毕业设计（论文）-基于云南臭蛙抗菌肽序列特性分析的药物设计策略.doc

成都大学学士学位论文（设计） 毕业设计（论文）题 目 基于云南臭蛙抗菌肽序列特性 分析的药物设计策略 学院(部) 生物产业学院 专 业 药学 学生姓名 学 号 200710516105 年级 07级 指导教师 职称 讲师 2011 年 5 月 27 日22基于云南臭蛙抗菌肽序列特性分析的药物设计策略摘要：目的分析抗菌肽结构与活性之间的关系，提出一种抗菌肽类药物的设计策略，为以后抗菌肽分子的设计和改造提供理论基础。方法采用生物信息学的方法，分别从云南臭蛙抗菌肽的一级结构、二级结构、导肽、信号肽、功能域、保守结构域、疏水/亲水性分析和多序列比对等方面对9种云南臭蛙抗菌肽进行序列特性分析，并以这些抗菌肽序列为模板进行设计和改造。结果云南臭蛙成熟肽均为带正电荷的疏水性蛋白，螺旋是其二级结构的主要元件，该类肽的c端均具有保守的rana-box环状结构。在此基础上，人工合成了一条可能具有抗菌活性的序列：gl(a/v/i)aanflpk(t)af(l)cxxxk(r)kc。结论螺旋和正电荷是保证抗菌肽具备抗菌活性的主要条件，在对成熟肽序列进行氨基酸残基替代或肽链截短后，可化学合成此类抗菌肽，为此类药物的获得提供一条捷径。关键词：云南臭蛙；抗菌肽；生物信息学；药物设计策略drug design strategy based on sequence characteristic analysis of rana andersonii antimicrobial peptides abstract：objective to analyze the relationship between the structure and activity of antibacterial peptides, put forward a design strategy of antibacterial peptide drugs, providing a theoretical basis for the future design and modification of the peptide molecules. method nine kinds of rana andersonii antibacterial peptides were analyzed by using the bioinformatics tools, including the structure of primary and secondary, target and signal peptide, functional domain, conserved domain, hydrophobic/hydrophilic and multiple sequence alignment. resultsmature peptides from rana andersonii are positively charged hydrophobic protein and -helix is the main component of their secondary structure. such peptides all have conservative rana-box ring structure on their c-terminal. based on the results, a peptide: gl (a/v/i) aanflpk (t)af(l)cxxxk(r)kc may have strong activity was synthesized artificially. conlusion-helix structure and positive charge of the peptide are the main factors to the peptides activity. it is a shortcut to obtain the peptide like drugs by amino acid residue substitution or peptide chain truncation.key words: rana andersonii; antibacterial peptide; bioinformatics; drug design strategy 目 录绪论1第1章 材料与方法31.1 材料31.2 方法3第2章 结果与分析52.1 云南臭蛙抗菌肽前体的一级结构分析.52.2 