毕业设计（论文）-峄城主栽石榴品种ISSR分子标记引物筛选.doc

学 士 学 位 论 文峄城主栽石榴品种issr分子标记引物筛选姓 名：学 号：1 指导教师：系 别：专 业： 完成日期：学院学士学位论文作者声明本人声明：本人呈交的学位论文是本人在导师指导下取得的研究成果。对前人及其他人员对本文的启发和贡献已在论文中作出了明确的声明,并表示了谢意。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人和其它机构已经发表或者撰写过的研究成果。本人同意学校根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等有关规定保留本人学位论文并向国家有关部门或资料库送交论文或者电子版,允许论文被查阅和借阅；本人授权枣庄学院可以将本人学位论文的全部或者部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其它复制手段和汇编学位论文（保密论文在解密后应遵守此规定）。 作者签名： 日期： 年 月 日 摘 要本研究以峄城万亩石榴园的石榴幼叶为材料,采用ctab法提取石榴基因组dna。利用电泳和紫外分光光度法分析其完整性、纯度及浓度. 利用issr标记技术对42个石榴品种遗传关系进行了分析。筛选出多态性高的ubc811 issr引物，共扩增出29条dna条带，其中多态性带7条，多态性百分率为21.12%，特异条带1条。【关键词】石榴；issr；种质资源；遗传多样性；亲缘关系abstract 目录第1章 引 言11.1isssr 分子标记11.2本研究的目的与意义4第2章 材料与仪器62.1 材料62.2 试剂72.3 仪器设备8第3章 实验方法93.1 ctab法提取dna93.2 dna浓度和纯度测定方法103.2.1 dna质量检验方法103.2.2 dna的浓度和纯度测定方法103.3 pcr扩增反应103.4 电泳与成像113.5 数据获取与分析11第4章 结果与分析124.1 石榴基因组dna的提取结果分析124.1.1 dna完整性分析及两种提取方法的比较124.1.2 dna纯度和浓度测定结果134.2 issr扩增结果第5章 结论与讨论185.1 讨论185.2结论18参考文献19致 谢22石榴叶中dna提取和rapd体系中引物的筛选第1章 引 言石榴（punica granatum l）为石榴科石榴属落叶灌木或小乔木，又名若榴、丹若、天浆、金罂、狂花等。石榴原产伊朗、阿富汗等中亚一带，从西汉张骞出使西域将涂林安石榴引入我国，至今已有超过2 000 年的栽培历史1，经长期天然杂交及基因突变，以及采用实生、分株、嫁接等多种繁殖方法，使其产生了复杂多样的品种和类型，据不完全统计，我国现有石榴品种资源约200多个，分布南北各地20多个省区。各地研究者对石榴种质资源进行调查研究时，大多都局限于某一地区，各自从不同的角度对石榴进行了种下分类，导致品种混杂、同种异名、同名异种的现象出现2，长期以来，给准确进行品种资源鉴定和利用带来了困难。我们究旨在利用issr标记技术，对石榴的遗传多样性与亲缘关系进行分析，以期为石榴种下分类提供分子依据，为更有效地保护石榴资源及选育新品种提供遗传信息。1.1 issr分子标记 issr(intersimple sequences repeats)即简单序列重复区间标记法，是由zietkiewicz等19947年提出的一种dna标记技术，该技术检测的是2个相近ssr之间的一段短dna序列上的多态性在ssr的3端或5端加锚14个嘌呤或嘧啶碱基，并以此作为引物，通常为1618个碱基序列，对两侧具有反向排列的ssr之间的一段dna序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间issr标记的多态性由于issr引物碱基数量多，退火温度高，可重复性好，非特异性扩增少，真核生物富含ssr序列且变异最快，故issr扩增出的条带多且多态性要比rapd，ssr，rflp等更加丰富issr为显性标记，符合孟德尔遗传规律，并且无需克隆、制备探针、分子杂交等工作，具有简便迅速、高效、实验成本低等优点因此，issr技术现已在遗传多样性8、亲缘关系分析9、遗传作图10、品种鉴定11、进化12等研究方面被广泛应用issr被认为是研究种群遗传多样性的一种非常有效的分子标记手段13171.2本研究的目的与意义枣庄是我国的主要石榴产区之一,栽培面积达1.6万公顷，具有48多个种，被誉为“冠世榴园”。