神经病学毕业论文.doc

中山大学硕士学位论文netrin-1及其受体dcc/unc5h2参与高血压大鼠局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑继发性细胞凋亡专 业 名 称：神经病学学 位 申 请 人：龚琼导师姓名及职称：余剑副教授答辩委员会主席：答辩委员会委员：2011年5月原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文使用授权声明本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。学位论文作者签名： 导师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日中山大学硕士学位论文 netrin-1及其受体dcc/unc5h2参与大脑皮层梗死后丘脑继发性细胞凋亡netrin-1及其受体dcc/unc5h2参与高血压大鼠局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑继发性细胞凋亡专 业 名 称：神经病学学 位 申 请 人：龚琼导师姓名及职称：余剑副教授中文摘要目的：检测大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, mcao)后netrin-1及其受体dcc(deleted in colorectal cancer)/unc5h2（uncoodinated-5 homolog b）在梗死灶同侧丘脑的表达情况；用netrin-1进行干预后，观察比较netrin-1组与溶剂对照组之间丘脑继发性细胞凋亡以及神经功能的差异，探讨细胞凋亡是否参与脑梗死后远隔丘脑继发性损害，侧脑室注射netrin-1能否减轻脑梗死后远隔丘脑继发性损害，改善神经功能。背景：脑卒中是危害人类健康和生命的主要疾病，随着人口老龄化,目前已成为全球仅次于缺血性心脏病的第二大死亡原因。近年来随着神经影像技术的飞速发展，脑梗死临床诊断水平有了飞速发展，但由于对脑缺血后神经功能损伤的机制缺乏深入了解,脑梗死的治疗却不容乐观。以往对缺血性卒中的研究多关注梗死病灶局部。近年来的研究表明，大脑中动脉闭塞(mcao)不仅可以导致局部梗死灶的神经细胞死亡，而且非缺血区的远隔部位（例如：丘脑、黑质、脑干及脊髓等）也可以引起继发性损害，这种损害称为远隔损害。脑梗死后远隔部位的继发性损害可能是卒中康复效果不理想、致残率高的重要原因之一。目前,通过研究脑梗死后远隔损害的发病机制,寻找新的临床治疗靶点已成为脑梗死研究领域的热点问题。方法：选取体重7090g雄性大鼠140只按双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高血压大鼠（stroke-prone renovascular hypertensive rats，rhrsp）模型并监测血压。rhrsp术后12周，选取血压稳定高于180mmhg，且无明显脑卒中症状的高血压大鼠112只，按电凝法成功复制右侧mcao模型72只，另随机选取24只作为假手术组，mcao模型鼠随机分为mcao组、溶剂对照组和netrin-1组。mcao术后24小时，netrin-1组大鼠经侧脑室注入浓度为50g/ml的外源性netrin-1蛋白，注入剂量为12l/天，连续7天，溶剂对照组大鼠注入不含netrin-1的等量0.01m磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，pbs，ph=7.4)。mcao术后第8天和第14天，采用提高后躯体摆动实验（elevated body swing tes t, ebst）对运动功能进行评价，神经功能评价结束后分别从每组随机选取6各组大鼠灌注取脑，行冰冻切片，然后选取切片进行尼氏染色评估梗死体积和丘脑神经元数量变化，原位末端转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp-biotin nick end labeling assay, tunel）法检测大鼠梗死侧丘脑凋亡细胞数，用免疫荧光检测各组大鼠不同时间点梗死侧丘脑neun/netrin-1及其受体（dcc/unc5h2）的表达，荧光双标法评估neun/netrin-1、neun/dcc、neun/unc5h2、gfap/netrin-1、gfap/dcc、gfap/unc5h2的共定位关系。此外，mcao术后8天和14天，每组大鼠分别选取6只进行处死取脑，提取丘脑蛋白，western blotting检测caspase-3活性蛋白的表达。结果：rhrsp术后12周大鼠血压明显高于rhrsp术前1周的基础血压。mcao术后第8天,mcao组、溶剂对照组、netrin-1组脑梗死体积占对侧半球的相对百分比分别为14.341.73，14.421.37和11.071.24；mcao术后第14天，mcao组、溶剂对照组、netrin-1组脑梗死体积分别为11.151.29、11.871.24、8.131.05，netrin-1组大鼠脑梗死灶体积各时间点均较同期溶剂对照组缩小。