云南臭蛙抗菌肽前体的二级结构分析52.3 导肽的预测和分析62.4 信号肽的预测和分析72.5 抗菌肽保守结构域的分析82.6 抗菌肽蛋白质功能域的分析92.7 抗菌肽前体的序列分析92.8 成熟肽的理化性质及二级结构分析102.9 抗菌肽前体及成熟肽的疏水性/亲水性分析112.9.1 抗菌肽前体的疏水性/亲水性分析112.9.2 成熟肽的疏水性/亲水性分析122.10 抗菌肽前体及成熟肽的多序列比对122.10.1 抗菌肽前体的多序列比对122.10.2 成熟肽的多序列比对13第3章 讨论与结论163.1 抗菌肽的人工设计策略16 3.1.1 正电荷16 3.1.2 可诱导的两亲性结构173.2 结论18致谢19参考文献20绪论近年来，由于抗生素的长期和高剂量使用，诱导产生了具有多种抗生素抗性的微生物菌株，甚至出现了能够耐受几乎所有抗生素的“超级细菌”，给人类健康带来严重危机，寻找一种能够替代抗生素的药物迫在眉睫。抗菌肽是宿主本身免疫防御系统的重要组分，广泛存在于动植物和微生物中，具有抗菌谱广，杀菌快，不易产生耐药性等优点1,2,3。抗菌肽在一般情况下带正电荷，多数致病菌和病变细胞的细胞膜呈电负性。大多数抗菌肽只有与细胞膜结合才能引起细胞膜的破损或渗透到细胞质中阻止生物大分子的合成。当前对抗菌肽的作用机制有多种不同的看法。很多学者认为，抗菌肽通过与细胞膜作用，使膜蛋白凝聚、失活，形成离子通道，引起膜通透性改变，最后导致细菌死亡，即细胞膜损伤机理，如“木桶式”“地毯式”和“环孔式”等机制。也有人认为，抗菌肽通过与细胞膜上存在的特异性受体及其他因子协同作用而导致细菌死亡的，即胞内损伤机理4。由于抗菌肽具有复杂的抗菌机制，可能存在多种作用靶点，而且抗菌肽的耐药性一般不能直接产生，需要在mic下诱导许多代后才有耐药性菌的产生4，故相比于传统抗生素，抗菌肽具有不易产生耐药性的优点。因此，抗菌肽有望成为替代普通抗生素的一类理想的新型药物，成为人类摆脱“耐药菌危机”的新途径。此外某些抗菌肽还能激活免疫系统，参与细胞信号传导，调节细胞增殖，具有抗肿瘤，抗病毒，抗寄生虫功能5, 6 。人们在各种生物体内陆续发现了多种抗菌肽。两栖类作为由水生过渡到陆生的物种，其皮肤在长期进化过程中逐渐建立了通过皮肤分泌抗菌肽等物质有效抵御外来微生物侵袭的天然免疫防御体系7。据记载，在我国古代人们就有利用蟾蜍耳后腺及皮肤分泌物，即蟾酥，用于治疗疔毒、恶肿、疮毒、喉痹、齿痛和破伤风等疾病8。因此，对蛙类抗菌肽进行深入研究和分析具有重要的理论和应用价值。抗菌肽虽然具有很大的开发潜力，但是与传统抗生素相比，抗菌活性还不够理想，抗菌肽要成为药物，还有一定难度。目前主要通过三种途径获得抗菌肽，分别为从生物体内提取纯化，构建抗菌肽基因工程菌株和化学合成4。天然抗菌肽的来源少，含量少，提取成本高，无法满足基本研究需求；通过基因工程获得的抗菌肽抗菌活性差，并可以导致宿主细胞的自杀而存在产量低的问题；然而生物信息学的飞速发展使抗菌肽的化学合成具备了优势并同时为药物的开发提供了新的手段。生物信息学辅助药物设计是生命科学、信息学、物理学、化学等几大学科交叉发展的产物。长久以来在寻找新药物的过程中，传统的方法是基于动物器官、组织、或细胞的药物筛选方式。这种方式虽然行之有效，但存在着时间长、花费大、药物作用机制不明确等明显缺点，而利用生物信息技术手段能快速准确的设计出新颖有效的药物。因此，国内外专家学者纷纷利用生物信息学对抗菌肽进行结构、功能与性质等方面的深入研究。改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是创造高活性抗菌肽和设计新型药物的有效途径。已有大量的研究者在对抗菌肽结构与功能关系、肽链长度、电荷、螺旋度等因素对活性影响的研究基础上，结合生物信息学，有目的地对天然抗菌肽进行改造，获得了活性更高的新肽，成为人们关注的焦点。本文将通过生物信息学的方法，分别从理化性质、导肽、信号肽、蛋白质二级结构、功能域、保守结构域和序列对比等多个方面入手，对9种云南臭蛙抗菌肽进行序列特性分析，并以此为基础来进行抗菌肽类药物的设计，为以后抗菌肽分子的改造和设计实验提供理论基础。虽然抗菌肽的应用存在诸多问题，但是抗菌肽在医药领域有着广阔的应用前景。随着抗菌肽研究工作的深入发展，预计在不久的将来，抗菌肽在医药卫生方面将会发挥更重要的作用。第1章 材料与方法1.1 材料分析所用的云南臭蛙（rana andersonii）抗菌肽序列均来源于已在ncbi上注册的蛋白序列。抗菌肽序列所对应的名称、登录号见表1-1。