近年广泛开展了种质资源的调查、收集、保存和良种选育工作,并在此基础上，对峄城石榴的种、变种、品种的划分、评价、利用等问题进行了分析研究6。但由于长期的引种和选择,已很难从植物的外部形态上来确定品种的来源和品种间的亲缘关系，存在着同名异种或同种异名的问题8，这给准确进行品种资源鉴定和利用带来了困难。近年来，issr技术在石榴品种鉴定中得到了广泛的应用，但该技术对反应条件要求十分严格,不同材料需要的引物不同，反应条件也需各自优化，才能提高重现性和稳定4,5。引物是否有效及多态性效果会影响石榴品种的分类。本研究以石榴叶片为材料，分别采用ctab法提取石榴基因组dna。利用电泳和紫外分光光度法分析其纯度，选取纯度较高的dna进行试验。第2章 材料与仪器2.1 材料以嫩叶期石榴叶作为实验材料,采集于枣庄峄城万亩石榴园,冷冻保存于-70冰箱。研究材料的名称、产地及分布见表1。表1 实验材料一览表编号 名称 产地1 山东枣庄2 山东枣庄3 山东枣庄4 山东枣庄5 山东枣庄6 山东枣庄7 山东枣庄8 山东枣庄9 山东枣庄10 山东枣庄11 山东枣庄12 山东枣庄13 山东枣庄14 山东枣庄15 山东枣庄16 山东枣庄17 山东枣庄18 山东枣庄19 山东枣庄 20 山东枣庄21 山东枣庄22 山东枣庄23 山东枣庄24 山东枣庄25 山东枣庄26 山东枣庄27 山东枣庄28 山东枣庄29 山东枣庄30 山东枣庄31 山东枣庄32 山东枣庄33 山东枣庄34 山东枣庄35 山东枣庄36 山东枣庄37 山东枣庄38 山东枣庄39 山东枣庄40 山东枣庄41 山东枣庄42 山东枣庄2.2 试剂液氮 巯基乙醇 抗坏血酸（vc） pvp ctab sds 氯仿 异戊醇 edta tris酚 异丙醇 70%乙醇 无水乙醇 eb染液 溴酚蓝 琼脂糖 tbe缓冲液 nacl 10碱基随机引物由宝生物工程有限公司合成,见表2。10taq buffer（-mg2+）,mgcl2, taq聚合酶,dntps,100bpdna ladder marker,10loading buffer均购于宝生物工程有限公司。pcr超纯水,购于生工生物工程（上海）有限公司。表2 所用引物的名称与序列2.3 仪器设备ar1140型电子分析天平 奥豪斯国际贸易（上海）有限公司hh-w42数显三用恒温水箱 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司kdm型控温电热套 山东甑城华鲁仪器公司5415型离心机 made in germanygene amp pcr基因扩增仪 宁波新芝生物科技股份有限公司dycp=30dn型的电泳槽 北京市六一仪器厂dyy-2c型稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂gl-200台式暗箱微型透光仪 江苏海门市麒麟医用仪器厂21 第3章 实验方法3.1 石榴叶片基因组dna的提取3.1.1 ctab法提取dna（1）称取0.2g新鲜的幼嫩叶片，于研钵中，加入液氮，快速研磨到粉状(越细越好) ，把粉末转移到有标记的4 ml离心管中。此步操作应戴手套，防止皮肤冻伤。（2）加入4.5ml 65 预热的ctab 提取液（含有3 %(w/v)ctab、100mmol/l tris-hcl(ph8.0)、50 mmol/ledta(p h8. 0)、2.0 mol/lnacl、5%巯基乙醇），用力振荡12 min，马上放入65 水浴锅中保温45 min以上，其间用手轻微振荡3或4次。（3）从水浴锅中取出样品管加入等体积的氯仿异戊醇(24 1) ，盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动510 min，12 000 r/ min 离心15 min。（4）用移液枪缓慢吸取上层清液到做好标记的1. 5 ml离心管中。此步操作应非常小心，注意不要吸得过多、过快，避免振荡，以免造成蛋白质污染；如果离心层因振荡引起上清液浑浊，将影响提取效果，此时须要再离心。加入等体积等体积的氯仿异戊醇(24 1) ，重复上一步。（5）在获得的上清液中加入预冷的异丙醇，加入量按吸取上清液体积的2 /3计。