硕士学位论文-双丙酸倍氯米松生产工艺开发.pdf

加声,次掌 硕士学位论文 暴 、 论文题目 双丙酸倍氯米松生产工艺开发 作者姓名 指导教师 学科传 业 所在学院 提交日期 申请浙江大学工学硕士学位 双丙酸倍氯米松生产工艺开发 作 者王嘉 导 师关怡新 教授 专 业生 物 化 工 浙江大学材料与化学工程学院 化学工程与生物工程学系 年月 几妙如 尸 绍作 “ 功 妙 血 即 兀 初可 , 二 声 本研究承受浙江省科技计划项 目 资助 浙江大学硕士学位论文摘要 摘要 双丙酸倍氯米松,即一 氯一,一 三轻基 一 卜甲基一 孕幽一,一 二烯一,一 二酮一,二丙酸酷,是新一代人工合成的糖皮质 激素,局部抗炎效果显著,对血管有收缩作用,可用于治疗哮喘、 皮肤炎和过敏 性鼻炎。 由于双丙酸倍氯米松可选择性地作用于呼吸器官的组织细胞,影响靶基 因转录的特异环节,所以其气雾制剂在控制鼻炎和治疗哮喘方面比口服药物更有 效也更经济 。目前,国内生产该气雾剂的厂家很多,而原料药却只有少部分为国 产 。 因此,开发一条低成本 、 高收率 、 简单易行及绿色环保的双丙酸倍氯米松合 成工艺路线具有重大的社会效益和经济效益 。 本文结合微生物转化法和化学合成法设计了一条双丙酸倍氯米松的合成工 艺路线 。以环氧黄体酮为原料,经过一 轻化,一 脱氢两步微生物法以及引入 一 甲基和一,一 轻基,一 丙酸醋基,一 双键,一 丙酸酷基和一 氯及 轻基五步化学合成过程,最终获得了含量为的双丙酸倍氯米松,产物总收 率为。 首先,利用紫外线详 射线联合诱变法,筛选得到高产蓝色犁头霉菌以 沁 一,用于一 轻化微生物转化 。 在转化过程中,优化了一 轻化 微生物转化投料方式和发酵工艺。 通过比较甲醇 、乙醇 、,一 丙二醇和,一 二甲 基甲酞胺四种溶剂悬浮投料的转化率大小,确定,一 丙二醇为有机溶剂悬浮投料 方式中的最佳溶剂 。 进一步研究了新型的水溶液悬浮投料方式,在粒径为娜 的底物中,加入水 、 一 环糊精 、吐温和微量乙醇,超声波振荡形成悬浮液后, 直接投料,将叭 投料浓度下的转化率提高到了左右 。 采用多层前传神经 网络和粒子群算法优化了培养基和水悬浮投料添加物配比, 得到最适添加浓度为葡萄糖 巧叭,玉米浆叭,酵母膏叭,硫酸 按,硫酸镁,吐温,一 环糊精,青霉素。 经验证,摇瓶中一 轻化过程在叭投料浓度下转化率达到。采用上述 优化条件和水溶液悬浮投料,进行了发酵罐中蓝色犁头霉的一 经化催化过 程研究,叭 投料浓度底物的转化率仍能达到,有进一步放大的潜力 。 本文还对无细胞催化进行了初步探索,发现轻化酶在破胞后催化效果大大下降, 得到的多为副产物 。 其次,对一 经化产物的简单节杆菌,一 脱氢过程,使用多层前传神经网络和 粒子群算法进行了培养过程的优化,得到最佳培养基配比葡萄糖叭,玉 米浆叭,蛋 白陈留,磷酸二氢钾叭 。在转化过程中,考察了投 料时间、 投料批次 、 料液处理方式和投料浓度对脱氢转化率的影响 。 结果表明一 户 浙江大学硕士学位论文摘要 次性投料操作简单,染菌几率小,在接种后投料最为适宜而多批次投料可 诱导脱氢酶的产生,比一次投料转化率略高,尤以,二次投料为佳有 机溶剂悬浮投料中,乙醇效果最好若采用水溶液悬浮投料,可将叭 底物浓 度下转化率提高到。 本文还初步考察了纤维素硫酸钠聚二甲基二 烯丙基氛化钱微胶囊固定化简单节杆菌的转化情况 。 将简单节杆 菌培养到符合投料标准后包埋于微胶囊内,在培养基中活化后即可用于生物 转化 。 与游离培养不同的是,在固定化微生物转化体系中,有机溶剂悬浮投料方 式效果好于水溶液悬浮投料方式,在低底物浓度下转化率达到以上 。 爪微胶囊的存在削弱了有机溶剂对简单节杆菌生长的不利影响, 固定化细胞有机相 水相两相转化效果优于游离细胞的两相转化 。 第三,采用三甲基氯硅烷和格氏试剂澳化甲基镁进行反应,然后加入间氯过 氧苯甲酸,利用中间产物的重排过程,实现双重轻基化反应,连续引入了 甲基 、一 轻基和一 轻基,减少了反应步骤和副产物,该反应具有高度的区域 选择性,产物的总收率稳定,达到。 然后,用丙酸配反应得到一 丙酸酷 。 该反应较为简单,收率较高,达到。 下一步,采用三乙胺和氯甲酸乙酷的混 合物对原料进行消除反应,得到,一 双键,避免了传统工艺中的,一 双键产物 生成过程,所得产物纯度高,其异构体副产物含量不超过,重结晶后产物含 量达到以上,收率为。接着,在对甲苯磺酸的催化下,对较不活泼的 一 轻基进行丙酞化反应,收率达到。 最后,采用一 氯代丁二酞亚胺 在氮气保护下,合成了带有一 氯和一 轻基的产物,即最终产物双丙酸倍氯米 松,收率为。 关键词双丙酸倍氯米松化学合成微生物转化蓝色犁头霉简单节杆菌 粒子群算法水悬浮投料方式纤维素硫酸钠聚二甲基二烯丙基氯化 按微胶囊固定化 。 