表1-1 云南臭蛙抗菌肽名称及登录号序号抗菌肽名称登录号1brevinin-1-raa5acz71327.12brevinin-1-raa5acz71271.13brevinin-1-raa5acz71310.14brevinin-1-rab2acz71313.15brevinin-1-raa5acz71301.16 brevinin-1-raa10acz71338.17brevinin-1-raa5acz71282.18brevinin-1-rab2acz71278.19brevinin-1-rab1acz71277.11.2 方法主要工具为计算机和互联网。各分析软件的网站见表1-2。表1-2 生物信息学研究的数据库和软件网址软件网址blast/protparamhttp:/www.expasy.ch/tools/protparam.htmlsignalip 3.0 serverhttp:/www.cbs.dtu.dk/services/signalp/targetp 1.1 serverhttp:/www.cbs.dtu.dk/services/targetp/sopmahttp:/npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.htmlprotscalehttp:/www.expasy.ch/tools/protscale.htmlcdd/cddinter proscanhttp:/www.ebi.ac.uk/tools/interproscan/?elm/clustal w2http:/www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html用blast搜索得到已注册的氨基酸序列；用protparam分析蛋白质的理化性质（分子量、等电点、氨基酸组成、疏水性/亲水性、不稳定系数、电荷数）；用signalip 3.0 server进行信号肽分析；用targetp 1.1 server进行导肽分析；用sopma预测二级结构；用protscale和bioedit进行蛋白的疏水性/亲水性分析；用cdd在线预测蛋白的保守结构域；用inter proscan在线预测蛋白质功能域；用elm预测其蛋白功能位点；多序列比对采用clustal w2进行。第2章 结果与分析2.1 云南臭蛙抗菌肽前体的一级结构分析应用protparam软件对ncbi上公布的9种云南臭蛙抗菌肽序列进行分析，结果见表2-1。由表2-1可以看出，9种云南臭蛙抗菌肽的序列均由7071个基本氨基酸组成，富含谷氨酸（e）、亮氨酸（l），但均不含组氨酸（h）、色氨酸（w）、酪氨酸（y）、吡咯赖氨酸（o）、硒半胱氨酸（u）。这些抗菌肽均含有3个半胱氨酸残基，都可以形成1个分子内二硫键。依据不稳定系数大于40为不稳定蛋白的标准，9种抗菌肽均为不稳定蛋白。从表中数据可以看出，分子量均在8kda左右，等电点在4.95.36之间，具有较强的阴离子性。这9种抗菌肽前体均带负电荷，电荷数在-1-3之间。除了5号抗菌肽前体呈现疏水性，其余均呈现亲水性。表2-1 云南臭蛙抗菌肽前体的理化性质序号分子量/da氨基酸总数理论pi亲水性/疏水性带电情况不稳定系数cys残基数不含有的氨基酸18018.3705.36-0.091-154.323h w y o u28024.4705.36-0.003-149.9038064.4705.36-0.041-150.5048317.7715.12-0.234-241.6358016.4705.360.013-147.6167988.3705.36-0.021-147.6178007.3705.36-0.090-146.5488299.7715.12-0.207-240.4398303.7714.90-0.077-345.672.2 云南臭蛙抗菌肽前体的二级结构分析多肽链借助氢键排列成沿一维方向而呈现有规则的重复构象的二级结构，是氨基酸顺序与三维构象之间的桥梁。二级结构借助范德华力、氢键、静电和疏水等相互作用形成蛋白质的三级结构，从而发挥正常的生物学功能。采用sopma工具预测二级结构，并将9种抗菌肽的二级结构预测结果作对比，得到结果见表2-2。结果显示，在9种抗菌肽的二级结构中，螺旋均为其整体结构中的主要构成元件，如图2-1。螺旋结构存在于许多膜蛋白、信号肽和其它具有膜识别功能的蛋白中9，是许多蛙类抗菌肽所具备的典型结构，对保持其抗菌功能具有决定性作用10。抗菌肽抗菌活性与其形成-螺旋的数量有关11。研究表明9，较高的螺旋度可提高抗菌肽对膜的亲和力，提高抗菌活性。