黄体生成素受体研究进展及其基因序列的同源性分析.doc

黄体生成素受体研究进展及其基因序列的同源性分析张善文，陈 斌（湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128）摘 要：黄体生成素发挥生理作用是通过黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor,lhr）介导的。研究动物黄体生成素受体及其基因对于阐明动物的生殖生理机制具有重要意义。本文论述了动物lhr的分布、结构、表达及其调控、作用机理等方面的研究进展，并对目前genbank已公布的人、鼠、主要畜禽黄体生成素受体基因的编码区序列进行了同源性比较分析。关键词：黄体生成素；黄体生成素受体；基因；同源性分析research advance and gene sequence homology analysis of luteinizing hormone receptorshanwen zhang,chen bin(college of animal science and technology, hunan agricultural university,hunan changsha 410128)abstract:the actions of luteinizing hormone were thought to be mediated through binding to its receptor (luteinizing hormone receptor,lhr).lhr gene of animal was of importance to understand the reproduction physiology of animal.this paper summarized the research progress in lhr including its histological distribution,structure,expression,regulation and functional mechanism in animal.it also analyzed the sequence homology of the lhr gene coding sequence for human,mouse,chicken and other animal published in the genbank.keywords:luteinizing hormone;luteinizing hormone receptor;gene;homology analysis黄体生成素（luteinizing hormone,lh）又称作促黄体素，是由腺垂体嗜碱性细胞合成并分泌的一种大分子糖蛋白，由和两个亚基非共轭结合形成，其中亚基具有决定其分子特异性的构型特征，可以识别适当的靶组织，并与特定的受体结合，进而发挥其生理功能1，lh可和卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,fsh）协同作用促进卵泡成熟、触发排卵、促进黄体形成并分泌雌激素和孕激素，在动物生殖过程中发挥重要作用。黄体生成素发挥生理作用是通过黄体生成素受体（luteinizing hormone receptor,lhr）介导的。自mcfarland等2和loosfelt等3先后克隆了大鼠和猪lhr基因的cdna以来，研究人员对lhr进行了较全面而深入的研究。目前，在lhr的结构、作用机理及其与一些疾病的关系等方面均取得了一定的进展。1 lhr的结构和分布大鼠lhr基因编码一个分子量约为75 kda的糖蛋白，含674个氨基酸残基。lhr由两个功能单位组成：对lh有高亲和力的激素结合域和由7个跨膜胞浆模件构成的锚定单元，后者具有g蛋白偶联和信号传导功能。肽链形成的7个跨膜(transmembrane,tm)螺旋被相应的3个细胞内环(intracellular loops,ils)和3个细胞外环(extracellular loops,els)连接。lhr氨基端(n端) 部分有14个由20多个氨基酸残基组成的“富含leu重复”片段。lhr的胞外域含341个氨基酸残基，并有6个潜在的糖基化位点2。第1、2 els含有cys残基，可形成分子内二硫键，起稳定跨膜螺旋结构的作用。lhr的跨膜区是7次跨过细胞膜的波浪式结构，具有g蛋白的特性，并与g蛋白家族中的其它受体具有高度同源性2。lhr细胞内羧基端(c端)部分由69个氨基酸残基组成，包含12个蛋白激酶c（protein kinase c,pkc）磷酸化位点，1个潜在的酪氨酸激酶(tyrosine kinase)磷酸化位点以及数个由蛋白激酶a（protein kinase a,pka）催化的ser/thr磷酸化位点。对lhr蛋白质结构网络分析的研究表明，不管在激活或者未激活的情况下，视紫质家族g蛋白偶联受体中高度保守的氨基酸都具有维持其稳定性的功能，而这些氨基酸的功能失活突变则可能会损害激活突变位点和激素结合区的功能4。lhr主要分布于性腺组织，如睾丸间质细胞、卵巢颗粒细胞和黄体细胞。同时，lhr在肾上腺、前列腺、大脑皮质、正常乳腺表皮细胞甚至肾脏等一些非性腺组织中也有表达5,6。lhr在非性腺组织中广泛分布说明lhr在生殖和医学上具有很多重要功能7。