生物技术毕业设计（论文）-弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌感染斑马鱼研究.doc

本科生毕业论文（设计）论 文 题 目：弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌 感染斑马鱼研究 姓 名： 院 系： 生命科学学院 专 业： 生物技术 年 级、班 组： 06级3（1）班 指 导 教 师： 徐州师范大学生命科学学院印制生命科学学院本科学生毕业论文（设计）任务书设计（论文）题目 大肠杆菌感染斑马鱼致病性研究 专业、班级 生物技术06生31 学生姓名 朱静榕 指导教师姓名、职称 吕爱军 下发日期 （任务起止日期： 年 月 日至 年 月 日）设计（论文）的主要内容与要求及其主要技术指标：主要内容：本实验以斑马鱼为研究对象，对，大肠杆菌，进行致病性比较。将斑马鱼置于大肠杆菌的不同浓度，不同温度下，连续观察一个星期，统计致死率。主要技术指标：1.静水式试验 2.大肠杆菌对斑马鱼致病性症状的观察及记录 3.获得一星期的lc50进 度 安 排序号毕业设计（论文）工作进度日期（起止周数）%1收集有关实验资料，材料及实验方法摸索4月14日19日52三种菌对斑马鱼致病性的预实验4月20日26日103三种菌对斑马鱼致病性的预实验4月27日30日104三种菌对斑马鱼致病性的预实验5月3日9日105三种菌对斑马鱼致病性的预实验5月11日13日106三种菌对斑马鱼致病性的预实验5月14日15日 10 7三种菌对斑马鱼致病性的预实验5月16日17日 20 8三种菌对斑马鱼致病性的正式实验准备5月18日 5 9三种菌对斑马鱼致病性的正式实验5月1820日 5 10完成实验总结和毕业论文5月 15同组设计（论文）者：薛军系意见：签字： 年 月 日学院负责人意见：签字： 年 月 日注：1.此任务书由指导教师填写。2.此任务书最迟必须在第七学期16周之前下达给学生。3.此表由院收集存档，以备教务处检查。 徐州师范大学生命科学学院制生命科学学院毕业论文（设计）开题报告表课题题目大肠杆菌感染斑马鱼致病性研究指导教师吕爱军职称教授课题组成员朱静榕，薛军毕业生年级06生31完成时间2010年5月日立题依据1 研究的目的和意义 目的：检测大肠杆菌，对斑马鱼的致病性，并获得致死温度和致死剂量。 意义：斑马鱼是一种亚热带观赏鱼类，具有个体小，产卵周期小，产卵量高，体外受精与发育等特点，同时由于其与人类基因组具有较高相似性，也具有较完整的获得性和天然细胞免疫系统。本实验以斑马鱼为模式动物，分析大肠杆菌的的致病性。2 国内外研究进展及分析 大肠杆菌（escherichia coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。人体与大肠杆菌的关系：在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55经60分钟或60加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。当前大肠杆菌病给养禽业带来的损失越来越大，其难于治愈、死亡率高、极易复发等临床特点，正困扰着基层广大养殖户和兽医工作者。大肠杆菌具有很多毒力因子，包括内毒素，荚膜，型分泌系统，黏附素和外毒素等。立题依据3主要参考文献1康白.与正常微生物群有关的新概念.中国微生态学杂志,1992,4(4):1-52桂远明,何幽峰,吴垠等.生态制品(jy10、jy31复合制剂)饲料添加剂对提高鲤抗病力的研究.中国微生态学杂志,1994,6(6):27-333 jesse d m, melody n n. zebrafish as a model host for streptococcalpathogenesis. acta tropica, 2004, 91(1): 53-684pressley m e, phelan iii p e,eckhard w p,et al. pathogen-esis and inflammatory response toedwardsiella tardainfec-tion in the zebrafishj. developmental & comparative im-munol,2005,29(6):501-513 5 陈阳,吴迪,陈雪燕,赵焕灿,扈鸿霞,cheick a diakite,方维焕*猪链球菌2型分离株对野生斑马鱼的致病性*动物医学进展,2008,29(6):1-56濮俊毅，黄新新，陆承平，2007用斑马鱼检测猪链球菌2 型的致病力，中国农业科学40(11):2655-2658研究内容研究的主要内容：1. 大肠杆菌对斑马鱼毒性的实验2. 获得大肠杆菌对斑马鱼的致死率3. 实验期间斑马鱼的观察及记录技术路线和实施方案1 购买斑马鱼，置于蒸馏水中饲养，同批次斑马鱼驯养一周。2 参照参考文献，分批设计不同预实验浓度，温度大肠杆菌。3 针对预实验结果，设计正式试验的浓度，温度。保证实验条件与预实验及以下实验操作时条件一致。4 实验开始后开始观察斑马鱼，记录鱼死亡数目，时间，并及时清理死鱼。5 实验期间连续充气预期结果1. 预实验获得实验的浓度，温度。2. 正式实验获得致死剂量。3. 获得鱼在试验期间各种现象，整理实验数据，计算结果。4. 