表2-2 云南臭蛙抗菌肽前体的二级结构对比序号-螺旋折叠延伸链一转角无规则卷曲160.00%15.71%4.29%20.00%264.29%15.71%4.29%15.71%352.86%17.14%1.43%28.57%454.93%12.68%4.23%28.17%560.00%15.71%4.29%20.00%657.14%14.29%5.71%22.86%768.57%11.43%5.71%14.29%854.93%12.68%4.23%28.17%971.83%12.68%4.23%11.27%10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | |mftmkkplllpfflgtinlslcqeernaeeerrddsdemnaevekrflpavirvaanvlptvfcaiskkchhhcccceeeeeettceeeeechhhccchhhccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhtchcteh-螺旋 ；e折叠；t转角；c无规则卷曲图2-1 1号抗菌肽前体的二级结构预测2.3 导肽的预测和分析蛋白质在核糖体上合成之后，或者留在细胞质中，或者被运送到其他细胞器中，并形成有功能的空间构象后才能发挥其功能。导肽是一段引导新合成的肽链进入细胞器的识别序列。因此，预测和分析导肽，对正确认识蛋白质的亚细胞定位和功能作用的途径及机制有一定的意义。用targetp 1.1 server对云南臭蛙抗菌肽前体进行导肽预测，结果见表2-3。由表可知，预测的可靠性等级均为1，为sp的概率高达0.9以上。sp表示a signal peptide，即信号肽；mtp表示a mitochondrion targeting peptide，即线粒体导向多肽；s表示secretory pathway，即分泌途径。因此，这9种抗菌肽前体均属于分泌型蛋白，在核糖体合成后，由信号肽引导其前体蛋白到达指定部位，然后产生作用。表2-3 云南臭蛙抗菌肽的导肽的预测结果序号mtpspotherlocrc10.0240.9300.094s120.0240.9510.061s130.0210.9520.072s140.0200.9530.060s150.0220.9520.071s160.0220.9520.068s170.0270.9420.078s180.0200.9530.063s190.0250.9540.051s12.4 信号肽的预测和分析分泌蛋白及细胞膜蛋白均以前体物质多肽的形式合成，其n末端含有作为通过膜时的信号的氨基酸序列，这种氨基酸序列称信号肽或信号序列。用signalip 3.0 server分析云南臭蛙抗菌肽前体的信号肽的存在概率、位置及序列，结果见表2-4。表2-4 云南臭蛙抗菌肽前体的信号肽预测结果抗菌肽序号信号肽概率信号肽切割位点10.9942223slc-qe21.0002223slc-qe30.9992223sfc-qe40.9992223slc-eq50.9992223slc-qe60.9992223slc-qe70.9992223slc-qe80.9982224slc-eq90.9992223slc-eq由表中数据可知，9种抗菌肽前体的信号肽均位于抗菌肽的n端，长度为22个氨基酸残基。9种信号肽序列酶切位点上游的第一个及第三个aa均为丝氨酸（s）和半胱氨酸（c），而这两个氨基酸都具有很小的侧链，符合信号肽的概念 12。由表中数据判断，认为这9种抗菌肽在体内表达的是一个前体蛋白，此蛋白通过翻译后修饰并借助信号肽运送到胞质外的空间发挥作用。2.5 抗菌肽保守结构域的分析蛋白质由多个模体组成，组成这些模体的氨基酸区段行使特异的功能，同时还蕴含着各自的遗传进化信息 13。结构域作为结构功能单位，对于功能复杂的蛋白质的构成具有重要的意义14 。利用ncbi链接的cdd分析这9种抗菌肽前体的保守结构域，得到的结果见图2-2。1. .6.7.8.图2-2 云南臭蛙抗菌肽氨基酸序列保守结构域分析除了9号抗菌肽，其余均含有保守结构域，说明9号抗菌肽在进化上高度不保守。1号抗菌肽的n端包含brevenin，属于brevenin superfamily家族。brevenin家族主要为两栖类动物从皮肤分泌的抗菌肽，包括阿片类的皮啡肽和新皮啡肽，以及抗菌类的dermoseptins 和temporins 。这8条抗菌肽前体的c端均包含一个起防御作用的antimicrobial_1 superfamily家族，此功能域是抗菌肽发挥功能的单位，这是一种从蛙皮肤表面分泌的针对细菌侵染的蛋白。