生物工程毕业论文（设计）-绿原酸对成骨细胞增殖的影响.doc

毕业论文(设计)学院： 生命科学学院 专业：生物工程专业 年级：2008级 题目: 绿原酸对成骨细胞增殖 的影响 学生姓名： 学号： 指导教师姓名： 职称: 教授 2012年 5 月 11日中南民族大学本科毕业论文（设计）原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 2012 年 5 月 11 日 目 录摘要1abstract11 前言21.1 中药材接骨草的化学成分及其药用价值21.2 绿原酸简介21.2.1理化性质21.2.2生物活性31.3 成骨细胞简介41.4 细胞增殖速率的检测方法52 实验材料52.1 原材料52.2 试剂62.3 仪器63 实验方法63.1 成骨细胞的分离、原代培养及传代培养63.2 接骨草中化学成分绿原酸溶液的配制73.3 绿原酸对成骨细胞增殖的检测84 实验结果84.1成骨细胞培养84.2 绿原酸对成骨细胞增殖的影响115结果与讨论135.1 实验结果分析135.2实验影响因素分析15致 谢15参考文献16绿原酸对成骨细胞增殖的影响摘要：目的：检测接骨草所含化学成分绿原酸对小鼠成骨细胞增殖速率的影响。方法：从新生小鼠颅盖骨中分离其成骨细胞，经过原代培养和传代培养后，接种于含有接骨草中绿原酸成分的培养基中培养，用mtt法检测其生长速率。结果：接骨草所含化学成分绿原酸对成骨细胞的生长速率有一定的作用。当绿原酸浓度较大时，其对小鼠的成骨细胞有一定的抑制作用，而当绿原酸浓度较低时，其对小鼠成骨细胞有一定的促进作用。关键词：绿原酸；成骨细胞；细胞增殖率the effect of chlorogenic acid on the proliferation rate of osteoblastsabstract: objective: to test the effects of the chemical composition chlorogenic acid from sambucus chinensis lindl on the proliferation rate of primary osteoblasts culture from mice calvaria. method: osteoblasts from neonatal mice calvaria were cultured and subcultured .then they were grown in culture medium containing chlorogenic acid. mtt assay was applied to the effect of chlorogenic acid on proliferation rate of osteoblasts. result: the chemical composition chlorogenic acid of sambucus chinensis lindl have some effect on the proliferation rate of osteoblasts. when the concentration of chlorogenic acid is high, the mice osteoblasts growth will be inhibited. when the concentration of chlorogenic acid is low, the mice osteoblasts growth will be improved.key words: chlorogenic acid; osteoblasts; cell proliferation rate1 前言1.1 中药材接骨草的化学成分及其药用价值图1-1 接骨草接骨草（sambucus chinensis lindl）,别名陆英、白龙骨、冷抗兰、猢狲接竹、痱痒草、血和山、乌骨麻、赤车使者、臭草，属忍冬科接骨木属植物，早在本草纲目中就有记载，是民间常用药。分布浙江、安徽、江西、湖北、湖南、福建、广东、广西、贵州、云南、四川等省区。日本也有分布，多年生高大草本或亚灌木，资源丰富1。全草入药、根能祛风消肿，舒筋活络，治风湿性关节炎，跌打损伤。茎、叶有发汗，利尿，通经活血；治肾炎水肿。全草煎水洗治风疹瘙痒。 全草含黄酮类、酚性成分、鞣质、糖素：种子含氰甙类。唐本草：主水肿，脚气，利大小便，消痰破癖，除积聚，消疔肿。本草拾遗：捣绞汁服，令人吐逆，除胸膈热痰，亦主疟及小儿痞满。植物名实图考：治筋骨及妇人调经多用之。岭南采药录：治淋浊，利小便，消热毒。