mcao术后第8天、14天，mcao组、溶剂对照组、netrin-1组同侧丘脑腹后外侧核(ventroposterior nucleus of the thalamus, vpn)完好神经元数量较假手术组明显减少，但netrin-1组较溶剂对照组完好神经元数量明显增多。mcao术后第8天、14天，mcao组、溶剂对照组、netrin-1组同侧丘脑tunel阳性细胞数较假手术组明显增多，但netrin-1组较溶剂对照组tunel阳性细胞数减少。mcao术后8天mcao组、溶剂对照组和netrin-1组同侧丘脑neun免疫阳性细胞数较假手术组明显减少，但netrin-1组较溶剂对照组neun免疫阳性细胞数明显增多。mcao术后第8天, mcao组较假手术组大鼠梗死侧丘脑unc5h2表达上调，术后第14天unc5h2表达进一步增加，mcao术后netrin-1及dcc在梗死侧丘脑的表达也略有增加，但与假手术组比较差异无统计学意义。mcao术后第8天、第14天，mcao组较假手术组右侧丘脑caspase-3活性蛋白的表达水平明显升高，给予netrin-1干预后，右侧丘脑caspase-3活性蛋白的表达水平较溶剂对照组明显减少。结论：大脑中动脉区域局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑vpn出现继发性细胞凋亡，unc5h2表达上调。大脑中动脉区域局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑vpn的unc5h2主要表达在神经元上，少量表达在星型胶质细胞上。侧脑室注入netrin-1抑制unc5h2诱导的细胞凋亡途径，能减少局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑的继发性细胞凋亡。关键词：脑梗死；丘脑；凋亡；netrin-1；dcc；unc5h2netrin-1 and its receptor dcc/unc5h2 are involved in the apoptosis and secondary damage in the ipsilateral thalamus after focal cerebral cortical infarction in hypertensive ratsmajor: neurologyname: gong qiongsupervisor: professor yu jian abstractobjective detect the expression of netrin-1 and its receptors in ipsilateral thalamus after cerebral infarction. to intervene by netrin-1 then to examine the differences of the numbers of apoptotic cells and neurological functions between vehicle group and netrin-1 group in order to investigate whether netrin-1 and its receptors take part in the apoptosis and secondary damage in thalamus and affect neurologic functions after mcao.background cerebral infarction is seriously harmful to human health and lives, and has become the second largest cause of death in the world after carcinogenic stroke. with the rapid development of the neuroimaging technique, the level of clinical diagnosis of cerebral infarction has been made a substantial progress. but the treatment remains a difficult problem owe to the lack of understanding of the pathogenesis after cerebral infarction. previous researches are focus on the injury of peri-infarct area after cerebral infarction, in recent years, researches demonstrated the neural functional disturbance