了 浙江大学硕士学位论文 ,一一,一 一一一,一一,一一,一, ,一别 的 , 心 ,名, 司 , 山, ,一 卿 冲垃七 刃 , ,一一, 一, 一,一 勿, , ,加, 一,一 而, ,一,一, ,一 、一 林 一,一, , 几一一 , , ,别 旧, 一, , ,一 一, ,一一 脚, 乙 浙江大学硕士学位论文 加盼 ,汕, , , 曲,丽 邝, 一 ,勿 即伽 一一 印 的即 ,助叩爪 , 初田 一, ,山 耐一邝加 , , ,一 勿别 汀 一,一一 冲 , 一 , ,一, 一一冲, 丽 , ,一、 一, ,一一一,诩 一困, 叮, ,川 卯 伽 一一一 浙江大学硕士学位论文目录 目 录 第一章 文献综述 幽类化合物概述 幽类化合物的结构 、 幽类化合物的应用 凿体化合物的化学合成 全合成研究 半合成研究 幽类化合物的微生物转化 街类化合物微生物转化概述 菌类化合物微生物转化的反应类型 幽类化合物微生物转化一 轻化反应 轻化反应机理 幽体一 轻化反应研究进展 具有幽体一 轻化能力的菌种 幽类化合物微生物转化,一 脱氢反应 。, ,脱氢反应机理 幽体,一 脱氢反应研究进展 具有凿体,一 脱氢能力的菌种 微胶囊固定化技术在微生物转化中的应用 微胶囊固定化技术概述 微胶囊固定化技术在微生物转化中的应用 双丙酸倍氯米松的合成 双丙酸倍氯米松的应用 双丙酸倍氯米松的合成步骤 本论文的研究思路及 目标 第二章 双丙酸倍氯米松的合成 弓言 实验材料与仪器 实验材料 仪器设备 分析方法 实验方法 分 浙江大学硕士学位论文目录 双丙酸倍氯米松合成路线 , 一 轻化微生物转化 二 ,一 脱氢微生物转化 一 甲基和一,一 经基的引入 一 丙酸酷基的引入 ,双键的引入 一 丙酸醋基的引入 一 氯及一 轻基的引入 , , 结果与讨论 , 合成产物的结构表征 合成过程分析 本章小结 第三章 环氧黄体酮一 轻化反应 弓言 实验材料与仪器 , , , 菌种与试剂 仪器与设备 , 分析方法 菌体浓度的测定 转化率的测定 高效液相色谱法 薄层层析法 环氧黄体酮溶解度的测定 实验方法 培养条件 菌种筛选 紫外线照射诱变 丫 射线照射诱变 菌种保藏 轻化酶胞外催化 发酵工艺的优化 有机溶剂悬浮投料 水溶液悬浮投料 培养基组成及投料添加物优化 、 发酵罐中一 轻化过程 浙江大学硕士学位论文目录 结果与讨论 菌种筛选 二 紫外线诱变结果 射线诱变结果 经化酶催化生物转化 各种因素对转化率的影响 ,值对转化率的影响 投料方式对转化率的影响 , 培养基及投料添加物组成对转化率的影响 , 底物浓度对转化率的影响 发酵罐中一 轻化过程 本章小结 第四章一 轻基环氧黄体酮,一 脱氢反应 弓言 实验材料与仪器 菌种与试剂 仪器与设备 分析方法 , 生物量的测定 细胞干重的测定 比浊法 转化率的测定 高效液相色谱法 薄层层析法, 酶活的测定 , , 一 轻基环氧黄体酮溶解度的测定 实验方法 , 培养条件 培养基组成的优化 投料方式 有机溶剂悬浮投料 水溶液悬浮投料 分批投料 微胶囊固定化简单节杆菌的研究, 微胶囊固定化简单节杆菌的制备 、 口 浙江大学硕士学位论文目录 微胶囊机械强度的测定一 胶囊内细胞浓度的测定 细胞存活率的测定 两相体系中固定化细胞的培养 结果与讨论 , 发酵工艺的优化 , 对转化率的影响 培养基组成的优化 投料工艺的优化 有机溶剂悬浮投料对转化率的影响 投料时间对转化率的影响 , 投料浓度对转化率的影响 , 水溶液悬浮投料对转化率的影响 微胶囊固定化简单节杆菌的研究 菌龄对固定化简单节杆菌生长的影响 投料方式和浓度对转化率的影响 两相体系中的微胶囊固定化脱氢反应 本章小结 第五章 结论与建议 结论 建议 参考文献 攻读硕士学位期间发表论文情况 致谢 , 附录 少 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 第一章 文献综述 幽类化合物概述 菌类化合物的结构 幽类 化合 物是 一类含有环 戊烷 多氢 菲 核 印妙歇 川 肚的化合物,又称为类固醇 。 一般。 和位有甲基称 为角甲基,则,位上有侧链,其结构通式及命名顺序如图 所示 。它是由三个六元环和一个五元环组成,分别称为、 、和环 。 其中环 、 环 、 环都是环己烷,理论上可以椅式或船式两种构象存在 。 因船 式比椅式空间位阻大,椅式构象比较稳定,故幽体中的环戊烷都以椅式构象存在 。 一般在其母核的和位上有角甲基,、及位上可能有轻基或酮基, 环及环中可能有双键,位上常为含两个碳原子以上的碳链,或某些含氧 、 氮的取代基。 图幽类化合物母核的基本结构 幽体中共有个手性碳原子,。,理论上应有即“ 个 光学异构体,再加上位的手性中心,光学异构体就会更多 。但天然的幽类化 合物有许多共同之处环多为反式稠合心 环多以反式稠合 刀环有顺式和反式两种稠合方式,户环反式为胆幽烷系,一 系和别系一 。 一旧 环顺式则为粪幽烷系,一 系和正系 。常见的幽体结构见图。 