食品科学与工程毕业设计（论文）-绿茶中蛋白质及黄酮的抗氧化性初步研究.doc

毕 业 论 文题 目: 绿茶中蛋白质及黄酮的抗氧化性初步研究 学院(直属系): 生物工程学院 年级、专业: 2008级食品科学与工程 学 生 姓 名: 学 号: 指 导 教 师: 完 成 时 间: 2012年5月17日 目 录摘 要2abstract31 前言41.1茶叶的主要功效41.2茶叶内所含成分及其保健功效61.3绿茶中抗氧化性蛋白质以及黄酮在食品中的应用71.4绿茶中抗氧化性蛋白质以及黄酮在药品中的应用81.5邻苯三酚自氧化法81.6绿茶中抗氧化蛋白与黄酮的研究展望82材料和方法92.1 材料和仪器92.2 实验方法93 结果与讨论123.1蛋白质的提取与分离123.2 抗氧化性结果分析134 结论与讨论364.1 结论364.2 讨论36总结与体会38致谢词39参考文献402材料和方法2.1 材料和仪器2.1.1 原材料绿茶：蒙山炒青（品名），四川省茗山茶业有限公司，市售。2.1.2 试剂硫酸铵：分析纯，成都市科龙化工试剂厂95%乙醇：分析纯，成都市科龙化工试剂厂磷酸盐缓冲液（干粉包）：分析纯，成都市科龙化工试剂厂碳酸氢钠：分析纯，成都市科龙化工试剂厂乙二胺四乙酸二钠（edta）：分析纯，成都市科龙化工试剂厂焦性没食子酸（邻苯三酚）：分析纯，成都市科龙化工试剂厂三羟甲基氨基甲烷（tris碱）：分析纯，成都市科龙化工试剂厂盐酸：分析纯，成都市科龙化工试剂厂抗坏血酸：分析纯，成都市科龙化工试剂厂2.1.3 仪器电热恒温鼓风干燥箱 dhg-9075a型 上海一恒科技有限公司电子天平 twx型 北京赛罗利斯天平有限公司万用电炉 dl-1型 北京中兴伟业仪器有限公司高速冷冻离心机 centrifuge 5810r型 德国eppendorf公司恒温水浴锅 hh-2型 常州国华电器有限公司磁力搅拌器 85-2c型 郑州市亚荣仪器有限公司酸度计 phs-3c 成都世纪方舟科技有限公司紫外可见分光光度计 uv-2100型 北京瑞利分析仪器公司2.2 实验方法2.2.1 蛋白质以及黄酮的提取和纯化2.2.1.1 蛋白质提取分离工艺流程绿茶浸提过滤离心上清液盐析离心上清液盐析离心沉淀透析 沉淀透析待测样品1 待测样品22.2.1.2 浸提液的制备准确称取50.00g绿茶，按绿茶(g)：磷酸盐缓冲液(ml)=1：10比例加入500ml磷酸盐缓冲液，充分搅拌后于4冰箱中静置过夜。取出后先将混合液用纱布过滤，然后把过滤夜置于离心管，等质量对称放置在冷冻离心机，以4，8000r/min速度离心20min，取得上清液350ml。2.2.1.3 盐析及透析脱盐查阅硫酸铵饱和浓度常用表，可知每100ml溶液配成40%饱和度溶液需加固体硫酸铵22.6g。因此准确称取79.1g硫酸铵粉末，将制得的上清液置于500ml烧杯，将烧杯放在磁力搅拌器上，一边搅拌，一边在冰水浴中缓慢加入已经称好的硫酸铵粉末，控制好加入的速度，从而制成40%饱和度的硫酸铵溶液。等硫酸铵充分溶解后，将溶液置于4冰箱静置过夜。将上述溶液取出倒入离心管，注意等质量对称的放置在冷冻离心机中，以4，8000r/min速度离心20min，取得上清液330ml，下层沉淀为在40%(nh4)2so4离子浓度下析出的蛋白质。通过查阅硫酸铵饱和浓度常用表，每100ml溶液从40%饱和度配置成80%饱和度溶液需加固体硫酸铵25.8g。准确称取77.4g硫酸铵粉末。将上清液置于500ml烧杯，在磁力搅拌器上，一边搅拌，一边在冰水浴中缓慢加入已经称好的硫酸铵粉末注意加入的速度从而制成80%饱和度的硫酸铵溶液。待硫酸铵充分溶解后，将溶液置于4冰箱静置过夜。