《肠毒素试验》word版.doc

肠毒素试验产毒培养：将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基内，37振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL，于37 1h，离心4000r/min 15min，分离上清液，加入0.1%硫柳汞0.05mL，于4保存待用。酶联免疫吸附试验检测LT和STLT检测方法(双抗体夹心法)：(1)包被：先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5mL，混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀，以每孔100L量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4冰箱湿盒中过夜。(2)洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。(3)封闭：每孔加100L封闭液，于37水浴中1h。(4)洗板：用洗涤液洗3次，操作同上。(5)加样本：每孔分别加各冲试验菌株产毒培养液100L，37水浴中1h。(6)洗板：用洗涤液洗3次，操作同上。(7)加酶标抗体：先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100L，37水浴中1h。(8)洗板：用洗涤液洗3次，操作同上。(9)酶底物反应：每孔(包括第一孔)各加基质液100L，室温下避光作用510min，加入终止液50L。(10)结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。ST检测方法(抗原竞争法)：(1)包被：先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔50L加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第一孔留空作对照，置4冰箱湿盒中过夜。(2)洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。(3)封闭：每孔，加100L封闭液，37水浴1h。(4)洗板：用洗涤液洗3次，操作同上。(5)加样本及ST单克隆抗体：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50L，稀释的ST单克隆抗体50L(先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中，混匀备用)，37水浴1h。(6)洗板：用洗涤液洗3次，操作同上。(7)加酶标记兔抗鼠Ig复合物：先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100L，37水浴1h。(8)洗板：用洗涤液洗3次，操作同上。(9)酶底物反应：每孔(包括第一孔)各加基质液100L，室温下避光510min，再加入终止液50L。(10)结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值：（图略）目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。 双向琼脂扩散试验检测LT：将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36经56h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30L，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36经1520h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。乳鼠罐胃试验检测ST将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36培养24h，以3000r/min离心30min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热6030min，每1mL滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02mL。将此滤液用塑料小管注入14日龄的乳鼠胃内0.1mL，同时接种34只，禁食