撰写毕业论文一篇。指导教师意见（签名） 年 月 日 院系意见（签名） 年 月 日 弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌感染斑马鱼研究朱静榕 指导老师：吕爱军（徐州师范大学生命科学学院，江苏 徐州 221116）补充：弗氏柠檬酸杆菌（citrobacter freundii）感染斑马鱼摘要：以野生斑马鱼为实验对象，采用大肠杆菌（sm）进行斑马鱼感染研究。分别以107-108cfu浓度之间的细菌，在三种温度下进行感染试验。结果表明，饲养温度为20时，几种浓度对斑马鱼的致死率为0%，当饲养温度为25时，菌浓度为107cfu时，死亡率为0%，菌浓度为108时，死亡率为67%，菌浓度为109，死亡率为67%，但半致死时间缩短，当菌浓度为4109时，斑马鱼浸泡在菌液中10min全部内死亡，致死率为100%。当饲养温度为28时，菌浓度为109cfu时，死亡率为67%，出现死亡的时间缩短，半致死时间缩短，都短于25时，当菌浓度为2109时，斑马鱼在浸泡的15min内死亡率67%，48h内死亡率100%。菌的半致死时间也和浸泡斑马鱼时的浸泡时间有关，死亡时间和菌毒性，鱼对菌的免疫能力有关。关键词：大肠杆菌，斑马鱼，感染，致死率，温度，菌浓度，时间escherichia coli infection of the zebrafish experimental studyzhu jingrong supervisor: lv aijun(school of life sciences,xuzhou normal university,xuzhou,jiangsu,221116,china)abstract: zebrafish in the wild for the test object, the use of bacterial infection to study zebrafish, 108-1011cfu respectively，infection in three test temperatures.the results show that rearing temperature of 20 , several lethal concentrations of the zebra fish was 0%, when the feeding when the temperature is 25 , bacteria concentration 107cfu, the mortality rate was 0%, bacteria concentration of 108, died 67%, the concentration of 109 bacteria, the death rate was 67%, but the median lethal time, when the bacterial concentration of 4 109, the zebra fish soaked in liquid medium all died within 10min of death rate was 100%. when the feeding when the temperature is 28 , bacteria concentration 109cfu, the mortality rate was 67%, shorten the time death occurs, lethal time, all shorter than 25 , when the bacteria concentration of 2 109, the zebra fish 15min immersion in mortality 67%, 48h in 100% mortality. semi-lethal strain of zebrafish soaking time and soaking time during the time of death and of the virulence of fish immunity against the bacteria.key words: escherichia coli;zebrafish;infection;fatality rate;temperature; bacteria concentration;time目录引言11材料与方法21.1主要试剂21.2菌株与实验动物21.3斑马鱼浸泡试验21.3.1平板计数21.3.2浸泡斑马鱼22结果与分析33讨论5引言 本实验中所使用的大肠杆菌来自于健康禽类的肠道，肠道菌群的组成是多种多样的，而且每种细菌的数量及分布各不相同。肠道内的细菌根据所起作用可以分为原籍菌群(autocht honous flora)和外籍菌群(allocht honous flora)，或分为固有菌群和非固有菌群等1。鱼类对原籍菌群及外籍菌群的免疫作用是不同的。当肠道菌群进入斑马鱼肠道中，一些适应于肠道环境的种类(一般为厌氧菌)在肠道内成为优势种群，定植下来成为原籍群。所以寄主的免疫活性细胞并不将它视为“非己”，因此并不引起或仅产生低水平的免疫反应。相反，鱼类对外籍菌群的免疫反应是强烈的。侵入人、动物体内的外籍菌很容易引起宿主产生抗体和致敏的免疫活性细胞。