2广西中药志：治妇女白带及痧气。 但是，其治疗骨折的有效成分尚不清楚。据研究，接骨草全草含黄酮类、酚性成分、鞣质3，糖类、绿原酸(chlorogenic acid)；叶含-谷甾醇(-sitosterol)、-香树精、熊果酸(ursolic acid)、菜油甾醇、豆甾醇(stigmasterol)和多量硝酸钾；根含大量鞣质、还原糖，还含生物碱4。茎、叶均含可水解鞣质。全草含水量挥发油，其主成分为甲基壬基甲酮（methyl-n-nonylketone）。 1.50%煎剂对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌有抑制作用。1.2 绿原酸简介绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用5。与咖啡酸相似，口服或腹腔注射时，可提高大鼠的中枢兴奋性。可增加大鼠及小鼠的小肠蠕动和大鼠子宫的张力。有利胆作用，能增进大鼠的胆汁分泌 。对人有致敏作用，吸入含有本品的植物尘埃后，可发生气喘、皮炎等。1.2.1理化性质 半水合物为针状结晶(水)。110 变为无水化合物，熔点 208 ， 24d-35.2 ( c=2.8)。25 水中溶解度为 4%，热水中溶解度更大；易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸乙酯，难溶于三氯甲烷、乙 醚、苯等亲脂性有机溶剂。 13cnmr(h2o)a：126.6(c-1), 114.1(c-2), 144.2(c-3), 147.0(c-4), 116.0(c-5), 122.6(c-6), 145.9(c-7), 115.2(c-8), 168.9(c-9); b: 76.6(c-1), 38.3(c-2), 70.6(c-3), 72.8(c-4), 71.0(c-5), 37.3(c-6), 180.1(c-7)1 。 绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分。microherb研究表明，在从植物提取过程中，往往通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化。由于绿原酸的特殊结构，决定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂从植物中提取出来，但是由于绿原酸本身的不稳定性，提取时不能高温、强光及长时间加热。建议保存时避光密封低温保存。1.2.2生物活性 绿原酸具有广泛的生物活性，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、止血6、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。1.2.4.1抗菌、抗病毒 杜仲绿原酸有较强的抗菌消炎作用，桃叶珊瑚苷及其多聚体有明显的抑菌作用，桃叶珊瑚苷元对革兰氏阴性、阳性菌都有抑制作用。桃叶珊瑚苷有抑菌、利尿作用，并能促进伤口愈合；桃叶珊瑚苷与葡萄糖苷一起预培养后还会产生明显的抗病毒作用，但其本身开不具有抗病毒功能。日本爱知医科大学加龄医科学研究所经研究确认，从杜仲中提取的碱性物质有抗破坏人体免疫系统病毒的功能，这种物质有可能用于预防和治疗艾滋病。1.2.4.2抗氧化作用 绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、香豆酸等酚类物质789。绿原酸之所以有抗氧化作用，是因为它含有一定量的r-oh基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害。1.2.4.3清除自由基、抗衰老、抗肌肉骨骼老化 绿原酸及其衍生物具有比抗坏血酸、咖啡酸和生育酚 （维生素e） 更强的自由基清除效果，可有效清除dpph自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基，还可抑制低密度脂蛋白的氧化。绿原酸对ddph 自由基清除作用比维生素e、维生素c和咖啡酸要强，可有效清除ddph 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基。在由过氧化氢诱发的小鼠血红细胞的溶血抑制实验中，比较几种有机多酚酸的抑制作用，以绿原酸的抑制作用最强10。绿原酸对自由基的有效清除，能维持机体细胞正常的结构和功能，防止和延缓诸如肿瘤、突变、衰老等病理生理现象的发生11。绿原酸对有效地清除体内自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止和延缓肿瘤突变和衰老等现象的发生具有重要作用。