小米谷糠蛋白提取分析总结报告.docx

小米谷糠蛋白提取及分析总结报告摘要：本研究采用弱碱水溶液提取和-淀粉酶、碱性蛋白酶复合水解谷糠中的蛋白，使与淀粉结合的不溶性谷蛋白充分溶出，得到水解蛋白；然后采用固定化酵母发酵除去可溶性糖。在精制阶段，采用超滤法去除米糠清蛋白和水解蛋白中的可溶性灰分和游离氨基酸，总提取率达到87.76%.关键词：小米谷糠蛋白；提取；碱法；酶法1项目建设基本情况1.1建设基础谷子是山西主要的小杂粮作物，在我国北方及我省旱作农业中占有重要地位，每年的年产量约为14亿公斤。小米糠是谷子加工小米过程中碾下的麸皮，谷壳和胚芽的混合物，按照谷子的产量估算，我省每年约产生2亿公斤的小米糠，资源十分丰富。研究表明，小米糠中含有约18的优质蛋白，其中包含37的清蛋白、36的球蛋白和22的谷蛋白。但是在国内，绝大部分小米糠都作为动物饲料和肥料处理，没有得到合理的利用。分局国外杂志j.agr.foodchem.报道，小米蛋白具有抵抗化学性肝损伤的作用，但是目前我国还没有从小米或小米糠中提取抗肝损伤功能蛋白的研究的报道。1.2建设目标本项目计划以小米糠为原料，通过弱碱提取和复合酶水解方法提取小米糠蛋白，使小米谷糠中的蛋白质提取率达到85以上，经过处理，最终得到纯度达70以上的小米谷糠蛋白粉，为下一步进行抵抗肝损伤功能研究奠定基础。1.3建设内容与任务小米谷糠脱脂匀浆弱碱浸提两次离心（4000rpm,10min）合并上清液超滤浓缩浓缩液干燥小米糠清蛋白粉 沉淀淀粉酶处理碱性蛋白酶水解离心（4000rpm,10min）上清液固定化酵母发酵降糖微滤除杂超滤浓缩浓缩液干燥小米糠水解蛋白粉 2项目实施与完成情况2.1小米谷糠清蛋白提取研究以脱脂米糠为原料，采用弱碱水溶液提取小米谷糠中清蛋白，脱脂米糠先将粉碎机粉碎，然后称取10g，加蒸馏水100ml，调ph 值为7.5-8，在45-55下提取先后4h、3h然后 4000rpm离心10min，取上清液即为小米谷糠清蛋白。经过两因素两水平的正交实验，可以看出，用弱碱水提取小米谷糠蛋白的最佳条件为ph8,45，在此条件下蛋白提取率为48.34%。在ph7-11范围内,随着ph值的升高 ,蛋白质的提取率升高 ,当ph超过11后，随后再随ph值升高,提取率反而下降 ,且样品液颜色变深。这是因为米糠蛋白质中含有较多的二硫键,以及与体系中植酸、半纤维素等聚集而在弱碱性中溶解度较低, 但碱液可以使米糠蛋白质紧密结构变得疏松 ,同时碱液对蛋白质分子的次级键特别是氢键具有破坏作用 ,并可使某些极 性基团发生解离 ,使蛋白质分子表面的分子具有相同电荷 , 图1 水浴加热从而对蛋白质分子有增溶作用 ,这种增溶作用随碱性强度的增加而增大但当ph再度提高 ,蛋白质过度水解 ,提取率降低 ,同时氨基酸间有可能发生缩合反应 ,生成赖氨酸丙氨酸等有害身体健康的物质，所以本实验选择在弱碱条件下提取（ph 8）。 该过程由郜亚昆同学主要负责，在此过程中学习了设计正交试验的方法，对以后自己设计实验有很大帮助。2.2酶法提取谷糠中的谷蛋白碱性蛋白酶法可以水解谷糠中的谷蛋白，得到水解蛋白。研究选用于枯草杆菌碱性蛋白酶作为谷糠中的谷蛋白的水解酶。碱性蛋白酶的最适ph范围为8.5-9.5。在提取时间和加酶量预试验基础上，设计出米糠蛋白水解温度、水解ph、水解时间及加酶量（u/g）的四因素三水平的正交试验方案。以米糠蛋白提取率为指标，确定最佳提取条件。通过分析结果可以看出，用碱性蛋白酶提取谷糠蛋白时，影响提取率的因素大小顺序为ph加酶量时间温度；提取条件的最佳组合为a3b3c3d2，即每克脱脂小米谷糠加1500u/g的枯草杆菌碱性蛋白酶，调ph9.5,在55恒温水浴锅中保温7h，经验证，在此条件下小米谷糠蛋白提取率为39.42%。综合弱碱提水提蛋白和酶提蛋白在最佳条件下蛋白的总提取率为87.76%。该过程由郜亚昆同学主要负责，在此过程中学习了ph计的使用。通过本实验对以后自己的实验操作有很大的帮助。而且在此实验过程中磨练了耐心。 图2 调ph 2.3 -淀粉酶处理小米谷糠的研究-淀粉酶处理小米谷糠，使与淀粉结合的不溶性谷蛋白充分溶出，提高蛋白的提取率。