这些肽的结构特征表明它们属于四个已知的家族：brevinin-1家族, esculentin-2 家族, ranatuerin-2家族 和 temporin 家族.。这些抗菌肽的分泌在蛙自我防御过程中起到了重要的作用。2.6 抗菌肽蛋白质功能域的分析不同的功能域具有各自特定的功能，如结合底物、催化反应及活性调节等14。利用inter proscan预测抗菌肽的蛋白质功能域，结果如表2-5所示。由表可知，9种抗菌肽前体均含有brevenin和antimicrobial_1功能域，pf03032和pf08018揭示这9种云南臭蛙抗菌肽具有共同的功能。表2-5 云南臭蛙抗菌肽前体的蛋白质结构域分析结果抗菌肽序号家族起始1pf03032brevenin245pf08018antimicrobial_147702pf03032brevenin245pf08018antimicrobial_147703pf03032brevenin445pf08018antimicrobial_147704pf03032brevenin246pf08018antimicrobial_148715pf03032brevenin245pf08018antimicrobial_147706pf03032brevenin245pf08018antimicrobial_147707pf03032brevenin245pf08018antimicrobial_147708pf03032brevenin246pf08018antimicrobial_148719pf03032brevenin246pf08018antimicrobial_148712.7 抗菌肽前体的序列分析利用elm在线工具对抗菌肽进行分析，分析结果为序列第4547位有两个连续的碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸（-kr-）为前肽转化酶酶切位点。结合以上导肽、信号肽、保守结构域及功能域的分析，并根据其特点找出信号肽区、酸性前肽区及成熟区，如图2-3所示。这些抗菌肽均含有7071个氨基酸残基，为抗菌肽前体，包括n端的22个氨基酸的信号肽、酸性前肽、前肽转化酶酶切位点以及c端的24个氨基酸的成熟肽。同其他蛙类抗菌肽一样，这些抗菌肽是以前体的形式转录，最终以成熟肽的形式分泌。信号肽的切割位点为slc-eq或slc-qe，长度为22个氨基酸残基。在信号肽和成熟肽之间存在一段酸性前肽序列，在抗菌肽成熟过程中，信号肽和酸性前肽分别被切除。云南臭蛙抗菌肽的成熟肽始于前肽转化酶酶切位点lys-arg（k-r）序列之后。| a | b | c | d |mftmkkplllpfflgtinlslc qeernaeeerrddsdemnaeve kr flpavirvaanvlptvfcaiskkcmftmkksllllfflgtinlslc qeernaeeerrddsdemnaeve kr flpavirvaanvlptvfcaiskkcmfpmkkpllllfflgtinlsfc qeernaeeerrddsdemnaeve kr flpavirvaanvlptvfcaiskkcmftmkkpllllfflgtinlslc eqerdadeeerrddpeerdveve kr flpliaglaanflpklfckitkkcmftlkkpllllfflgtinlslc qeernaeeerrddsdemnaeve kr flpavirvaanvlptvfcaiskkcmftlkkpllllfflgtinlslc qeernaeeerrddsdemnaeve kr flpavirvaanvlptafcaiskkcmftlkksllllfflgtnnlslc qeernaeeerrddsdemnaeve kr flpavirvaanvlptvfcaiskkcmftlkkpllllfflgtinlslc eqerdadeeerrddpeerdveve kr flpliaglaanflpklfckitkkcmftlkksllllfflgtinlslc eqerdadeeerrddleerdveve kr ffpliaglaanflpqilckiarkca.信号肽 b.酸性前肽 c.前肽转化酶酶切位点 d.成熟肽图2-3 云南臭蛙抗菌肽的信号肽、酸性前肽及成熟肽的序列分析2.8 成熟肽的理化性质及二级结构分析利用protparam分析成熟肽的理化性质，利用sopma预测成熟肽的二级结构，结果如表2-6和表2-7所示。从表中数据可以发现，9种抗菌肽前体形成4种成熟肽，等电点均大于8，带正电荷，均呈阳离子性。