杜仲绿原酸含有一种可促进人体的皮肤、骨骼、肌肉中胶蛋白的合成与分解的特殊成分，具有促进代谢、防止衰退的功能，可用来预防宇航员因太空失重而引起的骨骼和肌肉衰退，同时发现杜仲绿原酸无论在体内还是体外，均有明显抗自由基作用。1.2.4.4抑制突变和抗肿瘤 现代药理实验证明杜仲绿原酸有抗癌和抑癌之功效，日本学者研究了杜仲绿原酸的变异原性抑制作用(antimutagenicity)，发现该作用与绿原酸等抗变异原性成分有关，揭示了绿原酸对肿瘤预防的重要意义。 蔬菜、水果中的多酚类如绿原酸、咖啡酸等可通过抑制活化酶来抑制致癌物黄曲霉毒素b1和苯并a-芘的变异原性；绿原酸还可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果。绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用，被认为是癌症的有效化学防护剂12。1.2.4.5对心血管保护作用 绿原酸作为一种自由基清除剂及抗氧化剂已被大量的试验证明，绿原酸的这种生物活性，对心血管系统能产生保护作用。异绿原酸b对大鼠具有较强促进前异绿原酸b对大鼠具有较强促进前列腺环素（pgi2）的释放和抗血小板凝集作用；对豚鼠肺碎片感应的抗体诱导srs-a释放抑制率达62.3%。异绿原酸c也有促进pgi2释放作用。另外，异绿原酸b对血小板学栓素的生物合成和氢过氧化无诱发的内皮素损伤有极强的抑制作用。1.2.4.6降压作用 经多年临床试验证实的，杜仲绿原酸有明显的降压作用，而且疗效平稳，无毒、无副作用。美国威斯康星大学研究发现杜仲绿降血压的有效成分是松酯醇二葡萄糖苷，桃叶珊瑚甙，绿原酸，和杜仲绿原酸多糖类13。1.2.4.7其它生物活性 由于绿原酸对透明质酸（haase）及葡萄糖-6-磷酸酶（gl-6-pase）有特殊的抑制作用，所以绿原酸对于创伤的治愈、皮肤健康湿润、润滑关节、防止炎症以及体内血糖的平衡调控等都有一定得疗效。绿原酸对多种疾病和病毒还有较强的抑制和杀灭作用。绿原酸有降血压、抗菌、抗病毒、消炎、增高白血球、预防糖尿病、显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用，对急性咽喉炎症有明显的疗效。研究表明，口服绿原酸能够显著的刺激胆汁的分泌，具有利胆保肝的功效；它还可有效抑制h2o2引起的大鼠红细胞溶血作用。1.3 成骨细胞简介骨组织的细胞可分为四种：骨原细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。骨原细胞是骨组织中的干细胞，在骨的生长发育时期，或成年后骨的改造或骨组织修复过程中，它可分裂增殖并分化为成骨细胞。骨组织在人的一生中不断更新，是一种代谢很活跃的组织。成骨细胞是骨发生和骨形成的重要细胞，具有合成、分泌组成骨基质的胶原和糖蛋白的作用，并通过钙化基质形成骨组织14-16。另外成骨细胞在维持机体内环境的稳定，生理机制调节和骨代谢性疾病中亦发挥重要作用。 成骨细胞是由骨原细胞分化，比骨原细胞体大，呈矮柱状或立方形，并带有小突起。核大而圆、核仁清晰。胞质嗜碱性，含有丰富的碱性磷酸酶，碱性磷酸酶是一种在碱性环境下能催化单磷酸水解得糖蛋白，被认为参与矿化，与成骨细胞分化成熟有关17。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。成骨细胞具有产生细胞问质中纤维和黏多糖蛋白的作用。新的细胞问质不断产生，并经过钙化形成骨质，成骨细胞被包埋其中，胞内活动停止，脑浆减少，脑体变形，转变为骨细胞，具有造骨功能18。成骨细胞的体外培养是研究成骨细胞生长代谢和骨组织工程的基础，其基本方法有两种：酶消化法和组织块培养法。酶消化法是将组织块以胶原酶和胰蛋白酶处理，经离心收集细胞，此方法一次可获得大量的细胞，且需时间短，但存在着明显的缺点。酶消化处理时间长达1h以上，对细胞膜表面受体和抗原成分有损害。组织块培养法是利用成骨细胞在体外可移行出骨组织的特点，将骨组织培养，收集爬行生长出的成骨细胞，此方法培养成骨细胞无需额外的酶消化处理，故该方法及可靠又简便，但有培养时间长及细胞产出率低的缺点，一定程度上限制了它的应用。体外培养的成骨细胞具有体内成骨细胞的基本特征，常被用来作为研究药物对成骨细胞影响的模型。因此，本研究从新生小鼠颅盖骨分离纯化成骨细胞，用于探讨该药物对成骨细胞增殖影响的研究。1.4 细胞增殖速率的检测方法细胞的速率直接反应细胞的生长情况。常用的mtt比色法，具有简便、迅速、准确、安全及价廉等优点19。