取适量预处理得到的小米谷糠浆料，调ph值至6.0。随后按设计的正交试验方案加入-淀粉酶水解淀粉，3500rpm离心取沉淀，在105下干燥至恒重后测定所得沉淀的淀粉残留量。通过极差分析可以看出，影响水解提取物中淀粉残留的因素大小为加酶量时间温度；正交试验最佳组合均为a3b3c1,即每克淀粉加200u -淀粉酶，反应时间4h，反应温度80。因此，综合加工成本和性价比，最终确定本工艺加酶量为200u-淀粉酶/g淀粉，反应时间4h，反应温度80。2.4固定化酵母发酵去除蛋白提取液中糖分的研究经测定，提取的米糠蛋白溶液中，还原糖占干物质的29%，含量很高，直接影响到米糠蛋白的纯度。本研究采用固定化酵母法除糖的工艺，固定化酵母是将活化后的酵母细胞封锁在固体材料中，保存其特有的活性，并可以回收重复利用，而且稳定性好，工艺简便，操作连续可控。该过程由徐锦川同学主要负责，在此过程中学习了固定化酵母降糖的原理、固定化酵母的制备及操作流程。通过本实 图3 酵母的固定验对以后自己的实验能力动手能力有很大的帮助。 2.5超滤法精制和浓缩蛋白提取液的研究谷糠清蛋白和水解蛋白的分子量范围在3dk-10kd之间，因此，本研究选择3000道尔顿的中空纤维膜，进行超滤，操作压力控制在0-0.1mpa之间，3kd以下的物质被滤除，3kd以上的物质被浓缩，即得到清蛋白的浓缩液，经过真空干燥得到清蛋白。表1 清蛋白精制前后成分对比表(%)蛋白质还原糖灰分精制前清蛋白33.8437.4324.32固定化酵母除糖后清蛋白43.325.5330.86超滤后的清蛋白浓缩液73.611.127.44滤出液8.526.9850.32 由表1可以看出，清蛋白干物质中还原糖及灰分的含量很高，经过固定化酵母除糖后，还原糖的含量明显降低，但灰分的含量增多了，超滤在蛋白质纯化的过程中最主要的作用是脱盐和浓缩，除糖后的清蛋白溶液经过超滤膜处理后，灰分明显降低，还原糖含量也降低了，清蛋白的纯度明显升高，达到73.61%，滤出液中含有少量蛋白，基本上一半都是灰分，由于超滤膜的对蛋白质的吸附作用及操作过程中的损失，会有少量蛋白质损失掉。该过程由代晨红和郝志萍同学主要负责，在此过程中学习了超滤的原理和使用方法。通过本实验在以后实验中用超滤的方法除杂会比较熟悉。 图4 超滤2.6谷糠清蛋白分子质量的凝胶电泳分析sds-page电泳可以反映分子质量的大小差异，根据蛋白标准品的分子质量与相对迁移率的关系，求出样品中蛋白质的分子量。蛋白质谱带迁移率（rf）的计算公式为：小米谷糠清蛋白的sds-page电泳图谱中主要有十条电泳谱带，所对应的亚基分子量，从上到下依次为85.9kda，66.7kda，41.2kda，36.3kda，29.6kda，25.1kda，22.7kda，19.8kda，16.6kda，15.2kda，其中相对分子量为25.1kda 图5 小米谷糠清白的电泳图和15.2kda的亚基含量较高。 2.7对小米谷糠蛋白抗化学性肝损伤作用的研究 四氯化碳（ccl4）受到肝微粒体酶活化成为三氯甲烷自由基（ccl3）与蛋白质共价结合导致蛋白合成障碍、脂质分解代谢紊乱，引起肝细胞内甘油三酯（tg）蓄积。也能迅速与o2结合转化为过氧化三氯甲烷自由基（ ccl3o2）导致脂质过氧化，从而引起细胞膜的变性损伤，致使酶渗漏以及各种类型的细胞病变，甚至坏死。 2.7.1肝损伤动物试验 成年小鼠，单一性别，每组10-15只。 共设 5 组，分别为正常对照组、 四氯化碳诱导组( ccl4 组) 和 受试样品 低、中、高三个剂量组。 剂量组给予受试样品的剂量分别相当于人推荐量的 5、10 和 30 倍，即分别为 20 mg /kgd、 40 mg /kgd和 120 mg /kgd， 以0.5%羧甲基纤维素钠( cmc) 制成混悬液，每日灌胃给药；正常对照组和 ccl4 组给予等容量 0.5%cmc 混悬液。于试验第 31 天禁食 16 h, ccl4 组和各剂量组一次灌胃, 给予由植物油配制的 5 ml /kg 2%的 ccl4，正常对照组给予等容量植物油, 24h后取血液进行离心，测定血清中alt（谷丙转氨酶）、ast（谷草转氨酶）。 