从成熟肽的二级结构预测结果可以看出，螺旋为主要结构，其次还有少量的无归卷曲结构。成熟肽的n端和c端均含有螺旋，这也可能是云南臭蛙抗菌肽有效性的结构基础。从表2-6可以看到，1、2、3、5、6、7号成熟肽n端12位2个氨基酸是非螺旋化的，310位（pavirvaa）为第1个螺旋，该螺旋中除了r，均为疏水性氨基酸；1、2、3、5、7号成熟肽的1516位（tv）形成第2个螺旋，1921位（ais）形成第3个螺旋；6号成熟肽的1521位（tafcais）形成第2个螺旋，该螺旋中极性和非极性氨基酸含量相当，其中t、s、c为极性氨基酸，a、f、i为非极性氨基酸，因此，该螺旋对水和脂都具有亲和性。而4、8、9号成熟肽122位形成一个螺旋，剩下的两个残基分别形成一个转角和无规卷曲。表2-6 成熟肽的理化性质及二级结构分析结果序号分子量/daaa残基数pi亲水/疏水成熟肽的电荷分布及螺旋1、2、3、5、72561.1249.51.279flpavirvaanvlptvfcaiskkc000000+000000000000000+0cchhhhhhhhtccchheehhhttc4、82650.3249.70.975flpliaglaanflpklfckitkkc00000000000000+000+00+0hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhtc62533.1249.51.179flpavirvaanvlptafcaiskkc000000+000000000000000+0cchhhhhhhhtccchhhhhhhccc92648.3249.51.1ffpliaglaanflpqilckiarkc000000000000000000+00+0hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhtc表2-7 成熟肽的二级结构对比序号-螺旋折叠延伸链一转角无规则卷曲1、2、3、5、754.17%8.33%12.50%25.00%4、891.67%0.00%4.17%4.17%662.50%0.00%4.17%33.33%991.67%0.00%4.17%4.17%2.9 抗菌肽前体及成熟肽的疏水性/亲水性分析2.9.1 抗菌肽前体的疏水性/亲水性分析图2-4 1号云南臭蛙抗菌肽前体的疏水性/亲水性预测用proscale对抗菌肽前体进行疏水性/亲水性分析，得到的结果均表现为多肽链n端20个左右的氨基酸残基形成一个明显的疏水区域，c端也表现出极强的疏水性，剩余的肽段表现出亲水性，但9种抗菌肽的具体参数有所不同，如图2-4所示，n端的20个左右的疏水性氨基酸是组成信号肽的氨基酸，对信号肽引导抗菌肽前体与膜脂结合有利。2.9.2 成熟肽的疏水性/亲水性分析信号肽引导抗菌肽到达作用部位，而起主要抗菌作用的是成熟肽，故用bioedit对成熟肽进行疏水/亲水性分析，结果见图2-5。从图可以看出， 除了4、8号成熟肽在c端有几个亲水性残基，其余成熟肽整条肽链均表现为疏水性。疏水性在抗菌肽插入脂质双分子层过程中具有重要作用。疏水的n端和c端可以通过疏水相互作用同质膜结合，从而使抗菌肽发挥抗菌活性。因此疏水性在抗菌肽对质膜产生作用的过程中起关键作用。1 2 3 5 7694 8图2-5 成熟肽的疏水性/亲水性预测2.10 抗菌肽前体及成熟肽的多序列比对利用clustal w2对云南臭蛙抗菌肽前体及其成熟肽序列进行了多重比对，结果见图2-6和图2-7。多序列比对主要用于描述一组序列之间的相似性和差异性关系，以便对序列的特征有一个简明扼要的了解。2.10.1 抗菌肽前体的多序列比对由图2-6可以发现，抗菌肽的前体分子在 n端的信号肽具有很强的保守性；从保守结构域的分析得知，只有1号抗菌肽的信号肽段包含brevenin家族。其中4号抗菌肽的信号肽序列中只有11位的氨基酸残基与1号抗菌肽不同，却不包含brevenin家族的保守结构域，说明p11可能是关键的氨基酸。在29号抗菌肽中，也均缺少1号抗菌肽11位上的氨基酸残基p11。脯氨酸p具有特殊的侧链，该侧链是环状的疏水性的，且与某些酶催化的羟化作用有关，而其余抗菌肽的11位为亮氨酸l，它不具有脯氨酸这一特性，因此p11可能是brevenin家族的保守氨基酸残基。另外，信号肽段含有较多的亮氨酸l，亮氨酸具有脂肪族侧链，虽然无反应活性，但是具有疏水性，能产生疏水相互作用，这与通过protscale对前体抗菌肽的疏水/亲水性分析结果相符合。酸性前肽段也相对保守，其中glu（e）和asp（d）的含量较高。谷氨酸和天冬氨酸在生理条件下带负电荷，其侧链因含有羧基而呈酸性。