mtt汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。mtt法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）是mosmann201983年报告的，以后此方法得到迅速发展并在临床上得以应用。其原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（mtt）由黄色还原为蓝色的甲瓒，后者溶于有机溶剂（如二甲基亚砜、无水乙醇或酸化异丙醇等），在一定细胞数范围内，形成甲瓒的量与细胞数成正比关系。死细胞和不能进行线粒体能量代谢的细胞不产生甲瓒，细胞所形成的甲瓒的沉淀可通过酶联免疫检测仪测定mtt的量，进而了解细胞的情况21-23。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于mtt经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。2 实验材料2.1 原材料(1)绿原酸粉剂：图2-1 绿原酸粉剂(2)小鼠：从湖北疾控中心购买的无菌小鼠2.2 试剂dmem(gibco,usa)新生小牛血清(gibco,usa)胰蛋白酶trypsin溶液edta双抗（青霉素，链霉素）75%酒精pbs缓冲液蒸馏水去离子水dmem培养液二甲基亚砜mtt溶液2.3 仪器小烧瓶烧杯10ml离心管电子天平co2培养箱（sanyo,co2 lncu bator）电热鼓风干燥箱(101-1ab行型，天津市泰斯特仪器有限公司)冰箱(西门子)高速冷冻离心机（3k15型）倒置显微镜（重庆光学仪器厂）若干个96孔培养板及培养皿立式压力蒸汽灭菌锅96孔板酶联免疫检测仪移液枪和枪头实验用的小剪刀和镊子3 实验方法3.1 成骨细胞的分离、原代培养及传代培养（1）溶剂配制 按照试剂配制方法对pbs溶液、dmem培养基、0.1%trypsin-0.02%edta消化液、双抗等溶液进行配备。 pbs溶液的配制：称取nacl 8克，kcl 0.2克，kh2po4 0.2克，na2hpo4.12h2o 2.89克，溶于1l的蒸馏水中，使其充分溶解。放4避光保存即可。mtt溶液的配制：称取mtt 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液(pbs)或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。（2）灭菌 对实验过程中所需要的枪头、培养皿、烧杯、pbs、剪刀等实验所需物品进行灭菌，烘干备用。用立式过滤器对配置好的dmem培养基进行过滤灭菌，并进行分装。用细胞过滤器分别对消化液、双抗进行过滤灭菌（以上操作应在无菌超净工作台上操作）。（3）细胞培养液配制 在无菌超净工作台上按照含90%dmem培养基和10ml小牛血清进行培养液配置，然后加入100ml双抗备用，总体积为100ml。（4）成骨细胞的分离及传代培养 拉颈处死出生2-3天的小鼠2只，将其投入装有适量75%小烧杯中浸泡10min，以消灭其体表所带的细菌。在超净工作台上用无菌镊子取出小鼠。酒精烧杯即可作为废液缸。将小鼠转移至无菌培养皿中，倾入少量pbs溶液，冲洗2-3次，为了洗去小鼠身上的酒精。 左手用镊子夹住小鼠头部，右手用小剪刀剪开小鼠两耳后的皮肤，再剪开头顶部中间的皮肤，然后用镊子从头部两侧撕开皮肤，往前拨，露出头部颅盖骨。用剪刀将可见的白色颅盖骨剪下，左右各剪一刀剪下完整的头盖颅骨，并在培养皿上用剪刀剔除脑组织，分离出白色透明韧性块状组织，即为颅盖骨。将颅盖骨置于含pbs溶液的培养皿中，用小剪刀再次清除还残留在颅盖骨上的血管及结缔组织，再用pbs清洗1-2次。 将所分离得到的所有颅盖骨转移至另一无菌培养皿中，用剪刀将其剪成1*1mm大小。加入0.1%trypsin-0.02%edta消化液1ml，并将含细胞的消化液移入无菌离心管内，然后将其置于37oc培养箱中消化40min。 在离心管中加入2ml上述配置好的细胞培养液终止消化，然后采用2000rpm离心5min，温度设为20oc。 弃去上清液，加入上述配置好的细胞培养液2ml，用移液管吹匀后，转入培养瓶中培养，盖上培养瓶盖后（瓶盖子不要拧太紧），将其放入5%co2培养箱中，在37摄氏度条件下培养2-3个小时后再取出加入2ml细胞培养液，一开始加入的2ml培养液是为了帮助细胞贴壁生长，然后在将其放回培养箱中培养。 原代培养细胞过程中，每隔3-4天需换液一次。在无菌超净工作台上，将培养瓶内的细胞培养液倒入废液缸中，然后加入含10%小牛血清的新鲜培养液，并加入少许双抗。