鲤进食生态制品后，免疫力增强，其白细胞吞噬率、白细胞吞噬指数、e玫瑰花环形成率等指标明显高于对照组2 大肠杆菌（escherichia coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55经60分钟或60加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。当前大肠杆菌病给养禽业带来的损失越来越大，其难于治愈、死亡率高、极易复发等临床特点，正困扰着基层广大养殖户和兽医工作者。大肠杆菌具有很多毒力因子，包括内毒素，荚膜，型分泌系统，黏附素和外毒素等。斑马鱼 (danio rerio)是一种亚热带观赏鱼类，具有个体小、产卵周期短、产卵量高、体外受精与发育等特点，同时由于其与人类基因组具有较高相似性，也具有较完整的获得性和天然细胞免疫系统3，是国际标准化组织推荐的五大试验鱼种之一，试验得出的数据可以在国际上被认可。斑马鱼作为遗传学、发育生物学研究的模式生物已经得到了较为广泛的应用4。斑马鱼亦存在着较为完整的特异性免疫系统5，而且体本实验以斑马鱼为实验动物，为今后可以通过控制水体的微生物的组成来提高鱼苗的成活率，或人为地添加某些定植力强的有益菌群，令其在鱼苗肠道内产生一定的定植抗力，从而为达到提高鱼体抗病力的目的提供一定的科学参考。1材料与方法1.1主要试剂磷酸二氢钠产自于合肥工业大学化学试剂厂，蛋白胨产自北京双旋微生物培养基制品厂，牛肉浸膏来自于国药集团化学试剂有限公司，氯化钠来自无锡市亚盛化工有限公司，磷酸氢二钠来自于合肥工业大学化学试剂厂，琼脂粉来自于天津市福晨化学试剂厂。1.2菌株与实验动物实验所用的大肠杆菌由徐州师范大学生命科学学院微生物实验室分离鉴定，保存。所用大肠杆菌菌株来自于禽类。试验所用的斑马鱼为市场销售的蓝条纹斑马鱼，采用充分曝气的清水饲养,并在水循环和增氧条件下生活1周以适应环境。1.3斑马鱼浸泡试验1.3.1平板计数将大肠杆菌接种于lb液体培养基37振荡培养24小时，吸光度在之间，4000转/min离心10min,收集菌体，pbs洗1次，再离心一次，在原液浓度基础上稀释10-110-88个梯度，取最低浓度的菌液涂基本培养基平板，在37的培养箱中培养24h，计算平板上长出的菌落数即cfu；计算出菌液浓度。1.3.2斑马鱼创伤处理 用刀片在斑马鱼脊椎上轻轻划一伤口，制造创伤，可增加浸泡时的感染几率。 1.3.3浸泡斑马鱼斑马鱼浸泡实验分为饲养温度25、28两组，对照组则浸泡等量0.65%氯化钠溶液。用菌浓度108109 cfu大肠杆菌细菌进行感染试验，每组4条，浸泡时间1015min，各组分开饲养，定时观察斑马鱼的发病和死亡情况，连续观察5-7d。重复两次实验，取两次实验结果的平均值，以减少实验误差。1.4 细菌分离与鉴定将死亡斑马鱼在70%l酒精中浸泡1min后,无菌条件下剖开腹部,用接种环沾取腹腔液接种至基本培养基平板。在培养箱中37培养过夜后,用长出的菌落与相对应的菌落进行比较分析。2结果与分析2.1 平板计数 将原大肠杆菌菌液稀释8个浓度梯度后涂平板，经37培养24h后，计数平板上的菌落数，取平均值后为4，即原菌液浓度为4109 cfu/ml2.2 菌液od值（600nm）表1大肠杆菌在600nm下的od值table 1 the bacteria concentration od of 600nm项目培养基稀释2倍稀释4倍稀释10倍od值0.081.3090.7780.3452.3 致死情况表2饲养温度为25时，大肠杆菌对斑马鱼的致死率和时间table 2 rearing temperature of 25 , the mortality rate and time of immersion in zebrafish for e.coli 浓度浸泡时间108 (cfu/ml)109 (cfu/ml)4109 (cfu/ml)10min66.7%（2/3）66.7%（2/3）100%(3/3)半致死时间49h13h10min表3饲养温度为28时，大肠杆菌对斑马鱼的致死率和时间table 3 rearing temperature of 25 , the mortality rate and time of immersion in zebrafish for e.coli 浓度浸泡时间109 (cfu/ml)2109 (cfu/ml)10min66.7%(2/3)33.3（1/3）15min66.7（2/3）半致死时间15h9h当饲养温度为25时，浸泡时间为10min,菌液浓度为108cfu时，致死率为66.7%，半致死时间49h，浓度为109cfu，致死率为66.7%，半致死时间13h,浓度为4109 cfu，致死率100%，菌浓度过高。当饲养温度为28时，菌液浓度为109cfu，浸泡10min，致死率为66.7%，半致死时间15h，浓度为2109 cfu，致死率100%，菌浓度高（见表2，3）。综上所述，菌浓度为109cfu，是研究大肠杆菌感染斑马鱼免疫的最佳浓度，且斑马鱼在28饲养，感染更明显。2.4 斑马鱼的临床及病理变化图片没有效果好点的吗？感染后死亡的斑马鱼伤口发红，腮部泛红，腹部膨胀，剖检观察到，肝脏呈现苍白色，腹腔内有较多积水，而空白对照组并无以上现象。3.