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 凿烷雌凿烷 雄幽烷 旧 孕凿烷 胆烷胆凿烷 图常见幽体结构 街类化合物普遍存在于动植物的组织中,目前发现的比较重要的有胆幽醇 、 麦角幽醇 、肾上腺皮质激素 、 性激素 、 胆酸 、 强心昔 、幽类皂素以及留类有机碱 等。幽体激素依其来源与生理功能的不同,可分为皮质激素 和性激素。 皮质激素由肾上腺皮质分泌,在动物体内调 节水盐代谢的为盐皮质激素,如醛固酮,调节糖代谢的为糖皮质激 素,如可的松。糖皮质激素具有抗炎作用,进而发展成为一类凿体 抗炎药 。性激素由性腺分泌,在维持动物的第二性征和生殖过程中起重要作用 。 主要的性激素有雌凿酮、雌二醇、雄幽酮、 翠酮、孕幽酮等 。 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 菌类化合物的应用 街体结构的化合物在医学上应用十分广泛,因维生素的体内代谢产物 ,一 二轻基胆钙化醇具有与幽体激素的相似特征,也把它归为幽体类药物 其中 凿体激素类药物,包括肾上腺皮质激素和性激素类药物是药品生产中的重要领 域,是临床上不可缺少的一类药物,对机体起着非常重要的调节作用。菌体类 药物具有抗炎症、 避孕、 利尿 、 抗毒、 抗过敏、 抗休克作用,广泛应用于风湿性 关节炎、 支气管哮喘等各种疾病的治疗 。 据报道,菌体类药物还可以对某些癌 症产生一定的疗效,尤其对激素依赖性肿瘤,如乳腺癌、 子宫内膜癌等幽体抗 激素如街体抗雌激素、 街体抗孕激素等可抑制肿瘤细胞生长,如果该领域的研究 能取得较大突破,则新型的幽体抗激素有望发展为抗肿瘤新药 。 幽体激素类药物 不仅在临床上不可缺少,而且己经扩大到在畜牧业中的应用 。 如云南大学化学系 开发的新产品一是一种新型幽体植物生长调节物质,对种主要农作物 生长具有显著效果 。维生素则参与人体的钙代谢和骨生长。 据统计,国际市场上幽体激素类药物需求量以每年的速度递增,其中 雌激素占,雄激素 、 蛋白同化激素、 安体舒通等占 一,皮质激素占 以上 。 在药物品种发展方面,目前全世界生产的产品品种非常丰富,上市种类达 种之多,涉及医疗 、畜牧业和饮食保健等各个领域 。 苗体化合物的化学合成 幽体化合物的获得以前主要依靠从生物体内直接提取,随着对其需求量的急 剧增加以及有机合成技术的日益进步,现在已逐步转向由人工方法直接予以合 成,包括化学全合成和半合成方法 。 全合成研究 幽体中的许多化合物都具有强烈的生理作用,大多可以直接作为合成其他药 物的半合成原料,然而 自然界中存在的出体资源由于大量的开发而逐渐短缺 。 也 有些备体类药物如著名的凿体口服避孕药一 一 甲基炔诺酮在 自然 界中是不存在的,只能依靠全合成手段获得,因而菌体化合物的全合成被认为是 药物化学和有机化学研究中的一个非常重要的领域 。年等进行 了最简单的性激素马蔡雌酮的全合成 。年,合成了雌 幽酮。年,合成了表雄酮。,皋酮 和一些一 氧 幽体化合物 。年,川报道 了皂昔元 的合成 。年,成功合成了康丝碱。 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 在多年的发展进程中,留体全合成技术得到了很大的提高和改进,各种新 的反应合成路线不断涌现 。 世纪年代后期,由于各种专一性反应的发现,有 机合成理论和实验技术的发展,促使全合成反应向高级阶段发展 。 以往最后引入 的 环,往往在合成的前期便开始引入了。如合成法,它的合成路线是环 一法 是 环一而法 则 是 环 一一,这些合成路线的开发具有重大的经济意义 。世纪 年代发展了不对称合成技术,进一步为幽体药物的合成开辟了新的前景。同时, 生物模拟多烯环合的方法使具有适当位置的多烯经过一步反应就能合成具有天 然构型的幽体骨架,即从链状或单环化合物一步直接合成环 。 环加成法也 是在这个时期应用到菌体全合成中来的,给合成设计开辟了更大的空间。 近几年 来又有几个新的反应应用到幽体全合成中,如重排反应和分子内反应 。 这一 系列新的合成方法的出现大大提高了幽体合成的效率,使幽体全合成实现了工业 化 。 出体化合物的全合成研究具有重大的科学意义,但幽体化合物的结构往往 比较复杂,合成路线比较长,因此全合成的收率一般偏低 。 半合成研究 由于幽体化合物含有多个手性碳原子,立体结构比较复杂,全合成往往需要 几十步反应,收率较低,而且也很难得到与天然菌体化合物完全柑同的立体结构 。 因此,国内外大多利用天然的幽体化合物为原料经过结构的改造以合成具有预期 结构的化合物,即利用所谓的半合成法 。 通常系将薯预皂昔元先行转化为合适的 合成中间体,然后进一步进行结构的改造 。 半合成使用植物中大量存在的薯裁皂 普元,原料易得,立体结构确定,反应步骤少,成本低 。因此,目前临床上应用 的幽体药物基本上都是由半合成方法制得的。 幽体合成中涉及到许多重要的化学反应, 酮基的保护,可利用其与乙二醇的作用转化为乙二醇缩酮,如图所 不。 