将换好液的培养瓶放入37oc，5%co2培养箱中继续培养。 每隔24h于倒置显微镜下对细胞进行观察，并记录细胞生长情况（将细胞培养瓶拿出co2培养箱时，注意将瓶盖拧紧，以免造成污染）。（5）成骨细胞的传代培养 观察细胞培养情况，待细胞长满培养瓶时，对细胞进行传代。将长满的细胞培养瓶置于无菌超净工作台上。首先倾去细胞培养液，用3ml pbs清洗两遍，然后向细胞培养瓶中加入0.1%trypsin-0.02%edta消化液1ml，将其放入37oc培养箱中消化5min后，于倒置显微镜下观察细胞消化情况。待大部分细胞变圆并脱落时，即可终止消化。 向细胞培养瓶中加入等量的配置好的细胞培养液，进行终止消化。然后用移液管吸取瓶内细胞悬浮液，并轻轻吹打细胞瓶，将瓶壁上未脱落的细胞吹打下来（吹打过程不要太过于剧烈）。用移液管将细胞悬浮液移入离心管中，设置2000rpm离心5min。 倾去上清液，向离心管中加入2ml新鲜培养液，制备细胞悬浮液，盖上培养瓶盖放入37oc 5%co2培养箱中培养2-3个小时后，再取出培养瓶再无菌超净工作台上向培养瓶中加入2ml细胞培养液，然后再放回培养箱中继续培养。3.2 接骨草中化学成分绿原酸溶液的配制（1）称取100mg绿原酸粉末溶于10ml无血清培养基中，过滤2次，使溶液浓度为10mg/ml。（2）取1ml上述绿原酸溶液+4ml含血清培养基，则绿原酸原液浓度为28.2mm/l。（3）将原液依次稀释20倍,得到不同浓度的绿原酸溶液，浓度依次为1.41mm/l、0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.0881mm/l、0.0441mm/l、0.022mm/l、0.011mm/l、0.00551mm/l。3.3 绿原酸对成骨细胞增殖的检测取出正在进行成骨细胞传代培养的培养瓶，倒出培养液。加入2mlpbs溶液清洗2次，再加入0.1%trypsin-0.02%edta消化液1.5ml进行消化，消化5-8min，待90%细胞变圆并脱离瓶底时，加入3-4ml含10%小牛血清的新鲜培养液，轻轻吹打使其混匀，终止消化。将悬浮液转移至灭菌的离心管中，于2000rpm离心5min，倾去上清液。用1-2ml培养液吹打悬浮细胞，然后用细胞计数板计数。培养成骨细胞以1*104个/ml密度接种于96孔塑料培养板，让细胞贴壁培养3-4h左右后，加入配制好的绿原酸溶液（浓度分别为1.41mm/l、0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.088mm/l、0.044mm/l、0.022mm/l、0.011mm/l、0.00551mm/l）100ml,每组设5个平行孔，在周围不用的孔中加入100ml pbs以保证培养基水分，以防培养基在培养过程中失去水分，然后将96孔板放入37oc培养箱培养。在测定前4-6小时取出96孔板，在无菌超净工作台上加入20ml 1.5mg/ml mtt，继续37摄氏度孵育4小时。取出96孔板，在无菌超净工作台上将孔板内的培养液吸出，加入100ml二甲基亚砜（dmso）溶液，并吹打使其充分混匀，待沉淀溶解充分。在酶标仪上，波长为492nm的条件下测定各孔光吸收值（od值）。每组5个平行，并记录数据。用配置好的不加药的细胞培养液作为空白对照，其他步骤同上。分别于细胞传代培养的1、3天对细胞进行取样，其他步骤同上。以时间为横轴，光吸收值（od值）为纵轴绘制各浓度下细胞生长的柱形图，并作误差线。4 实验结果4.1成骨细胞培养图4-1 细胞原代培养1天图4-2 细胞原代培养3天图4-3 细胞原代培养5天图4-4 细胞原代培养6天图4-5 细胞原代培养9天图4-5 细胞传代培养1天图4-6 细胞传代培养3天4.2 绿原酸对成骨细胞增殖的影响（1） 接骨草化学成分绿原酸对成骨细胞增值速率的原始实验数据表4-1 测成骨细胞培养一天的od值（1）浓度（mm/l)01.410.7050.3530.1760.2440.1830.1830.1790.180.2270.1830.1820.1830.1860.2170.1850.1830.1820.1790.2110.1820.1830.1830.1830.2010.1810.1810.1760.18平均值0.220.18280.18240.18060.1816标准偏差0.01640.001480.0008940.0030490.002881表4-2 测成骨细胞培养一天的od值（2）浓度（mm/l) 0.0881 0.0441 0.022 0.011 