这9种抗菌肽中都含有一定量的碱性氨基酸r和k，精氨酸r的侧链为3个亚甲基连着一个胍基，由于胍基带有很强的碱性，因此r带有正电荷；而赖氨酸k具有一个含4个亚甲基的长侧链，侧链末端为一个氨基，由于氨基能电离，具有很强的碱性，故k带正电荷。但由于整条肽中的正电荷氨基酸k和r的含量略低于带负电荷的e和d，因此导致整个抗菌肽前体分子带净负电荷。图2-6 云南臭蛙抗菌肽前体的序列比对2.10.2 成熟肽的多序列比对通过理化性质、二级结构预测及多序列比对，可看出这些成熟肽均符合brevenin-1家族抗菌肽的结构特征。brevenin-1家族肽基本由24个氨基酸残基组成，一二级结构较保守，n端第14位多为pro残基，这个残基在分子中产生一种稳定的扭结，这种特性可能在跨膜孔道形成方面起着重要的作用；在c端具有保守性的7肽序列cys-3x-lys/arg-lys-cys，二个半胱氨酸间形成分子内二硫键，使其在c端形成一个7肽的保守环状结构，称为rana-box结构15。由此可知这9种抗菌肽的c端具有rana-box结构。 图2-7 云南臭蛙抗菌肽的成熟肽序列比对1、2、3、5、7号的成熟肽序列相同，6号成熟肽与1、2、3、5、7号的相似度较高，唯一的不同在于第16位的ala，1、2、3、5、7号成熟肽在该位点上为缬氨酸val，这两种氨基酸均为带疏水性侧链的氨基酸，且侧链均无反应活性。然而1、2、3、5、7号成熟肽的螺旋结构含量为54.71%，而6号成熟肽的螺旋结构的含量提高到62.5%，理化性质相似，由此可知，氨基酸ala可能有利于抗菌肽形成螺旋结构。由相关文献得知，ala容易形成螺旋结构，用此氨基酸替代一些残基，可显著提高其活性16。因此从人工合成角度出发，可以在理化性质相似的前提下，通过替换某位的氨基酸残基来提高抗菌肽的螺旋度。根据上文中成熟肽的二级结构分析可以发现，4、8、9号成熟肽的二级结构中各元件的含量完全相同。通过对这3条成熟肽序列的比对，发现4号和8号成熟肽的序列相同，9号成熟肽与其在几个氨基酸残基位点存在不同，9号成熟肽2位为f，1517位为qil，2122位为ar，而4、8号成熟肽分别是第2位为l，第1517位为klf，2122位为tk。在第2和17位上，f即苯丙氨酸phe，具有疏水的芳香族侧链，其芳香环具有化学惰性；亮氨酸l具有脂肪族侧链，无反应活性。两者的相同点在于都具有疏水性，都能产生疏水相互作用。但是，phe能与其他芳香环形成重要的-相互作用，对蛋白质的总体稳定性具有重要的意义。在15位上，谷氨酰胺q为具有极性侧链的不带电荷的氨基酸，该极性侧链能够形成氢键，由于其含有一个酰胺，这个功能基团可作为氢键的供体和受体，但该基团在碱性ph以及极端温度下不稳定，会发生脱酰胺作用，形成对应的酸性侧链；而相同位点上的赖氨酸k为带正电荷的碱性氨基酸。在16位上，亮氨酸l和异亮氨酸i性质相似，均为含有脂肪族侧链的疏水性的氨基酸，且具有疏水相互作用。在21位上，苏氨酸t为具有极性侧链的亲水性不带电的氨基酸，由于其具有羟基，因此能同其它残基形成氢键，而且，苏氨酸侧链上可以发生一个重要反应，即加上一个磷酸基团，形成磷酸苏氨酸，该过程属于蛋白质在核糖体合成后的细胞翻译后修饰，对蛋白质-蛋白质相互作用以及细胞内的信号通路十分重要；而且据相关文献得知，某些抗菌肽thr残基上存在o-连接的侧链糖基化修饰，侧链单糖和双糖修饰能提高其抗菌活性并稳定其构象，化学合成的不含糖基化修饰的比天然的o-连接的糖基化修饰的抗菌肽的抗菌活性强17；而相同位点上的丙氨酸a并无苏氨酸的这些特性，只是一个不带电的非极性氨基酸。在22位上，r和k均为碱性氨基酸，均为rana-box结构的保守氨基酸残基；故这个位点上的氨基酸残基差异对整体影响不大。由此可见，抗菌肽序列中某个氨基酸残基的性质会影响到整条肽的稳定性和抗菌活性，因此可以通过修饰序列中某个或某些氨基酸残基来人工改造抗菌肽，从而提高其稳定性和增强其抗菌活性。由保守结构域的分析结果可知，在这些抗菌肽中，只有9号抗菌肽的成熟肽段不具有antimicrobial_1家族。 将9号成熟肽同18号进行序列比对，排除保守的7肽序列，关键的位点在第2、15、17位。因此，这些位点的氨基酸残基的性质差异可能是使9号成熟肽不具有antimicrobial_1家族保守结构域的关键。将4、8号成熟肽同1、2、3、5、7号的序列进行比较，发现其不同在于4、8号成熟肽的48位为liagl，12位为f，1516位为kl，19位为k，21位为t。a，v，i，l这四种氨基酸的性质相似，均为含有脂肪族侧链的疏水性的氨基酸，因此可以忽略第46、8、16位的差异。