卜 图酮基的保护 拼 对于含有几种酮基的幽体化合物,利用不同酮基缩酮化的难易程度的差别, 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 通过控制反应条件,有可能选择性地保护其中的某一个酮基。 对于饱和的凿酮类 化合物,其酮基缩酮化的难易程度与酮基在幽体分子碳骼上所处的位置有关。 其 易于缩酮化的次序通常为。 重排,如图所示 。 肪在酸如硫酸 、 多聚磷酸以及能产生强 酸的五氯化磷 、 三氯化磷、 苯磺酞氯、 亚硫酞氯等作用下会发生重排,生成相应 的取代酞胺 。 在酸作用下,肪首先发生质子化,然后脱去一分子水,同时与轻基 处于反位的基团凡迁移到缺电子的氮原子上,所形成的碳正离子与水反应得到酞 胺 。 一一 、矿一 广 一一 一 一 尸 一一广 一 凡凡 一 一书卜 矿 二 二 二 一 一“ 一订 一 图重排 创 将位乙酞基侧链转变为碳基,通常采用成肪反应经重排而 得,如图所示 。 扭 厉化 图位乙酞基的拨基化 一 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 位轻基的引入,可采用环氧化、嗅代 、 还原法进行。因为菌体环上 位和位的取代基均为 一 取代,而生成的环氧化物易形成 一 取代,因而最后形 成一 轻基,如图所示 。 图位轻基的引入 一 位酮拨基的引入,通常采用体氧化法,使用异丙醇铝和环己 酮为氧化试剂,在 位轻基氧化的同时 位的双键转移到 位,与 位形成的拨基共 扼,如图所示 。 图氧化 位乙酸酷的引入,许多合成的街体抗炎药物常含有位乙酸酷,该 基团的引入是通过侧链拨基的 一 甲基上碘化后,与乙酸钾反应形成而得,如图 所示 。 图位 乙酸酷的引入 翔一 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 一 轻基的引入,主要方法包括微生物转化法,化学合成法和两者相 结合的方法 。 化学合成法相比微生物转化法具有周期较短的优势 。 年,。 等将幽体分子中,一 位酮基用缩氨基脉保护后,对 酮基用硼氢化物还原成一 经基,再脱除保护基团得到一 轻基化合物,合成氢 化可的松,如图所示 。 图氢化可的松的合成 年,等根据菌体结构中不同位置的酮基活性不同,对一 轻 基进行酷化保护,一 酮由于受到较大的立体位阻而不易被还原,共扼的 一 酮 特 别是,一 二烯一一 酮相对于一 酮基也不易被还原 。 通过控制反应条件,一 酮基 和一 酮基可基本不受影响而实现对一 酮基的选择性还原,得到一 轻基幽体 化合物,如图所示 。 图泼尼松龙,一 双乙酸酷的合成 ,一 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 凿类化合物的微生物转化 苗类化合物微生物转化概述 幽体的微生物转化是指利用微生物细胞 酶 对幽体底物的某一特定部位 基 团进行特定的化学反应,使其转化成结构上相类似的更有价值的新化合物,也 称微生物酶法转化 。 它与一般的氨基酸和抗生素的发酵生产不同,所得的产物并 不是营养物质的代谢产物 。 幽体药物在医学中应用较早,但最初的生产基本采用生物提取或化学合成, 产量低,成本高。 直到世纪年代,因微生物转化技术的运用才开始大规模生 产,产生了巨大的经济效益。年美国普强药厂的汀 等首次利用黑 根霉将黄体酮转化为一 轻基黄体酮,转化率高达以上,该法的专一性强, 是化学方法所无法比拟的,至此,人们认识到幽体微生物转化在凿类药物生产中 的重要性 。 此后,人们相继发现细菌 、 放线菌 、 酵母和霉菌的一些菌种可以使踏 体化合物的一定部位发生有效转化,许多化学方法难以解决的反应,利用微生物 转化法可以轻而易举地实现一 。 微生物几乎对幽体每个位置都能进行转化,几 种重要的幽体微生物转化反应如轻化 、 脱氢成为工业上生产幽体激素及其类似物 的重要手段,利用微生物降解胆幽醇及谷幽醇边链制备雄幽烷也在工业生产中得 到了广泛应用 。 目前凿体微生物转化中受到人们广泛关注的领域主要有以下几个方面 将微生物基因工程的新概念应用于笛体微生物转化 提高水不溶性底物的溶解 度 细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利用发展经济有效的产物连续 回收方式 将环糊精等应用于培养基以提高产量。 近年来,微生物对幽体转化 反应的研究随着现代生物技术的发展有了新的进展,不仅能提高某一步转化的专 一性和收率,或寻找某一转化反应代替相应的化学法难合成的反应,而且能综合 应用酶抑制剂 、 生化阻断突变株和细胞膜透性改变等生物技术制得许多幽体药物 生产的关键中间体,从而使复杂的天然资源经几步反应合成了各类性激素和皮质 激素,整个幽体药物工业面貌焕然一新 。 菌类化合物微生物转化的反应类型 微生物对幽体的每一位置包括幽体母核和侧链上的原子或基团都有可 能进行生物转化,涉及的反应类型主要有氧化 、还原 、酉 旨 化 、水解 、酞化 、异构 化 、重排及侧链降解等,见表。 