following cerebral infarction not only correlates with the injury in focal areas but also the secondary damage remote from infarction. probably this is one of the most important reasons of bad rehabilitation efficacy and high mutilation rate after stroke. the mechanism of the secondary damage remote from infarction is still unclear. nowadays, it becomes a hot topic to investigate the underlying mechanisms of secondary damage and explore new effective strategies to treat cerebral infarction.methods a total of 140 male sprague-dawley (sd) rats (weighting 70 to 90 g) were established as rhrsp with the two-kidney two clip method described previously and arterial blood pressure was monitored. after 12 weeks, 112 rhrsp whose systolic blood pressure were steadily higher than 180 mmhg without stroke symptoms were selected for further study, in which 72 rats were successfully established as mcao by electrocoagulation and another 24 rats were selected as sham-operated control randomly. the rats with successful mcao and randomly divided into three groups: mcao (n=24), vehicle (n=24) and netrin-1 group (n=24). at 24 hours after mcao, the rats in the netrin-1 group were given stereotaxical infusion of netrin-1 12l/day for 7 days, and the vehicle group were given pbs with the some dose. at 8 days and 14 days, elevated body swing test was performed to assess the motor asymmetry. 6 rats selected randomly from each group at 8 days and 14 days were fixed and thereafter cut on a cryostat. nissl staining was performed to assess infarction volume and thalamic neuronal neuron loss. tunel was used to count the numbers of apoptotic cells. immunofluorescence was performed to detect the expression of netrin-1 and its receptors in ipsilateral thalamus. the remaining sections in each group were used for double-labeled immunofluorescence staining with antibodies against neun/netrin-1、neun/dcc、neun/unc5h2、gfap/netrin-1、gfap/dcc、gfap/unc5h2. the rest 6 rats in each group at 8 days and 14 days were killed and used for caspase-3 immunoblotting. results the blood pressure at 12 weeks after rhrsp was significantly higher than that at 1 week before rhrsp. no cerebral infarction