但分别在7位上的r和g有所差异。r为碱性氨基酸，甘氨酸g为不带电荷的最简单的氨基酸，然而g通常存在于蛋白质的转角区域或构象柔性区域。在12位上，v、 f均为疏水性的氨基酸，从成熟肽的二级结构分析可以看到，当该位点为v时，不形成螺旋结构，为f时形成螺旋结构。在15位上，t和k均为极性氨基酸，不同点在于苏氨酸为不带电荷且侧链能形成氢键，而赖氨酸侧链带正电荷。从9种抗菌肽的二级结构的含量比对可以看到，4、8、9号成熟肽的螺旋度为91.67%，明显高于其余6条成熟肽。综合以上序列比对结果，可知个别氨基酸残基的不同可能会导致二级结构的不同。某些氨基酸有利于螺旋的形成，而其它某种氨基酸会破坏这种结构的形成。因此可以通过替换特定的氨基酸来提高螺旋度，从而达到提高抗菌肽对细菌质膜的亲和力，提高抗菌活性的目的13。第3章 讨论与结论在过去几年，随着抗生素的大量使用，微生物耐药性增强的问题日益严重，由于耐药菌株的出现使得细菌感染的发生率越来越高，寻找新的抗菌资源迫在眉睫，备受关注。抗菌肽是脊椎动物，非脊椎动物和植物的天然免疫系统的重要组成部分，具有抗菌谱广，杀菌快，不易产生耐药性等优点。抗菌肽应用最广、最具有开发价值的应为药用价值，而且已有抗菌肽被用于某些疾病的治疗，并取得了一定的疗效。因此，抗菌肽很有可能成为替代抗生素及普通抗菌药的新型药物。随着不断深入的研究和开发，在不久的将来，大有开发前景的抗菌肽将大大造福于人类。3.1 抗菌肽的人工设计策略当前抗菌肽研究的热点是对多肽进行设计和改造，从而获得一些具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤甚至抗癌的新型抗菌肽。天然抗菌肽通常都是小分子多肽，容易合成和改造。许多人工合成的抗菌肽都是以天然抗菌肽为蓝本而设计的。抗菌肽分子的基本结构是维持其功能的基础，在维持保守氨基酸不变的情况下，适当的置换或删除一些氨基酸，并不影响抗菌活性16。本文以这9条云南臭蛙抗菌肽的序列为模板来设计，将在成熟肽的一个或多个序列位置上进行氨基酸残基替代或者肽链截短，从而得出具有合适长度，电荷，螺旋等特性的更为有效的新抗菌肽分子。目前为止，大量抗菌肽的结构-活性分析研究揭示了具有抗菌活性所具备的2个主要且必要的条件：（1）正电荷（2）可诱导的两亲性结构18。3.1.1 正电荷带净正电荷是大多数抗菌肽的重要特征，是抗菌肽能与电负性靶膜接触结合的关键。在整个过程中，带净正电荷的抗菌肽首先通过静电相互作用结合在膜上，之后疏水端插入到膜中，或者破坏膜的平衡，或者形成孔洞和离子通道等，导致靶细胞死亡。因此带净正电荷是抗菌肽发挥活性的先决条件。在抗菌肽成熟过程中，信号肽和酸性前肽分别被切除，真正发挥抗菌活性的为成熟肽。故本人就成熟肽的理化性质进行分析，结果表明成熟肽均带净正电荷，均含有34个带正电荷的氨基酸，序列中其余的氨基酸残基均为不带电。对阳离子抗菌肽来说，抗菌肽与微生物外膜作用的初始阶段及进一步与细胞质膜结合都要求有正电荷的存在16。因此在对抗菌肽进行人工改造和设计时，应尽量保留这些带正电的氨基酸。当然，这并不意味着不带电荷的氨基酸都与抗菌活性无关而应被删除，序列中某些特定的区域与抗菌活性密切相关。由上文分析可知，这9种抗菌肽因c端具有rana-box结构而属于环肽类。对环肽的结构-活性的研究提示，切除c-末端或者切除n-末端3个以上的残基会大大减少抗菌活性且其单独的loop区域是完全没有活性的18。因此，从人工设计的角度，c末端的7肽保守序列cys-3x-lys/arg-lys-cys应保留。另有相关研究结果表明，肽链末端的正电荷对活性重要16。从成熟肽的电荷分布可以看到，大多数正电荷都位于该7肽保守序列中。有此可知，富含正电荷的 7肽序列对维持抗菌肽的活性有重要的意义，那么7肽保守序列中的3x也可选用带正电荷的氨基酸。因为正电荷有助于低浓度抗菌肽在靶膜表面聚集从而达到有效杀菌浓度，并且在不增加溶血活性的基础上提高抗菌肽活性13。但是带正电荷氨基酸数量超过临界值，抗菌活性将不再增加。通过相关文献得知，这可能是因为正电荷过高使抗菌肽牢固结合在磷脂头部，降低其穿膜效率；同时正电荷数超过一定临界值导致抗菌肽分子间静电荷斥力强于其与膜的静电引力，阻碍膜上抗菌肽分子的聚集和穿膜孔道的形成，最终表现为抗菌活性下降13。因此，在进行人工设计时，带正电荷的氨基酸数量应保持在适当的范围内。3.1.2 可诱导的两亲性结构由上文可知，除了带阳离子电荷，可诱导的两亲性结构也是抗菌肽具有抗菌活性的必要条件。相关研究表明，抗菌肽在水溶性环境中没有稳定的构象，只有在结合或接近细胞膜时才形成发挥其功能的高级构象。