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 表凿体化合物的微生物转化反应类型 几七加 功飞别 氧化反应 经基化 所有幽体母核和角甲基位置均可 轻基化 能在边链上若干位置上轻基化 醉基氧化 氧化饱和链上醉基至酮基 氧化丙烯基或高丙烯基至,不 饱和酮 环氧化作用卯 碳 碳键的裂开 氧的插入形成醋、 醇、 内酪和酸 逆醛醉缩合反应 碳键裂开产生非官能团化的产物 山泳 双键的导入反应 饱和 一 酮和了一酮当体的 位脱 氢 饱和 一 酮和 ,一一 酮幽体的 位脱 氢 伴随着 环芳香化的 位脱氢 ,一 邓一 幽醉的芳香化 轻基 、醋或过氧化合的消除 过氧化反应 ,一 双烯间形成、一 表二氢化 合物 氢过氧化石 杂原子氧化 立体专一性氧化硫醚到亚枫 胺被氧化到酮 还原反应 还原酮到醇 还原醛到醇 还原某氢过氧化物到醉 还原烯醉到伯醇 双键饱和 还原,一酮到犷一酮 还原犷 一 酮到饱和 酮 还原犷,一 酮到了一 一 酮 还原 ,声 一 酮到饱和酮 厌氧性脱轻基 异构化 犷一酮异构化成犷一一 酮 一 高环化 反频哪酮重排 拍 醉差向立体异构 表二氢化合物重排到桥氧醇 结合 轻基乙酞化 搪普化 酚醚形成 胺的乙酞化 幽体生物碱与碳酸相结合 水解 醋化 碳酸醋 内醋 硫酸醋 醚开裂 烯醇醚开裂为酮 酚醚开裂为酚 普开裂为醇 引入杂原子 氮由位醇基幽体形成一 乙酞化 凿体 卤素卤过氢化酶催化导入 微生物转化重要的反应有轻化,脱氢以及侧链的降解等,如表所示 。 在幽 体药物工业生产 中的应用主要分为两大类 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 将天然原料转化为生产留体化合物的普通中间体,如植物皂角昔经化 生成皂角昔配基及降解凿醇边链生成有用的幽体化合物中间体,如雄幽烯 一,一 二酮及雄幽一,二烯一,一 二酮 转化成特殊的幽体化合物中间体,以生产我们所希望得到的产物,如 街体。,及轻化 、 ,脱氢及幽体边链降解 。 表工业上重要的幽体微生物转化反应 介加劝 反应类型 一 轻化 卜轻化 反应底物和产物 黄体酮一黄体酮 化合物氢化可的松 轻化 一 轻化 ,一 脱氢 环芳构化 水解反应 边链降解 一 氟氢可的松、 氟轻基氢化可的松 化合物 一轻甲基化合物 氢化可的松一氢化泼尼松 一 去甲基辜丸素雌二醇 一 醋酸妊娠醇酮,去氧皮质醇 胆幽醇,二烯雄幽 微生物 黑根霉括 即猫 新月弯抱霉脚犷 蓝色犁头霉翔 玫瑰产色链霉菌及 即勿 城功口姗 球墨抱霉沙“ 毕 拍 加咖 简单节杆菌,鹿 攀丸素假单抱杆菌孟 拓 如 中毛棒杆菌 分枝杆菌 认如 口 凿类化合物微生物转化经化反应 经化反应机理 从广义上讲微生物经化反应包括细菌和真菌所进行的轻化反应,而后者比前 者更广泛地应用于出体药物合成领域 。 进行轻化反应的酶可以有不同来源,包括 植物和动物细胞 。 因为酶难以分离且不稳定,利用游离酶进行轻化反应并未得到 广泛应用,事实上大部分幽体微生物轻化反应是利用真菌的生长细胞或静息细胞 进行的 。 无论酶的来源如何,幽体经化酶都是细胞色素依赖的金属酶,其反 应式如下 一 一一 由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物,因此被定义为单氧化酶 。 这种细胞 色素依赖的单氧化酶出现在几乎所有形式的生命体中,以游离或膜结合的 形式存在 。研究结果证实转化到幽体上的轻基是直接取代幽体碳架上的氢原子, 并且取代过程中没有产生立体构象的变化,也不是先通过形成烯的中间体来完成 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 的,也就是说经基取代的立体构象是由原来氢原子所占的空间位置所决定的。 进 一步地,实验确定轻化作用的氧不是来自水中的氢氧基,而是来自空气中的氧, 这一点从理论上说明了工业上用黑根霉转化幽体时需要充分供氧的原因。 凿体握 化反应研究进展 年,汀 等首次利用黑根霉将黄体酮转化为一 轻基黄体酮,解决 了皮质激素合成中的关键问题,转化率达以上 。年,黄鸣龙等用黑根 霉使,一 环氧孕幽 一 烯,一 二酮氧化引入一 轻基,从而开发成功了自薯预 皂素生产可的松的七步法合成路线,这是我国第一个用于凿体药物生产的微生物 合成工艺 。耐 用 一 环糊精存在下的新月弯抱霉。 犷 四勿 尸 放 一菌丝体研究皮质松龙的一 经化,皮质松龙对氢化可的松的生物转 化产率为八 户。一 去甲基一 一 乙基雄苗一一 烯一,一 双酮的一 轻化物是 的关键中间体,应用金龟子绿僵菌可导入该化合物的一 轻基,克服 了化学合成 一 酮一 地索高诺酮的难点,可简化合成路线,减少副反应,底物浓度 为时,转化率可达。一 轻基雄菌一一 烯一,一 二酮是制备激素的非常有 用的一种中间体,通过协 加介菌株催化雄街一一 烯一,一 二酮 即可得到高含量的该物质 。 