was observed in the sham-operated group. the relative infarct volume were 14.341.73，14.421.37和11.071.24 in the mcao, vehicle and netrin-1 group at 8 days after mcao, respectively; 11.151.29、11.871.24、8.131.05 in three groups at 14 days after mcao, respectively. the infarct volume in netrin-1 group is smaller than vehicle group at both time-points. the numbers of intact neurons were decreased significantly within the ipsilateral vpn in mcao, vehicle and netrin-1 group compared with sham-operated group. at 14 days the numbers of intact neurons were further decreased in the three groups. however, the numbers of intact neurons in netrin-1 group was significantly increased compared with vehicle group at both time-points. there was no tunel positive cells detected in thalamus of the sham-operated group. 8 days and 14 days after mcao, the number of tunen positive cells was significantly increased in the mcao, vehicle and netrin-1 group. but the number of tunel positive cells was reduced significant in netirn-1 group compared with vehicle group. the numbers of neun+ cells within the ipsilateral vpn were reduced significantly in mcao, vehicle and netrin-1 groups at 8 days and 14 days after mcao compared with sham-operated group. however, the numbers of neun+ cells within the ipsilateral vpn was significantly greater in netrin-1 group than that in igg/fc group. there were few unc5h2 positive cells in sham-operated group without netrin-1 or dcc positive cells. 8 days after mcao, the expression of unc5h2 was up-regulated greatly in mcao, vehicle and netrin-1 groups. at 14 days after mcao, the expression of unc5h2 was further up-regulated in the three groups. however, the numbers of netrin-1 and dcc positive cells increased slightly. the protein level of caspase-3 was increased significantly at 8 days and 14days after mcao. administration of netrin-1 could reduce the protein level of caspase-3 at both time points.conclusions mcao leads to secondary apoptosis, up-regulation of unc5h2 in the ipsilateral vpn of thalamus in rhrsp. unc5h2 is predominately expressed by the neurons with little produced by the astrocytes. administration of netrin-1 could reduce the apoptotic cells in ipsilateral thalamus.key words: cerebral cortex infarction; thalamus; apoptosis; netrin-1; dcc; unc5h2目 录中文摘要i英文摘要iv目 录viii前 言1一、材料和方法5二、结 果14三、讨 论22四、结 论26创 新 点27参考文献28附录一 综述：netrin-1及其受体在脑缺血中的作用33附录二 英文缩略词对照表41附录三 在读期间发表的论文4243前 言脑卒中是危害人类健康和生命的主要疾病，随着人口老龄化,已成为全球仅次于缺血性心脏病的第二大死亡原因。