2.7.2结果判定模型成立的前提下， alt、ast两项血液生化指标中任何一项和病理结果均为阳性，可判断受试样品对化学性肝损伤具有辅助保护作用。 该过程有全体成员共同参与，在此过程中向学长学习了饲料的制作方法，动物的分组、饲养、标记、解剖等各个过程。通过本实验我们了解了如何建立和进行动物实验的模型进行功能性实验。 图6 动物实验3项目特色与创新之处目前，国内对大米米糠蛋白提取的工艺已经比较成熟，对小米谷糠的研究并不多，我省小米的小米资源比较丰富，并且小米的蛋白质含量较高；据国外杂志报道，小米蛋白具有抵抗化学性肝损伤的作用，但是目前我国还没有从小米或小米糠中提取抗肝损伤功能蛋白的研究的报道。该项目选用小米谷糠为研究对象，从中提取小米谷糠蛋白粉，为下一步进行抵抗肝损伤功能研究奠定基础。本项目的创新之处在于固定化酵母发酵去除蛋白提取液中糖分的研究。实验过程中测得提取的米糠蛋白溶液中，还原糖占干物质的29%，含量很高，直接影响到米糠蛋白的纯度。为提高米糠蛋白的纯度，本研究采用固定化酵母法除糖的工艺，固定化酵母是将活化后的酵母细胞封锁在固体材料中，保存其特有的活性，并可以回收重复利用，而且稳定性好，工艺简便，操作连续可控。通过固定化酵母发酵除去提取液中的糖分，明显提高了米糠蛋白的纯度。其操作步骤大概如下：1）.海藻酸钠溶液的配制：将20ml蒸馏水杯中加入搅拌子，在高速磁力搅拌下缓慢加入1.4g海藻酸钠，混合均匀后放入电炉小火加热，搅拌至溶均匀，冷却到室温。2）.cacl2溶液：称取15g cacl2，加入150ml水中，配好后加热至沸，灭菌5min，冷却至10以下。3）.活化酵母：20ml蒸馏水，加入绵白糖 0.4g（浓度为2%），煮沸，冷却，降温到30-35，然后加入2g酵母，在32左右水浴锅保温至起泡(1cm左右).4）.固定酵母:将活化后的酵母立即倒入20以下到海藻酸钠中混合均匀，迅速抽入针筒中，滴入5-10的cacl2溶液中，浸泡1min中左右，凝固良好时尽快捞出，放到蒸馏水中冲洗1-2次，除去多余cacl2。5）.发酵降糖：将淀粉酶处理和蛋白酶水解后得到的米糠蛋白上清液预热到30，然后加入固定化酵母，在27-28下密封，保温发酵，每小时搅拌一次，每次1-2min，定时测定发酵液中还原糖的含量，直到还原糖含量不下降为0.01%以下为止。3任务完成情况3.1目前通过弱碱水提及酶提法相结合提取小米谷糠清蛋白和水解蛋白，提取率总共可达87.76%，已经达到85%的计划目标。3.2小米谷糠清蛋白中还原糖及淀粉的含量较高，通过固定化酵母法及超滤法处理后，小米谷糠清蛋白纯度达到73.61%，已经达到70%的计划目标。3.3论文尚未发表，但已经投向农产品加工，题为小米糠功能蛋白的提取与研究，正在审稿中。4项目的应用及推广前景当今社会，由于饮酒、食品污染、药物中毒、食品添加剂摄入过量等原因造成的肝损伤人数不断上升，但是天然的物美价廉的保肝食品非常少见。所以，得到较高纯度的小米谷糠蛋白粉后，下一步准备进行动物实验来评价小米谷糠蛋白的抵抗化学性肝损伤的作用，一经得到验证，利用小米谷糠为原料开发抗肝损伤功能食品有很大应用价值和市场前景。5资金执行情况目前已使用经费：11090元酶制剂、实验材料、试剂、电泳耗材、凝胶色谱、提取分离材料等5320元；称量天平350元；纳滤膜组件（分离能力20升/小时）2000元 实验动物、饲料2600元 市内交通费及其他820元6后续建设思路6.1存在的问题及解决措施本试验采用第一次弱碱水提取、超滤，第二步淀粉酶、枯草杆菌碱性蛋白酶水解法提取、超滤的两步提取法，共得到的蛋白占小米谷糠中总蛋白的86.76%，得率还不理想。原因可能在于，谷糠蛋白在淀粉酶和蛋白酶水解后，提取液在用分子截留量为3000da的超滤膜超滤过程中，少量分子小于3000da的多肽随滤出液滤出，造成总氮的损失。下一步尝试采用分子截留量为1000-2000da的超滤膜超滤，减少进一步总氮的损失，提高得率。前期进行的抗化学性肝损伤动物实验用的原料是弱碱水提法得到的的小米谷糠清蛋白，对蛋白酶水解