轻轻上下摇动离心管，注意观察dna将从溶液中析出。如溶液中dna含量较少，将会观察到管中含有白色悬浮的dna颗粒；如样品中dna含量较高，则可观察到白色絮丝状的dna悬浮于溶液中。12000 r/ min离心5min，弃上清液，取沉淀，用75%的乙醇清洗沉淀3次； （6）自然干燥后，加50l双蒸水溶解dna16，17。保存在- 20 冰箱中备用。3.2 dna浓度和纯度测定方法3.2.1 dna质量检验方法将dna在含0. 5 g/m l 溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶中电泳。电泳谱带若有拖尾，则dna降解；若电泳谱带清晰整齐，则提取较成功18。3.2.2 dna的浓度和纯度测定方法采用紫外分光光度计法检测dna的含量，检测260、280 nm处的od值，计算得出dna的含量。测定od260 /od280 值分析dna的纯度。如od260 /od280 = 1. 8 左右， dna含量较高；od260 /od280 1. 8，则有rna污染19。3.3 pcr扩增反应反应体系总体积25l，其中，引物ubc811(10mol/ l)1.25l ，premixce 12. 5 l，模板dna (约25 ng/ l) 1l，剩余体积用ddh2o来补齐。扩增程序为95预变性4min，94变性45s，51.2退火1min20，72延伸2min，进行30 个循环， 72延伸10 min，最后4保存。3.4 电泳与成像扩增产物在1.2% 琼脂糖凝胶中电泳，以溴酚蓝为指示剂。上样10 l (含2 l 点样缓冲液)，上样marker(0.4 g/l )，每孔上样10l。稳压60v， 当溴酚蓝电泳至凝胶尾端约1cm 时停止电泳，电泳时间约需3 h。电泳后在gl-200台式暗箱微型透光仪上观察、照相。3.5 数据获取与分析利用20 条10 碱基随机引物对遗传背景差异大的5个品种的dna进行pcr 扩增，从中筛选出品种间扩增性强、重复性好、多态性好的引物，用于石榴种质资源遗传多样性研究。第4章 结果与分析4.1 石榴基因组dna的提取结果分析4.2 issr扩增结果第5章 结论与讨论5.1 讨论随着生物技术迅速发展，探索石榴的基因资源和遗传基础，需要经常提取dna。目前，提取植物dna的方法很多1。目前用于提取石榴叶中dna的方法主要有sds、ctab法，但不同研究者对这两种方法各有偏爱，一部分学者认为sds法较好，另一些学者则认为ctab法更适用于石榴叶中dna的提取。本试验结果表明，改良sds法提取的dna在完整性、纯度及浓度方面均好于采用ctab法提取的dna，但由于试验时间较短，加上试验条件和技术有限，得出的结论仍需进一步的探究。rapd技术在遗传多样性和系统发育研究中被广泛采用。但该技术对反应条件要求严格，不同材料需要的引物不同，反应条件也需各自优化，才能提高重现性和稳定4，5。引物是否有效及多态性效果会影响石榴品种的分类。关于适用于石榴rapd反应体系的多态性引物，多数研究没有筛选到统用的引物。本文在其他学者筛选的基础上，选取了20对10碱基引物以5种遗传背景差异较大的品种进行筛选，通过观察比较rapd-pcr后的电泳结果，显示多态性引物y34、s2144多态性较好。筛选出的2条引物对其他石榴品种是否具有好的多态性，还需要进一步验证。此外，本研究所用引物数量较少，筛选出的多态性引物较少，如果系统对石榴种质资源进行遗传多样性分析还需要对更多引物进行筛选。5.2结论本研究以石榴叶片为材料，采用改良的sds和ctab法提取石榴基因组dna。实验结果及数据统计分析表明用改良的sds法提取的dna完整性和纯度较好、浓度较高。以5种遗传背景差异大的石榴基因组dna为模板，对用于石榴rapd扩增的多态性引物进行筛选。结果表明，通过比较20条引物扩增产物的电泳结果，引物y34、s2144谱带较清晰、多态性较好，为利用rapd技术分析石榴种质遗传关系提供参考资料。参考文献1 杨荣萍,李文祥,龙雯虹,杨正安.石榴dna提取方法的比较及抗氧化剂对dna质量的影响j.云南农业大学学报,2005,20(5):624-626.2 赵丽华,王先磊.成熟石榴叶片dna提取方法研究j.安徽农业科学, 2009,37(31):15141-15143,15156.3 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