根据我国流行病学资料显示：脑血管病已经成为我国城市和农村人口的第一位致残和死亡原因，且发病有逐年增多的趋势，给个人、家庭和社会带来沉重的负担1。脑梗死是最常见的脑卒中类型，占所有类型卒中的85%左右。近年来随着神经影像技术的飞速发展，脑梗死临床诊断水平有了飞速发展，但脑梗死的治疗却不容乐观。目前脑梗死治疗措施主要包括溶栓治疗、脑保护药物治疗、介入治疗等。溶栓治疗自1995年开展以来被认为是挽救脑组织的最佳方案，但溶栓治疗受到治疗时间窗的严格限制，绝大多数急性缺血性脑卒中发病3小时内采用溶栓治疗是有效的，大部分患者发病36小时溶栓治疗可能有效，国内将尿激酶溶栓的时间窗界定在发病6小时内，但在实际工作中真正能进行溶栓治疗的患者比例很小，且溶栓可能造成颅内出血等并发症使其在临床上的应用进一步受限2；而脑保护治疗的主要目的是干预半暗带的异常生化和代谢变化，阻断缺血性级联反应，防止或延迟细胞死亡，但目前由于对脑梗死病理生理等发病机制缺乏深入了解,很多脑保护剂对不同的实验模型和不同的临床患者可能有不同的效应，导致脑保护药物的临床应用受限3；介入治疗与静脉溶栓相比，可用于有全身溶栓禁忌的患者，其时间窗也可延长到6小时后，但存在一定的手术死亡率及致残率使很多患者难以接受4。因而，需要进一步研究脑梗死后神经功能损伤和恢复的机制，寻求有效治疗策略。以往对缺血性卒中的研究多关注梗死病灶局部。近年来的研究表明，大脑中动脉闭塞（mcao）后不仅可以导致局部梗死灶的神经细胞死亡，而且非缺血区的远隔部位（例如：丘脑、黑质、脑干及脊髓等）也可以引起继发性损害，这种损害称为远隔损害5。其中，相对于其他神经元之间的纤维联络而言，丘脑与大脑皮层之间的联系更为紧密，故而皮层梗死后丘脑继发性远隔损害更为严重6。目前的治疗仅重视病变局部的干预，而忽视脑梗死后远隔部位的继发性损害,这可能是卒中康复效果不理想、致残率高的重要原因之一。由于远隔损害所表现出的临床症状不典型或被原发病灶所掩盖，故临床中不易发现远隔损害的存在，但迅速发展的影像技术为临床中研究远隔损害提供了方便有效的研究工具。其中以磁共振检查应用最为广泛，对远隔损害的显示清晰、灵敏，能够在早期发现继发性损害。nakane等7连续观察了1周内就诊的21例大脑中动脉供血区皮层梗死的病人发现：不同丘脑辐射受累会导致不同的丘脑核团信号异常,且不同丘脑核团受损后在磁共振t2加权像（t2 weighted imaging, t2wi）上有不同的信号改变，18例梗死灶累及丘脑上辐射的患者中有16例患者同侧丘脑腹侧核部位可观察到低信号改变，这种改变最早可出现在梗死后8天，大部分病人出现在梗死后23周；在梗死后6周或56周，19例梗死灶累及丘脑前辐射患者中有9例患者同侧丘脑背内侧核可出现稍高信号改变,12例梗死灶累及丘脑后辐射患者中有6例丘脑枕核可出现稍高信号改变。弥散张量成像技术（diffusion tensor imaging, dti）是一种描述水分子弥散运动的幅度和方向的mri新技术，近年来也被应用到对远隔损害的研究中来8。herve等6利用dti技术对9例mca梗死患者和10例健康志愿者进行检查发现，患者在第16个月期间梗死灶同侧丘脑的平均扩散度（averaged diffusivity, dav）显示增加，丘脑体积逐渐缩小，提示局灶性皮层梗死后引起了远隔部位继发性神经细胞丢失。动物实验进一步在病理和分子生物学水平上分析了丘脑继发性损害的特点，为卒中后康复寻求新的治疗策略提供参考。1988年，日本帝京大学的fujie等9即在大鼠梗死后2周至6个月的时间内动态观察到了丘脑的渐进性萎缩。采用大鼠大脑中动脉闭塞（mcao）模型观察发现，大鼠mcao术后1天，梗死灶同侧丘脑、纹状体发现神经元坏死，mcao术后2天同侧大脑后动脉供血的丘脑神经纤维周围出现小空泡、变性的突触前末梢和轴索，mcao术后4天丘脑的神经元可见细胞肿胀、染色质溶解，随着时间的延长梗死灶同侧丘脑的神经元数量逐渐减少，星形胶质细胞逐渐增生，数月后同侧丘脑出现渐进性萎缩。由于丘脑不属于大脑中动脉供血区，并且mcao术后患侧丘脑损害发生较晚，提示丘脑部位的损害并非由缺血直接导致。脑梗死后远隔部位发生继发性损害的机制比较复杂，目前尚未完全阐明，已有研究证实轴突退行性改变10, 11、神经营养因子障碍12、神经生长抑制因子的存在13、细胞凋亡14-17、淀粉样蛋白（-amyloid，a）沉积18, 19等机制可能参与其中。