具有幽体握 化能力的菌种 用于一 轻基化的菌种较多,有新月弯抱霉,黑根霉,金龟子绿僵菌,犁头霉 、 “ 等。新月弯抱霉的应用较多出现在国外的研究报道】中。国内杜连 祥等将其应用于一 轻化一 轻基孕幽一一 烯一,一 二酮一 一 醋酸醋,生产氢化可 的松,但收率和实用价值不是非常理想 。 黑根霉经化产物为 一 型,若要得到应用 广泛的 一 产物,需将一 经基氧化成酮后用钾硼氢进行不对称还原,过程相当复 杂 。 金龟子绿僵菌和犁头霉氧化能力较弱 。 犁头霉可将一 醋酸醋转化 成氢化可的松,转化率达以上,其中 型占,转化率高,发酵条件温和 适中,其 一 型产物可转化为醋酸可的松,适合我国工业上应用,不足之处在于其 专一性不强。 在合成双丙酸倍氯米松过程中,获得一 轻化中间体的目的在于进行下一步转 化,脱氢获得双键,无论一 轻化还是一 轻化对合成都没有影响 。因此选择犁 头霉菌进行一 轻化,有望得到较高的转化率 。 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 凿类化合物微生物转化 声 脱 氢反应 脱氢反应机理 早期认为,脱氢酶的脱氢机理是首先生成含轻基的中间体,然后脱水形成 双键 。 而等脚通过假单抱菌。 对 犷一一 酮类幽体及 一 轻基一 一一 酮类幽体的位脱氢的比较,发现微生物的脱氢转化反应不是先 经过轻基化脱水的过程,而是直接脱去位上的氢 。 年等用球形芽抱杆菌的无细胞提取液进行了脱氢的机理研究, 发现这种脱氢酶在脱氢转化时必须有维生素暇等醒类辅酶参加 。年,户 】 认为理 堆 才对一 烷一,一 三酮,位脱氢过程中有黄素酶参加,反 应机理如图所示 助之尸杖 礴怕 号二自 加之 卜 图幽体,位脱氢反应机理 一 由此可见,菌体位脱氢是在酶催化下先形成了酮烯醇化,然后形成烯醇 氢与酶结合从而直接脱去氢 。 幽体 夕 一 脱氢反应研究进展 凿体母核的,位脱氢是工业化生产皮质激素类药物的一类重要反应 。抗炎 街体激素药物的母核在,位置导入双键后,能成倍地增加抗炎作用。如醋酸 可的松夕 位上导入双键后生成醋酸脱氢可的松,其抗炎作用提高 一倍,并能减 少钠滞留副作用 。化学方法进行,一 脱氢一般采用二氧化硒法,该方法常使产品 中含有少量难以除尽的对人体有害的硒,所以微生物脱氢成为幽体抗炎激素药物 合成中不可缺少的一步 。 虽然幽体的微生物脱氢转化过程会伴随着幽体母核及侧 链的降解,但是所需要的主要产品的收率很高 。 目前,许多临床上常用的重要幽体化合物的生产,特别是大多数具有抗炎能 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 力的肾上腺皮质激素生产中很多均涉及到微生物的,一 脱氢反应,包括氢化泼尼 松耐,凡,凡,甲泼尼龙,场, 凡,凡,地塞米松,、,凡,一,倍他 米松,凡,凡一,帕拉米松朋, ,凡,一,肤轻松,凡,凡一 等 。这些物质的结构通式如图所示 】 。 图一些重要的肾上腺皮质激素的结构 加 具有苗体 夕 一 脱氢能力的菌种 目前,用于幽体母核环脱氢的微生物主要有简单节杆菌、 棒状杆菌、 诺 卡氏菌 、耻垢杆菌等,如表所示 。 表具有,位脱氢作用的微生物菌种 几, 属名种名 节杆菌简单节杆菌,呷 球形节杆菌如 棒杆菌恻简单棒杆菌弓 州 假单抱菌蕊 拓辜酮假单抱菌姚。 荧光假单抱菌姚 扔。刀 芽抱杆菌 活口 “ 才 如球形芽抱杆菌 招口 “ 才 猫 缓慢芽抱杆菌 扭口川姗 分枝杆菌 伍加 。耻垢分枝杆菌州沙口 西 口 阴 胭脂分枝杆菌 伍沙 口口 由动 革分枝杆菌州沙口 诺卡氏菌八 右胭脂红诺卡氏菌 右泌 桔橙诺卡氏菌 伍乞 “翔枷 切 珊瑚诺卡氏菌 帆乞 口 尺 右 口 一般情况下,细菌的脱氢能力强于真菌,其中棒状杆菌、 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 节杆菌和分支杆菌帅活力最大。 球形芽饱杆菌 而。、 诺卡氏菌动 沁 对可的松和氢化可的松皮质醉 也有较高的脱氢活力 【 。 研究表明,对幽体母核有脱氢活性的微生物,较多伴随 着边链降解和位酮基还原以及。 位轻基引起环打开等作用 。 微胶囊固定化技术在微生物转化中的应用 微胶囊固定化技术概述 在多种细胞固定化技术中,微胶囊固定化技术由于操作简单、 损耗小、 生物 相容性好 、 有效保护膜内物质 、 胶囊膜对传质的可控性、 后处理方便等优点,在 固定化技术的开发应用中占有非常重要的地位,一直受到研究者的关注】 。 微胶 囊根据囊膜性质分为不透微胶囊和半透微胶囊两类,其中,半透微胶囊又被称为 “ 生物微胶囊 ”,是生物领域的主要固定化技术 。 生物微胶囊是用一层亲水性的 半透膜,将酶、 辅酶、 蛋白质等生物大分子或微生物、 动植物细胞包封在珠状微 胶囊内,使生物大分子和细胞阻隔在微胶囊的膜内或膜外,而氧气、 营养物质以 及其它小分子的物质可以自由出入半透膜进行物质传递,从而达到催化 、 培养或 免疫隔离的目的。