近几还年发现，lhr存在于一些恶性肿瘤细胞表面，如胃癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌等811。2 lhr的作用机理lhr的信号传导过程包括4个步骤:(1)配体与受体特异性结合；(2)信号传导；(3)受体脱敏；(4)受体活化后事件。其中任何一个环节出现障碍都会影响到lh生理作用的发挥。lhr在输卵管、子宫组织主要通过激活环化腺核苷一磷酸(camp)和磷脂酶c(plc)这两条信号传导途径发挥生理活性12,13，这与lhr在卵巢和睾丸活化的信号途径完全一样14。lh 与lhr结合后激活了细胞膜上的g蛋白，g蛋白进一步激活腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,ac)和磷脂酶c(phospholipase c,plc):(1)ac导致细胞内camp水平升高，camp激活蛋白激酶a(protein kinase a,pka)，pka使前列腺素合成酶(prostaglandin h synthase,pghs)的活性升高，最终导致了前列腺素(prostaglandin,pg)合成增加。另外，camp也能使细胞内源性钙离子释放到胞质中，钙离子与钙调素(calmodulin)结合后进一步激活 pghs导致pg合成增加，胞质钙离子水平升高也可以pkc后进一步激活pghs 导致pg合成增加；(2)plc催化二磷酸甘油酯生成三磷酸肌醇(inositol triphosphate,ip3)和二脂酰甘油(diacylglycerol,dag)，ip3和dag 都能激活pkc后进一步激活pghs导致pg合成增加。3 lhr的表达及其调控不同物种之间lhr的加工过程具有很大的差异性，人表达的lhr主要是以90 kda的成熟形式存在，而大鼠表达的lhr则主要以70 kda的前体形式存在。最近有研究表明，lhr的胞外域是lhr最终加工成熟并在细胞表面表达的决定性因素15。人lhr mrna有四种形式的变体，其中全长的形式称作lhra，最短的形式称作lhrd，lhrd编码一个缺少跨膜域和羧基末端区的蛋白。在卵巢周期的不同阶段，lhra和lhrd的表达具有极显著的差异。在黄体期，lhra的表达量降低，而lhrd的表达量则升高。cos-7细胞中表达的lhrd不能对lh的刺激产生应答反应，同时表达lhra和lhrd的cos-7细胞中，lhra也不能对lh的刺激产生应答反应，这说明截短的lhrd对lhra的信号传递具有抑制作用16。甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,mvk)具有结合lhr mrna并降低其稳定性的作用，而雌激素(estrogens，e)和fsh能降低大鼠颗粒细胞中mvk结合lhr mrna的水平，从而增加lhr mrna的稳定性，最终增加lhr mrna的表达量17,18。lhr在卵巢中的表达受到甲羟戊酸介导的转录后调控，这使得lhr的表达与胆固醇代谢联系起来19。最近有研究表明，lhr mrna的减量调节是由lrbp(lh receptor mrna binding protein,lrbp)介导并通过lh调节的erk1/2信号通路实现的20。 4 lhr基因突变与疾病促性腺激素基因的突变非常少，而它们各自受体基因的突变频率相对就高很多。受体基因突变可分成激活突变和失活突变，lhr基因激活突变主要导致男性性早熟(familial male-limited precocious puberty,fmpp)，而对女性无影响，失活突变则主要导致男性假两性畸形(male pseudohermaphrodism)与间质细胞发育不良综合征(leydig cell hypoplasia,lch)，对女性也产生很大影响21。大部分的lhr基因突变位于编码区，这会引起lh与lhr结合及其信号传导的障碍。已发现的与fmpp表型和lch表型相关的lhr基因突变列于表1和表2。据报道，一位lhr ala593pro纯合突变女患者，其体内fsh、lh水平偏高，雌激素和孕激素水平较低，有低雌激素分泌的征象，如骨密质降低和小子宫，并且表现为原发性闭经。经组织学检查发现，该患者存在各个阶段的卵泡，但不能排卵，因而表现为原发性闭经。从该患者的情况可以看出，单独的fsh可以维持卵泡的生长与发育，但lh对于排卵则是必需的33。人lhr mrna剪接突变(c.537-3ca)会使其mrna剪接时跳过外显子7，最终导致男性假两性畸形34。女性携带lhr基因d556h激活突变时不表现为性早熟，卵巢功能也表现正常。而在同一基因突变(d556h)的小鼠模型中，雌鼠表现为性早熟和卵巢退化的现象比雄鼠严重，这和人的表型相反35。 lhr在原发性醛固酮增多症患者体内表达异常，其表达量比正常值高95倍，这可能说明lhr具有调节醛固酮分泌的作用36。lhr在前列腺癌细胞的类固醇生成过程中也具有调节作用，lh介导激活的lhr能极大地上调合成类固醇所需的基因和酶的表达，并增加前列腺癌细胞中类固醇的产量37。