细胞凋亡是指细胞自主的有序的死亡程序，主要通过膜受体途径或线粒体途径激活，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等,在神经系统发育过程中起着重要作用。在神经系统成熟以前多达70%的细胞在发育过程中发生凋亡，从而调节神经元和胶质细胞数目13。越来越多的研究表明，细胞凋亡也是大脑皮层梗死后脑缺血半暗带、远隔部位（丘脑、黑质、脑干等）神经元迟发性死亡的主要形式，上述部位继发的细胞凋亡可能是急性缺血期过后神经细胞丧失及神经功能损害的重要原因之一14-17。dna断裂片段被认为是检测细胞凋亡的重要指标,tunel技术用dna聚合酶和末端脱氧核糖核酸(tdt)标记dna链断端的核酸,在检测细胞凋亡时具有灵敏度高的特点。hideaki15选取自发性易卒中型高血压大鼠复制大脑皮层梗死模型发现，mcao术后第5天梗死侧丘脑的神经元上出现tunel免疫阳性信号，术后第7天tunel阳性信号不仅出现在神经元上也出现在胶质细胞上,证实细胞凋亡参与了丘脑的继发性损害。胱冬氨酸酶（caspases）参与溶蛋白性dna裂解，在细胞凋亡过程中具有重要作用，是凋亡通路中比较保守的部分，被认为是与细胞凋亡最密切相关的蛋白酶。为了排除tunel法的阳性率, ling16采用免疫荧光检测大脑皮层梗死后丘脑部位caspase-3的表达情况发现,梗死后24小时同侧丘脑tunel免疫阳性信号神经元中出现caspase-3裂解物免疫反应增强,进一步证实梗死后同侧丘脑神经元会继发细胞凋亡，且随着时间的延长凋亡细胞增加,于7-10天达到高峰。而且本课题组之前的研究发现，局灶性大脑皮层梗死后第1周梗死灶同侧丘脑腹后核tunel阳性细胞数目高于假手术对照组，术后第2周表达到达高峰，同样证实细胞凋亡参与了实验性大脑皮层梗死后继发性丘脑神经元变性的过程20, 21。然而，丘脑发生凋亡的机制尚不清楚，故本研究小组将在此基础上进一步探讨其诱发机制。netrin-1家族是最早发现的可溶性轴突导向因子22。在神经系统的发育过程中，netrin-1根据轴突生长锥上表达的受体不同而发生化学吸引或排斥作用，当生长锥上表达受体dcc时netrin-1则诱导轴突生长，当生长锥上表达受体unc5h2时netrin-1则排斥轴突生长。这是netrin-1在神经系统生长发育中最重要的功能，之后的研究发现netrin-1在胚胎期神经系统表达不仅可以诱导轴突生长，也可以导向细胞移行，促进血管新生，维持细胞存活23-26。以往的研究大多集中在netrins在神经系统发育过程中的轴突导向作用，近年，netrins及其受体dcc/unc5h2在细胞凋亡中的作用越来越受到关注，这可能是netrin-1及其受体在成年神经系统继续表达，参与神经损伤和修复的重要机制。netrin-1两大受体家族dcc和unc5h都是膜结合受体，均由细胞外区、跨膜区和细胞内区3个结构域组成。dcc因在大部分结直肠癌中表达缺失而被命名为结直肠缺失蛋白，被认为是一种可诱导凋亡的肿瘤抑制因子27；而unc5h2则直接受到凋亡活化基因p53的调控，参与p53诱导的凋亡通路28。研究发现，dcc/unc5h2均是配体依赖性凋亡因子，当细胞外缺乏netrin-1时，dcc和unc5h2均能诱导细胞凋亡，当netrin-1与之结合后可直接抑制dcc/unc5h2诱导的细胞凋亡。虽然这一现象首先在肿瘤学研究中被发现，但已有研究证实netrin-1及其受体调节细胞凋亡的作用同样参与了胚胎期神经系统发育和成年神经系统损伤修复的过程。llambi等29研究证明，敲除netrin-1不仅会导致小鼠神经发育过程中轴突定位和神经细胞迁移异常,还会引起表达dcc或unc5h的神经元发生凋亡，大量减少存活神经细胞数量，脑干部位尤为严重。furne30对胚胎期联合神经元进行体外培养发现，netrin-1以一种与神经生长因子不同的方式保护神经细胞，神经生长因子主要通过激活下游存活信号发挥保护效应，而netrin-1是通过抑制dcc诱导的细胞凋亡维持细胞存活。severin marcos等31观察netrin-1敲除后小鼠下橄榄核神经元（inferior olivary nucleus, ion）存活情况发现，netrin-1敲除小鼠较野生型小鼠下橄榄核神经元的数目减少40%。netrin-1的抗凋亡作用不仅在胚胎期保护迁移细胞，也能在脑梗死后减轻缺血造成的损伤。wu32等采用大脑中动脉梗死模型，探测了netrin-1及其受体在梗死后第1，2，3，7，14天的表达情况发现，mcao术后unc5h2和凋亡基因p53在梗死侧皮质中的表达上调，侧脑室持续注入netrin-1抑制unc5h2凋亡通路后能显著减少p53的表达,抑制凋亡保护缺血细胞，他们的结果证实netrin-1与unc5h2结合能够抑制梗死所诱发的p53途径的细胞凋亡，从而起到一定的神经元保护作用。综上所述可以发现：细胞凋亡参与了mcao后同侧丘脑继发性损害现象，dcc/unch2又是已知的配体依赖性凋亡受体，但mcao后同侧丘脑继发细胞凋亡是否与dcc/unc5h2之间存在直接的联系目前尚不清楚。