图为生物微胶囊固定化细胞的模式图。 宫养物 班外大分 子物质 小分子钧质口 班内大分子物质 图生物微胶囊固定化细胞的模式图 田 旧 用生物微胶囊是一类典型的由聚电解质络合形成的生物微 胶囊,由前 民主德 国科学院高分子化学所现为高分子化学所的 馆 博士于世纪年代首先开发 。即纤维素硫酸钠 ,是一种聚合物阴离子 。即聚二甲基二烯丙基氯化 按一一一,是一种聚合物阳离子 。 这两种物 质均是溶于水的聚电解质复合物,相互接触可形成半透膜结构,如图所示 。 用生物微胶囊体系具有如下诸多优点制备过程十分简 便,只需一步化学反应便可成囊对微生物无毒,与 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 络合后也无明显毒性该微胶囊是由一层厚约 小林 的多孔性膜围成的 中空球状微囊,可使囊内生物质的空间效应减到最小囊膜物化性质稳定, 不受光、热影响,不溶于大部分有机溶剂如乙醇、丙酮 、丙醇等,在值 一 范围内不发生变化囊膜机械强度高,截留性能良好 。 扮 图聚电解质与络合反应示意图 州 叭 微胶囊固定化技术在微生物转化中的应用 近年来,细胞固定化技术在幽体转化中应用广泛 。用果胶酸钙固定 化简单节杆菌细胞进行了 一 雄烯一,一 二酮转化的研究。等则采用了在 纤维素微粒上通过 一 轻甲基,一 葡糖基脉基团共价固定化简单节杆菌,将氢化 可的松转化为氢化泼尼松,取得了较好的固定化效果 。 海藻酸钙微胶珠由于其 良 好的控释特性,简单有效的收获细胞方式,近几年来受到了很大的关注 。 张瑛等 用聚乙烯醇一 海藻酸钙复合载体包埋简单节杆菌,将得到的固定化细胞进行醋 酸可的松脱氢生成醋酸强的松的反应,后的转化率达到了。王蓓等】利 用海藻酸钙胶珠固定化丙酸杆菌发酵丙酸,研究了包埋和丙酸发酵的最佳条件 。 但是在应用于各领域的过程中,海藻酸钙微胶珠 目前面临着如增加机械强度,改 善渗透性能等多方面的问题 。 用微胶囊技术近年来在微生物固定化培养上也有不少成功 的应用 。等用用微胶囊固定化微生物 菌 株,通 过 微 生 物 的 固定 化 培 养,将 葡 糖 酸 盐 氧 化 成 葡 糖 酮 酸,对 爪生物微胶囊在固定化培养过程中的稳定性进行了详细研究,结 果表明此生物微胶囊的稳定性相当好,可重复培养以上 。在国内,张子儒 等用该微胶囊对红曲霉菌进行固定化后培养,发现与游离培养细胞相比,微囊 化培养的糖耗时间远远少于游离培养,而且在达到稳定后,红曲色素的浓度要高 于游离培养 。 梅乐和对该体系微胶囊的制备过程以及各种影响微胶囊性能的条 件进行了研究,并考察了该体系固定化苏云金杆菌 、 产溶栓酶枯草杆菌 、 酿酒酵 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 母的发酵情况,建立了酿酒酵母微囊化培养生产酒精的动力学模型。 叶子坚等】 采用爪微胶囊对两种乳杆菌进行固定化发酵研究,结果表明,两 种乳杆菌能够在微胶囊内很好地生长和繁殖,比游离培养高出倍以上,并且能 与游离发酵一样产生乳酸,糖耗时间可以缩短,而且进行的多批次发酵显 示了巨大的产酸能力。 季艳艳等【 采用大孔型肿微胶囊包埋假丝 酵母产脂肪酶,产物可以通过膜孔释放到囊外,因而实现了半连续化生产,时空 产率比游离培养高。目前,用微胶囊用于街体微生物转化方 面的研究未见报道 。 双丙酸倍氯米松的合成 双丙酸倍氯米松的应用 双丙酸倍抓米松,又名倍氯米松,倍氯美松双 丙酸酷,氯地米松,为地塞米松的衍生物,分子式为, 分子量为,化学名为一 氯一一 甲基一,一 三轻基 孕幽一,一 二烯一, 二酮一,一 二丙酸酷,结构如图所示,属于典型的糖皮质激素 。 图巧 双丙酸倍氯米松结构式 糖皮质激素是迄今为止最有效的抗炎药物,己被公认为治疗慢性哮喘的一线 药物 。 其中,双丙酸倍氯米松具有抗炎、 抗过敏和止痒等作用,吸入后能增强内 皮细胞 、平滑肌细胞和溶酶体膜的稳定性,抑制免疫反应和平滑肌的收缩反应, 降低抗体合成,防止组胺释放,有效地控制支气管炎症的水肿从而缓解哮喘 。 在 世界哮喘治疗药物市场上属于地位较稳固的一类药 。 双丙酸倍氯米松由英国葛兰素史克公司最先研制成功,年月得到美 国的批准后上市,已载入英国药典版 、美国药典版 、欧洲药典第 版 、日本药局方和中国药典版 。由于双丙酸倍氯米松气雾制剂在控制变应 性鼻炎症状和治疗哮喘方面比口服药物更为有效和经济 。年 日本帝人公司 开发了双丙酸倍氯米松鼻喷雾剂 。年先灵葆雅公司开发了用于哮喘治疗的 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 气雾剂,商品名为劝,年销售额达亿美元。 在国内,自年 准葛兰素重庆制药有限公司生产丙酸倍氯米松气雾剂后,年广州东康药业 也获得气雾剂批文,至今已下达了个批文号 。 