表 1 男性性早熟相关的lhr基因突变table.1 activating mutations of the lhr in fmpplhr基因变化lhr蛋白质变化突变位置遗传特性参考文献c 1103 tleu 368 protm家族性遗传（1例）25c 1118 tala 373 valtm家族性遗传（4例），偶发病例（1例）22t 1193 cmet 398 thrtm 家族性遗传（6例），偶发病例（5例）26,27t 1370 gleu 457 argtm 偶发病例（1例）22a 1624 cile 542 leutm 家族性遗传（9例），偶发病例（1例）22a 1691 gasp 564 gly3rd cytoplasmic loop家族性遗传（3例），偶发病例（2例）23a 1691 tasp 564 val3rd cytoplasmic loop偶发病例（1例）22c 1703 tala 568 val3rd cytoplasmic loop家族性遗传（2例）偶发病例（2例）22,25g 1713 amet 571 iletm 家族性遗传（2例）22c 1715 tala 572 valtm 家族性遗传（1例），偶发病例（2例）22a 1723 cile 575 leutm 家族性遗传（3例），偶发病例（1例）22c 1730 tthr 577 iletm 家族性遗传（4例）22g 1732 tasp 578 tyrtm 偶发病例（4例）22a 1733 gasp 578 glytm 家族性遗传（50例），偶发病例（10例）22t 1734 aasp 578 glutm 家族性遗传（1例）22t 1741 ccys 581 argtm 家族性遗传（1例）22g 1850 acys 617 tyrtm 偶发病例（1例）24表 2 间质细胞发育不全相关的lhr基因突变table.2 inactivating mutations of the lhr in lhclhr基因变化lhr蛋白质变化位置遗传特性参考文献54位碱基后插入33bp插入11个氨基酸胞外域杂合突变（1例）22606680碱基缺失外显子8缺失胞外域杂合突变（1例）22a 340 tile 114 phe3rdleucine-rich repeat杂合突变（1例）23t 391 ccys 131 arg胞外域纯合突变（1例）22g 430 tval 144 phe胞外域纯合突变（1例）31t 579 gphe 194 val胞外域纯合突变（1例）29t 1027 acys 343 ser胞外域杂合突变（1例）22g 1060 aglu 354 lys胞外域纯合突变（1例）22基因组中缺失5kb外显子10缺失胞外域纯合突变（1例）28t 1505 cleu 502 protm 纯合突变（1例）30t 1627 ccys 543 argtm 杂合突变（1例）22c 1635 acys 545 stoptm 杂合突变（1例）22c 1660 targ 554 stop3rd cytoplasmic loop杂合突变（1例）22g 1777 cala 593 protm 纯合突变（2例），纯合突变（1例）2218221827碱基缺失608leu，609val缺失tm 纯合突变（1例）22t 1827 gtyr 612 stoptm 纯合突变（1例）32c 1847 aser 616 tyrtm 纯合突变（1例），杂合突变（1例）22t 1874 aile 625 lystm 纯合突变（1例）225 lhr基因的研究进展及编码区序列的同源性分析目前genbank已公布的人、鼠与主要畜禽lhr基因编码区序列同源性比较结果见表3和图1。在lhr基因的研究方面，人lhr基因研究得最深入，2005年4月15日公布了人lhr基因的dna全序列（genbank,ac087816）。人lhr基因位于2号染色体，定位在2p21，基因全长68968bp，mrna全长3093bp（genbank，nm000233.3），由11个外显子和10个内含子组成，编码区序列长2100bp（genbank，m63108.1）。对畜禽lhr基因的研究也取得了很大进展，猪、牛和鸡lhr基因的cdna均已克隆出来，同时也已获得它们的lhr基因全序列，它们的lhr基因分别位于3号、11号和3号染色体上（genbank，）。表3 lhr基因编码区序列同源性比较结果表tab.3 the homology analysis results of lhr coding sequences(%)物种人鼠牛猪猴狗貂鸡人83.989.089.595.089.889.771.4鼠83.984.284.583.485.284.470.9牛89.084.293.489.191.491.572.7猪89.584.593.489.292.192.071.9猴95.083.489.189.289.489.171.0狗89.885.291.492.189.495.172.1貂89.784.491.592.0鸡71.470.972.771.971.072.171.3图 1 lhr基因进化树fig 1 phylogeny of lhr gene从lhr基因编码区的同源性比较结果可以看出哺乳动物之间的同源性比较高，特别是人与猴及狗与貂之间的同源性，竟高达95%，牛、猪、狗和貂之间的同源性也均高于90%。这对进一步研究畜禽的lhr基因有重要意义。参考文献1 themmen apn.an update of the pathophysiology of human gonadotrophin subunit and receptor gene mutations and polymorphismsj. reproduction,2005,130:263274.2 mcfarland kc,sprengel r,phillips hs,et 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