讨论本实验中所使用的大肠杆菌来自于健康禽类，当饲养温度为25时，浸泡时间为10min,菌液浓度为108cfu时，致死率为66.7%（2/3），半致死时间49h，浓度为109cfu，致死率为66.7%（2/3），半致死时间13h,浓度为4109 cfu，致死率100%（3/3），菌浓度过高。当饲养温度为28时，菌液浓度为109cfu，浸泡10min，致死率为66.7%（2/3），半致死时间15h，浓度为2109 cfu，浸泡15min,致死率100%（3/3），菌液浓度过高。在攻毒方式上,pressley m e等6用迟钝爱德华氏菌(e. tarda)对斑马鱼采用了浸泡、皮肤损伤后浸泡和腹腔注射接种等途径,发现在皮肤未破损的情况下,浸泡法不能成功攻毒。novoa b等7用病毒性出血性败血症病毒(vhsv)采用浸泡法攻毒,效果同样不理想。本试验同样尝试了这3种途径,最终仅腹腔注射有效,表明ss2一般不能通过鳃与皮肤途径直接感染斑马鱼,但某些细菌可感染受环境应激后的斑马鱼8。在饲养条件上,本研究发现鱼群的生活温度和细菌毒力密切相关,水温处于25以下时,106cfu的细菌在腹腔接种攻毒后不能造成斑马鱼死亡,这可能是由于在较低温度下细菌在鱼体内的繁殖缓慢,从而被鱼的免疫系统有效清除所致9。jesse 等5探讨了斑马鱼背肌内注射、腹腔内注射和浸泡等接种途径对ld50 的影响。笔者发现，背肌内注射难以确保注射剂量，注射液体易回溢；此外拔鳞浸泡虽是鱼类免疫常用的途径，但由于斑马鱼体型较小，应激大，影响最终结果。相比而言，腹腔内注射较易操作，且应激反应较小，注射后8 h 之内不出现死亡，是最佳的接种途径10。浸泡时间加长，可以增加菌对鱼的感染几率，使得鱼的免疫系统的反应更加明显，反应时间更短，更易于观察和研究菌对斑马鱼免疫系统的影响。斑马鱼在浸泡的1015min内死亡，是由于菌液浓度过高，与在浸泡过程中缺氧而死。因此，如果斑马鱼在浸泡过程中死亡率过高，此菌液浓度不能用于大肠杆菌对斑马鱼免疫的实验研究。致谢 本论文是在徐州师范大学生命科学学院微生物实验室完成的。从选题，实验设计，撰写到成文都是在吕爱军副教授的精心指导下完成的。吕老师知识渊博，治学严谨，工作勤奋执着，是我学习的楷模。衷心感谢他这几个月来对我实验上的指导和帮助。同时也感谢硕士研究生郑璐师姐在实验过程中给予的帮助。参考文献 1康白.与正常微生物群有关的新概念.中国微生态学杂志,1992,4(4):1-52桂远明,何幽峰,吴垠等.生态制品(jy10、jy31复合制剂)饲料添加剂对提高鲤抗病力的研究.中国微生态学杂志,1994,6(6):27-333abhinanda b,sarkar g k, kumar ss.enzyme producing bacterial flora isolated from fish digestive tracts.aquaculture international,2002,10(2):109-1214 astrid m, van der sar, ben j a, christina m j e. vandenbroucke-grauls and wilbert b. a star with stripes: zebrafish as aninfection model. trends in microbiology , 2004, 12 (10): 451-457.5 jesse d m, melody n n. zebrafish as a model host for streptococcalpathogenesis. acta tropica, 2004, 91(1): 53-686pressley m e, phelan iii p e,eckhard w p,et al. pathogen-esis and inflammatory response toedwardsiella tardainfec-tion in the zebrafishj. developmental & comparative im-munol,2005,29(6):501-513 7novoa b,romero a,mulero v,et al. zebrafish(danio rerio)as a model for the study of vaccination against viral haemor-rhagic septicemia virus (vhsv)j. vaccine,2006,24(31-32):5806-5816 8neely m n, pfeifer j d, caparon m.streptococcus-zebrafish model of bacterial pathogenesisj. infection and immunity, 2002,70(7):3904-3914 9 陈阳,吴迪,陈雪燕,赵焕灿,扈鸿霞,cheick a diakite,方维焕*猪链球菌2型分离株对野生斑马鱼的致病性*动物医学进展,2008,29(6):1-510濮俊毅，黄新新，陆承平，2007用斑马鱼检测猪链球菌2 型的致病力，中国农业科学40(11):2655-2658徐州师范大学毕业论文 (设计)评阅人意见表姓 名朱静榕院系生命科学学院学号06243019专业生物技术题目大肠杆菌感染斑马鱼致病性研究评阅人姓名职称研究方向评 价 项 目abcd选题质量01选题符合专业培养目标，体现综合训练基本要求02题目难易度03