现在,上海信谊 、上海天平制 药、 上海复星朝晖、 广州何济公、 山东鲁抗辰欣等多个厂家都能生产双丙酸倍氛 米松制剂,其中商品名为必可酮的药物占据了吸入式新药市场的左右。 从国际幽体激素药物产业发展来看,国外年产量约吨,销售亿 美元,占医药产品销售额的年产量增至吨,销售亿美元, 年均递增年销售额达到亿美元,约占世界医药销售额的, 成为产量仅次于抗生素的第二大类药物,保持快速发展势头。 国家南方医药经济 研究所预测,年全球吸入剂及复方制剂销售额可达亿美元 。 目前生产双丙酸倍氯米松药品的原料多为其他国家生产,国产原料药所占份额很 少 。若能开发一条可操作性强,稳定性好的双丙酸倍氯米松工艺用于工业生产, 则具有可观的社会和经济效益 。 双丙酸倍氯米松的合成步骤 由分子结构图可见,双丙酸倍氯米松在幽体母核的基础上,带有,一 双键, 氯,一 轻基,卜甲基和一,一 丙酸醋基等官能团。 在幽体半合成过程中,主 要需要以下一些步骤来完成,如表所示 。 这些方法各有优缺点,合成路线设 计需要根据实验 目的综合考虑 。 表双丙酸倍氯米松合成中常用方法 介 官能团 一 轻基 合成方法 环氧化法 一 双键 ,一 双键 一 甲基 ,一 丙酞酷基 澳代法 还原法 微生物法 二氧化硒法 上脱澳法 二氯二佩基苯酉 昆 法 微生物法 一 甲磺酸酷法 卜抓代法 重氮甲烷法 格氏反应 原丙酸酷法 丙酞卤代法 浙江大学硕士学位论文第一章 文献综述 本论文的研究思路及目标 本文以环氧黄体酮为原料,结合化学合成和微生物转化的方法设计了一条 双丙酸倍氯米松的生产工艺路线 。 主要步骤包括蓝色犁头霉邝 一 菌株的一 轻化,简单节杆菌切,一菌株 的必 位微生物脱氢转化,引入一 甲基和一,一 轻基,一 丙酸醋基, , 双键,一 丙酸酷基和一 氯及一 经基五步化学合成过程 。 微生物转化过程中,主要着眼于转化率的提高。 通过筛选菌种,优化值 、 培养基成分和配比等发酵条件,添加诱导物,改进投料方式,探索酶的性质和微 胶囊固定化等方法以提高生物转化法轻化和脱氢过程的转化率。 化学合成过程中,意在选择合理的反应和化学试剂,以减少反应步骤,避免 剧毒和易燃易爆试剂的使用,提高位点专一性,降低副产物含量和增加产物收率 。 开发一条绿色合成工艺路线,实现凿体药物的可持续性发展 。 浙江大学硕士学位论文第二章 双丙酸倍氛米松的合成 第二章 双丙酸倍氯米松的合成 伙已 言 “硕卜 刁 在人类及动物体内含有若干种对生理功能有重要意义的激素如副肾皮质激 素 、 雌性及雄性激素等 。 这些物质在动物体内的含量极少,如欲大量生产,就不 能单纯依靠从动物体内提取来获得,而必须利用化学方法来合成 。 在幽体激素 多年来的研究中发现,幽体激素分子结构上的某些改变可以大大增加其疗效, 减少副作用,并能改变作用的专属性 。 这些改变了部分结构的幽体激素在医疗上 应用的范围正在逐渐扩大,相关的化学合成的进展也极为迅速 。 双丙酸倍氯米松的局部抗炎作用相当强大,是地塞米松的数倍 。 这是由于双 丙酸倍氯米松含有,一 双键,一 氯,一 轻基,一 甲基和一,一 两个丙酸酷基 等官能团。 据报道,街体的脱氢衍生物在生理活性上要强于其前体,具有更好 的抗炎和抗过敏活性,且副作用更小 。 如去氢一 甲基皋丸素是一种蛋白同化激 素,有促进人体氮代谢 、 增加蛋白质合成的作用,比一 甲基皋丸素同化效应强, 雄性化副作用小,对治疗再生障碍性贫血有较好的疗效。 二丙酸酷基的引入有 助于增加菌体脂溶性,不容易被生物体降解 。幽体化合物分子中一 轻基的引入 在出体药物化学中也占有极其重要的地位 。某些含一 轻基,特别是一 轻基的 幽体化合物具有十分重要的药理活性 。 现有的高效皮质激素类药物几乎无一例外 地具有一 轻基。 一 氯原子的引入提高了幽体的生理活性 。年等 发现氢化可的松位引入一 氟,其产物的生理活性比原母体强约倍,但存在 钠离子贮留的副作用,位一 氯的引入也有同样功效 。而一 或一 甲基则具 有增强抗炎药效和减弱钠离子贮留的作用 。 并且人们进一步发现,上述由基团引 入而导致的种种改善作用具有加和性 。 本章结合化学合成方法及微生物转化法设计了一条双丙酸倍氯米松的生产 工艺路线 。以环氧黄体酮为原料,经过一系列反应,包括蓝色犁头霉的轻化 转化,简单节杆菌的,一 脱氢转化,一 双键 、一 甲基 、一,一 二轻基 、 ,一 双键 、一 氯及轻基 、一 和一 丙酸醋基的引入,最终生成双丙酸倍氯 米松,获得较高的收率 。 实验材料与仪器 实验材料 ,一 环氧一 孕幽一一 烯一,一 二酮,即环氧黄体酮,由西安益尔集团提供, 浙江大学硕士学位论文第二章 双丙酸倍氛米松的合成 为白色或几乎无色的结晶性粉末,含量大于,分子式为玩 伪,分子量为 。 玉米浆,由华北制药厂提供 。 将化学纯、 分析纯的澳化甲基镁、 三甲基抓 硅烷、 澳化亚铜、 六甲基磷酸三胺、 二氯甲烷、 三乙胺、 氯甲酸乙酷、 对甲苯磺 酸和二甲基甲酞胺进行脱水处理,其它化学试剂均为市售化学纯、 分析纯或色谱 纯 。