因此，本课题的研究目的就是检测mcao后netrin-1及其受体在同侧丘脑的表达情况，探讨netrin-1是否能减少丘脑的继发细胞凋亡，减轻丘脑的继发性损害并改善神经功能，为寻找新的临床治疗靶点提供实验依据。一、材料和方法1. 实验设计方案雄性sd大鼠高血压模型（rhrsp）脑梗死模型（mcao）mcao组(n=24)igg/fc组(n=24)netrin-1组(n=24)假手术组(n=24)8天14天尼氏染色western-blot免疫荧光tunel检测凋亡统计分析图1 实验设计图选取雄性sd大鼠140只，按双肾双夹法制作rhrsp模型并每周监测血压。术后12周，选取血压稳定180mmhg，无明显脑卒中症状的高血压大鼠112只，随机分配接受右侧mcao手术(n=88)或假手术(n=24)。成功制作的mcao模型随后随机分为mcao组、溶剂对照组和netrin-1组，每组24只。mcao术后 24小时，netrin-1组大鼠侧脑室注射netrin-1，溶剂对照组则予侧脑室注射等剂量的0.01m pbs（ph=7.4）。mcao术后8天和14天，每组大鼠分别选取6只行冰冻切片，行尼氏染色和免疫荧光检查，分别评估梗死灶体积、丘脑neun+神经元损害、netrin-1、dcc和un5h2的变化。另外，在mcao术后8天和14天每组大鼠分别选取6只大鼠提取丘脑蛋白，采用western blotting检测caspase-3活性蛋白的表达。最后进行统计学分析。 2. 实验材料2.1 实验动物选用中山大学实验动物中心提供的健康封闭群雄性sd大鼠140只合格证号：no.0041161、0041576；scxk（粤）20040011粤监证字2008a010，鼠龄6080天，体重7090g。所有大鼠均饲养于中山大学实验动物中心spf级环境（环境合格证：粤监证字 2009c012号），采用颗粒型消毒过的大鼠饲料（含蛋白23，脂肪4.7，钠盐0.24）喂养，饮用消毒水，食物和水均自由进食。环境温度控制在2025左右，光照周期12小时，为正常昼夜节律。所有大鼠模型制备均在中山大学实验动物中心spf级动物实验室完成，术中严格按无菌原则进行操作，并尽量减少动物承受的痛苦。2.2 实验仪器和耗材ml866 powerlab 4/30型大鼠血压计adinstruments pty ltd，澳大利亚asx双目显微手术镜上海安信光学仪器制造有限公司双极眼科电凝镊/gd350-s型电凝器上海沪通电子有限公司strong 90/90n 型牙科电钻saeshn，韩国mdf-u5410低温冰箱sanyo，日本centrifuge 5417r型低温离心机eppendorf，德国centrifuge 5810r型低温离心机eppendorf，德国ab54型电子天平mettler toleda，瑞士fa1104a电子天平上海精天电子仪器有限公司swb 5050 型水浴箱labnet，英国yxq-ls-503i高压灭菌器上海博迅实业公司医疗设备厂cm1900型冰冻切片机leica，德国kj17ch型微波炉midea，中国bx51系统生物显微镜olympus，日本az100型体视光学显微镜nikcon，日本2.3 实验试剂水合氯醛天津市大茂化学试剂厂磷酸氢二钠广州化学试剂厂，中国磷酸二氢钠广州化学试剂厂，中国氯化钠广州化学试剂厂，中国2，3，5氯化三苯基四氮唑sigma-aldrich，美国多聚甲醛国药集团化学试剂有限公司 蔗糖广州化学试剂厂，中国枸橼酸钠武汉博士得，中国30过氧化氢广州化学试剂厂，中国无水乙醇广州化学试剂厂，中国二甲苯广州化学试剂厂，中国正常山羊血清武汉博士得，中国小鼠抗大鼠neun单克隆抗体millipore，bedford，美国小鼠抗大鼠gfap单克隆抗体bd biosciences，california，美国低染色背景抗体稀释液dako，glostrup，丹麦 冰冻切片包埋剂octsakura finetek，torrance，美国3. 实验方法3.1 易卒中肾血管性高血压大鼠模型制备及血压监测选取鼠龄6080天，体重7090g的雄性sd大鼠140只，按本课题组已报告的双肾双夹法33制备rhrsp模型。术前12小时禁食，以10水合氯醛（3 ml/kg，腹腔注射）麻醉后，将大鼠仰卧位固定于手术板上，常规腹部备皮、消毒，铺巾，取中上腹部正中纵形皮肤切口长约2.0cm，打开腹腔，依次钝性分离暴露出双侧肾动脉，用内径为0.3mm的环形银夹分别钳夹肾动脉起始部，并确定肾动脉置于银夹的环形结构内。术中注意防止损伤肾动脉、肾静脉、腹主动脉、肾脏、肝脏、肠管及其他内脏器官。腹腔内注射庆大霉素稀释液3ml以预防感染后逐层关腹。术后待大鼠麻醉清醒后即恢复正常饮食，分45只每笼进行饲养，密切观察大鼠腹部切口、肢体活动、呼吸、饮食及尿液颜色等情况。使用ml866 powerlab 4/30型大鼠血压计进行血压监测。测量前将大鼠置于37温箱中预热15分钟后放入测压笼内，待大鼠安静后测量清醒状态下大鼠尾动脉的收缩压，每次测量3遍，取其平均值作为该次大鼠的血压值。术前1周血压作为基础血压，术后每周监测血压1次。