0.005510.1750.2050.2640.2570.260.180.2220.2630.2540.2670.1780.280.2540.2590.2610.1790.2210.2560.2440.2590.1790.230.260.2440.247平均值0.17820.23160.25940.25160.2588标准偏差0.001920.02850.004340.007160.00729表4-3 测成骨细胞培养三天的od值（1）浓度（mm/l)01.410.7050.3530.1760.2040.1840.1820.1850.1780.2330.1850.1840.1840.1780.2420.1820.1820.1860.180.2460.180.1840.1850.1770.270.180.1810.1840.178平均值0.2390.18220.18260.18480.1782标准偏差0.02390.002280.001340.0008370.001095表4-4 测成骨细胞培养三天的od值（2）浓度（mm/l) 0.0881 0.0441 0.022 0.011 0.005510.1910.2540.280.2820.2650.1920.2590.2740.3060.2920.1930.2710.2880.3090.2990.1940.2910.2760.3040.2730.1920.2660.2720.2940.219平均值0.19240.26820.2780.2990.2696标准偏差0.001140.01430.006320.011050.0315（2） 加入不同浓度绿原酸溶液后成骨细胞生长柱形图表4-5 成骨细胞不同浓度下的生长情况od值（1）浓度（mm/l)01.410.7050.3530.1760天0.1960.1960.1960.1960.1961天0.220.18280.18240.18060.18163天0.2390.18220.18260.18480.1782表4-6 成骨细胞不同浓度下的生长情况od值（2）浓度（mm/l)0.08810.04410.0220.0110.005510天0.1960.1960.1960.1960.1961天0.17820.23160.25940.25160.25883天0.19240.26820.2780.2990.2696图4-1 不同浓度下成骨细胞生长情况柱形图（1）图4-2 不同浓度下成骨细胞生长情况柱形图（2）5 结果与讨论5.1 实验结果分析从图4-1可看出，与对照组相比，培养一天的成骨细胞的od值在不加药的情况下od 值增长，说明培养一天的成骨细胞有所增长，细胞变多。当加入的绿原酸浓度在1.41mm/l-0.881mm/l时，所测得的od值相较于0天未加药的出现了下降，说明成骨细胞受到了抑制生长。当加入的绿原酸浓度降低到0.044mm/l-0.00551mm/l时，测得的od值比对照组的都要高，说明在此较低的绿原酸浓度下，接骨草的化学成分绿原酸对小鼠成骨细胞生长有一定的促进作用。由于一次测得的数据是服从正态分布的，多次实验数据会在一个范围内发生变动，本实验做五组平行试验以减小误差，通过做显著性差异分析（t检验）可判断每组实验数据组之间是否存在显著性差异。此处就利用显著性差异分析进行试验结果的分析。当p0.05时数据组之间无显著差异；当0.01p0.05是数据组之间存在显著差异；当p0.01时，数据组之间存在极显著差异。表5-1 显著性差异分析数据（1天）浓度（mm/l)01.410.7050.3530.176t检验0.0009880.0009090.0007450.000868od平均值0.220.18220.18240.18060.1816浓度（mm/l) 0.0881 0.0441 0.022 0.011 0.00551t检验0.0004760.4530.0008290.004250.00130od平均值0.17820.23160.25940.25160.2588将对照组的五个od值数据与加不同浓度绿原酸后测得的不同组的五个数据做显著性差异分析，可得除了当加入的绿原酸浓度为1.41mm/l时，两组数据之间无显著性差异，其他加药浓度的数据组与对照组数据之间都存在极显著差异。然后再来分析它们的od值，可得加药浓度为0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.0881mm/l时，它们的od值相较于对照组都有所下降，说明细胞数量较少，对小鼠成骨细胞有一定的抑制作用；而加药浓度为0.0441mm/l、0.022mm/l、0.011mm/l、0.00551mm/l时，它们的od值相较于对照组都有所升高，说明细胞数量增加，对小鼠成骨细胞有一定的促进作用。