CAR结构、肿瘤负荷及类型以及患者基因多态性相关，可通过设计安全的CAR并严格限制每次输注的细胞数量来降低发生风险。糖皮质激素及细胞因子拮抗剂具有减少细胞因子风暴相关死亡的作用。一些研究显示，高反应蛋白（CRP）与严重的细胞因子风暴相关，对其作为预测标记物的评估仍在进行中。采用“自杀基因系统”特异性诱导CAR-T细胞凋亡，有助于降低细胞的毒性反应。有研究构建一种默认为关闭状态，只有在调控药物作用下才会开启的“OnSwitch”CAR-T细胞，用以控制CAR-T作用的时间和剂量，提高治疗的安全性。5.3转染载体的缺陷为获得稳定高效转染，CAR-T目前仍以使用病毒类载体为主。然而病毒载体存在插入突变、有瘤风险等缺陷。非病毒载体的转染方式，比如上文所述的mRNA转染可望成为解决途径之一。5.4神经毒性少数急性淋巴细胞白血病患者在接受针对抗CD19的CAR-T细胞治疗过程中会出现谵妄、语言障碍、无动性缄默或癫痫等神经症状。这些症状通常是自限性的，无需干预可自行缓解，且没有后遗症。神经毒性可能与患者脑脊液中出现CAR-T细胞相关，使用IL-6拮抗剂不能发挥预防作用。症状背后的发生机制未明，仍待探讨。5.5归巢效应CAR-T细胞归巢至肿瘤组织是发挥其抗肿瘤功能的先决条件，也是实体瘤治疗中的研究难点。通过基因编辑使T细胞表达特定的趋化因子受体，可有助于T细胞归巢。研究发现，表达CCR4的细胞能通过识别霍奇金淋巴瘤的标记物CD30定位到肿瘤组织；表达CCR2b的T细胞能更好地靶向治疗神经母细胞瘤。找出引导CAR-T靶向肿瘤的趋化因子，有助于实体瘤中CAR-T的定位。另有研究发现，小鼠胰腺癌肿瘤细胞周边的巨噬细胞能调控细胞的浸润。清除癌旁免疫抑制性的巨噬细胞，可能提高CAR-T细胞疗效。5.6持久性只有持续存活、具有增殖能力的CAR-T细胞才能有效清除病灶、预防复发。一代CAR-T治疗无效的主要原因之一是回输细胞不能持续存活。预先放化疗能够清除抑制性Treg细胞，促进回输CAR-T细胞的存活和增殖，但会增加感染的风险。直接补充或通过基因编辑使CAR-T细胞同时分泌细胞因子，也是提高其持久性的手段。此外，通过多次细胞回输，构建特殊表型的T细胞（如干细胞样记忆性T细胞）或采用病毒共刺激的方法，也能增加CAR-T细胞的体内存活。5.7免疫抑制实体瘤微环境中存在大量的免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞及细胞外基质分子、细胞因子，它们与肿瘤细胞一起，编织成巨大的免疫