3.2 局灶性大脑皮层梗死模型制备及实验动物分组rhrsp术后约12周，选取血压稳定高于180mmhg，且无明显脑卒中征象的rhrsp 112只，用随机数字表随机抽取24只作为假手术组（sham组），其余88只按已报告的方法34制备局灶性大脑皮层梗死模型（mcao）。以10水合氯醛（3ml/kg，腹腔注射）麻醉后，将大鼠右侧卧位固定于手术板上，常规左侧头部备皮、消毒、铺巾。取左眼外眦与外耳道连线中点并与其垂直的皮肤切口长约1厘米，以平行于肌肉方向切开并钝性分离颞肌，暴露颅骨。在显微手术镜下于颧弓和颞骨鳞部结合处前下方用牙科钻磨开一直径约为0.5厘米的骨窗，暴露出左侧mca，小心挑开硬脑膜后在mca跨越嗅束、发出纹状动脉的远端用双极眼科电凝镊凝闭mca皮层支，术中可见电凝点远端mca明显变细、血流中断，复制成mcao模型。假手术组大鼠除不电凝mca外其余手术过程完全相同。局部伤口用生理盐水棉球清洗后逐层关闭切口。术后立即腹腔注射庆大霉素稀释液3ml预防感染。术中及术后使用加热垫使大鼠体温保持在37 0.5 直至大鼠清醒为止。术后24小时进行神经功能评分，存在以下症状初步认为模型成功：痛觉刺激下左侧肢体会所迟钝或消失；体位倒悬时左上肢屈曲；爬行时向左侧偏移。成功制作的mcao大鼠按照随机数字表的方法，随机分为三组：mcao组（n=24），溶剂对照组（n=24），netrin-1组（n=24）。3.3 侧脑室打药netrin-1的配制和使用剂量参照文献32报告的方法，将25g的netrin-1溶解于0.5ml的0.01m磷酸盐缓冲液（pbs, ph=7.4）备用。mcao术后24小时，netrin-1组和溶剂对照组的大鼠将分别进行侧脑室注射给药。具体方法如下：10%水合氯醛（0.3ml/kg）腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧位固定于大鼠立体定向仪上，常规头部备皮、消毒、铺巾，取头顶中线作一长约2.5cm的纵行切口，钝性分离肌肉，暴露颅骨，是前囟、矢状缝、冠状缝等骨性标志清晰可见，参照文献确定前脑左侧脑室坐标（前囟后1.4mm，矢状缝左旁开2.0mm，深度3.5mm）13, 32，作好标记后，用牙科钻打孔，至颅骨即将穿透是改用手动钻孔比卖弄损伤脑组织，完全穿透后，放置alzet 1007d注射微泵（alza scientific products），持续给药7天，注入剂量为12l/天（0.5l/小时）。用牙科水泥固定微泵插管，缝合皮肤。溶剂组不注入netrin-1药液，只注入等量等的0.01m pbs(ph=7.4)。假手术组和mcao组不给予任何侧脑室注射。3.4 神经功能评分采用提高后躯体波动实验(ebst)35, 36对运动功能进行评分。ebst向哪一侧旋转次数所占比例越高，说明该侧运动功能越差。mcao术后8天和14天进行ebst，具体神经功能评价方法如下：在安静的实验环境中将大鼠置于40 40 35.5厘米大小的塑料盒内进行测试，每次进行测试时测试者均站在距离大鼠相同的位置，先使之适应测试环境5分钟，然后在距离鼠尾根部2厘米处抓住鼠尾轻轻提起，使大鼠鼻尖离地面约10厘米高，观察大鼠头部向左、右偏转的方向，以大鼠头部偏离躯体中线超过10为标准，然后将大鼠轻轻放回盒内，让其自由活动30秒，再进行下一次观察，当大鼠被提起后10秒内不出现偏转时，也将大鼠放回盒内，重新进行测试，每只大鼠重复测试20次，分别记录向左、右偏转的次数，并计算出向瘫痪侧（左侧）偏转所占的百分数。3.5 脑组织冰冻切片四组动物分别在mcao术后第8天和14天进行灌注取材：大鼠经10%水合氯醛深度麻醉成功后（4 ml/kg，腹腔注射），开胸，经左心室主动脉插管，剪开右心耳，先快速灌注预冷生理盐水，待右心房流出液颜色清亮后再以300毫升4多聚甲醛溶液(ph 7.4，4 )灌注固定脑组织，断头后开颅取脑，将脑组织块置于4多聚甲醛溶液内4 后固定612小时，再分别置于20和30蔗糖溶液中脱水，待组织沉底后oct包埋行冠状面冰冻切片，片厚8m，晾干后置40冰箱保存备用。3.6 尼氏染色选取每只大鼠从前囟+4.7到-5.2mm的冰冻切片，每隔12片取1片，进行尼氏染色，用于计算梗死灶的体积。其中，前行-2.4到-4.4mm（大鼠图谱中丘脑位置）的冰冻切片同时用于计算同侧丘脑完整神经元的数量。具体步骤如下：3.6.1 冰冻切片恢复至室温后，0.01 m pbs（ph 7.4）漂洗2次，每次5 min；3.6.2 将切片依次置于100酒精 10 min，80酒精 2 min，50酒精 1 min，蒸馏水 2 min；3.6.3 0.1焦油紫液染色2 min后蒸馏水漂洗1 min；3.6.4 50酒精 1 min；3.6.5 70冰醋酸酒精溶液 1 min；3.6.6 梯度酒精脱水：70，80，90，100 i，100 ii酒精各5 min；3.6.7 二甲苯透明：二甲苯i，二甲苯ii 各5 min；3.6.8 中性树胶封片，阴凉通风处自然晾干；3.6.9 显微镜观察、拍照。3.7 原位末端标记（tunel）法3.7.1 0.02m tbs室温孵育冰冻切片15min，擦干切