表5-2 显著性差异分析数据（3天）浓度（mm/l)01.410.7050.3530.176t检验0.0007320.0007520.0009610.00046od平均值0.2390.18220.18260.18480.1782浓度（mm/l) 0.0881 0.0441 0.022 0.011 0.00551t检验0.002410.046980.007720.000930.121od平均值0.19240.26820.2780.2990.2696将对照组的五个od值数据与加不同浓度绿原酸后测得的不同组的五个数据做显著性差异分析，可得当加药浓度为0.00551mm/l时，与对照组数据间无显著性差异，当加药浓度为0.0441mm/l时，两组数据之间有显著性差异，其它加药浓度的数据组与对照组之间都存在极显著差异。然后分析他们的od值，可得加药浓度为1.41mm/l、0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.0881mm/l时，它们的od值相较于对照组都有所下降，说明细胞数量较少，对小鼠成骨细胞有一定的抑制作用；而加药浓度为0.022mm/l、0.011mm/l时，它们的od值相较于对照组都有所升高，说明细胞数量增加，对小鼠成骨细胞有一定的促进作用。综上所述，当加入绿原酸的浓度较低为0.0441mm/l、0.022mm/l、0.011mm/l、0.00551mm/l时，对小鼠成骨细胞有一定的促进作用；当加入的绿原酸浓度较高为1.41mm/l、0.705mm/l、0.353mm/l、0.176mm/l、0.0881mm/l时，对小鼠成骨细胞有一定的抑制作用。5.2 实验影响因素分析实验过程中难免会有实验的误差从而影响实验数据的精确度，其中包括了人为误差及机器误差。在mtt检测的过程中要将孔内液体充分吹打均匀，选择适当得细胞接种浓度。避免血清干扰：一般选小于10的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。mtt实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。用96孔板培养细胞做mtt测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少mtt和dmso合适，根据书上说的加200ul1640,20ulmtt,150uldmso 加dmso之前要尽量去掉培养液，便于dmso溶解甲臜颗粒进行比色测定。一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在10000个/ml，mtt加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul dmso，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。在细胞培养的过程中要特别注意保持无菌，在超净工作台上操作，用离心机离心小鼠成骨细胞时，离心管也应用薄膜紧紧封住，操作过程中都需带好手套，并使用酒精。致 谢在这个夏季，我四年的大学学生生涯即将划上一个句号，记得刚到学校时，会对武汉的天气报以哀怨，会嫌弃学校的食堂，会嫌弃图书馆前飘着“香气”的南湖，还会很讨厌洗澡时要排着长长的队伍等候位置，但如今却都成为了美好而独特的回忆。四年的光景里，在老师、家人及同学的教导与支持下，我收获了很多也成长了很多。此次接近三个多月完成的论文即将接近尾声之际，我要向所有扶持我、指点我的人表达我的感恩和致谢之情。感谢王朝元老师给我的悉心指导和帮助，从论文题目的确定，论文实验的指导到论文写作的修改，都是在您的督促和指导下，我才能顺利地完成此篇毕业论文。在与您的交流中，您治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的精神氛围，使我受益颇丰。感谢指导我帮助我的研究生学长学姐们，感谢宋超学姐悉心指导我成骨细胞培养的操作，感谢易继凌学姐在mtt检测操作方面对我的帮助和指导，还要感谢唐俊龙学长在实验数据处理方面对我的悉心教导和点拨。如果没有他们的指导和帮助，我的毕业论文实验也就不会进行的如此顺利。感谢爸爸妈妈还有爷爷奶奶对我的支持，养育之恩无以回报，他们的安康和快乐是我最大的心愿。有了他们在背后默默地支持，无论遇到什么样的困难，我都能勇敢地面对。最后还要感谢我的同学们，他们会在时刻我的身边陪伴我，陪我笑陪我哭，陪我度过大学生活里的每一个日子。在他们的关怀和照顾下，我的每一天都过得快乐并且健康。在论文写作过程中，他们也给予了我很多的帮助，使我顺利完成了我的论文。键入这毕业论文的最后一段话，我的心里思绪万千