然后将在40%(nh4)2so4离子浓度下析出的蛋白质溶解于ph=6.8磷酸盐缓冲液中，而后置于截留分子质量为3000d的透析袋中，并用透析夹夹好，对其检查无漏液后，将透析袋中的蛋白质在4ph=6.8磷酸盐缓冲液中透析6h，然后再将透析袋更换入新的透析液中透析12h。待透析结束后将透析袋中液体置于试管中，放入4冰箱中保存备用。将配得的80%饱和度硫酸铵的样品液倒入离心管，注意等质量对称的放置在冷冻离心机，以4，8000r/min速度离心20min，获得的下层沉淀即为在80%(nh4)2so4离子浓度下盐析出的蛋白质。所得的沉淀同样用ph=6.8磷酸盐缓冲液溶解并置于截留分子质量为3000d的透析袋中，在4条件下透析6h，然后再将透析袋转入新的透析液中透析12h。待透析结束后同样将透析袋中液体置于试管中，放入4冰箱中保存备用。透析袋预处理过程：将透析袋用60%乙醇浸泡0.5h，再用蒸馏水洗净。再用10mmol/lnahco3和1mmol/l的edta溶液煮沸10min，然后用蒸馏水洗净，并检查是否漏水，确定不漏水后即可装入样品液透析。2.2.2.1 黄酮的提取工艺流程绿茶浸提过滤离心萃取分液真空干燥待测样品2.2.2.2 浸提液的制备 准确称取50.00g绿茶，按绿茶(g)：蒸馏水(ml)=1：10比例加入500ml蒸馏水，充分搅拌后于4冰箱中静置过夜。取出后先将混合液用纱布过滤，然后把过滤夜置于离心管，等质量对称放置在冷冻离心机，以4，8000r/min速度离心20min，取得上清液340ml。2.2.2.3 溶剂萃取 取得的上清液与正丁醇按1：1的比例混合后放入分液漏斗中萃取，萃取中注意混合均匀，然后静置待出现明显分层后弃去水相，收集正丁醇层，然后在真空干燥箱中干燥8小时后，得到分离纯化的绿茶黄酮类物质。黄酮样品用蒸馏水溶解，置于试管4保存待用。2.2.2.4黄酮的测定：分光光度法2.2.2.4.1标准曲线的绘制准确称取128mg芦丁标准品放到小烧杯中并加入少量纯水，水浴加热使其部分溶解，然后将溶液转移人100ml容量瓶中。剩余的在小烧杯中的固体继续加水溶解，一并转移到容量瓶中。按此步骤重复，直至所有芦丁均转移至容量瓶中。然后将容量瓶置于水浴中加热，直至溶液完全澄清为止。冷却后，定容至100ml，此时即得12.8mg100ml的芦丁标准液 用移液管准确的吸取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml的芦丁标准液分别置于10ml的容量瓶中用60的乙醇溶液补充至大约5.2ml，然后先各加5的nano2 溶液0.3ml，摇匀后，放置6min；再各加10的al(no3)3，溶液0.3ml，再摇匀，放置6min，然后再加入1mol/l的naoh溶液4ml，用水稀释到刻度，放置20min，之后在510nm处测定吸光度值，以吸光度a对浓度c(mgml)进行线性回归。2.2.2.4.2黄酮得率的测定取制得的样品液1ml,置10ml的容量瓶中，按2.2.2.4.1节的操作进行显色反应，并测得样品的吸光度值，然后根据标准曲线求黄酮的得率。公式为：黄酮得率（%）提取液量*稀释倍数/称样量*100%2.2.3 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化性92.2.3.1 邻苯三酚的自氧化速率的测定 取4.5ml50mmol/l tris-hcl缓冲液（ph=8.2）、4.2ml蒸馏水倒入试管中，混匀后在25水浴中保温20min，取出后立即加入50l同样在25水浴中预热过的30mmol/l邻苯三酚溶液，迅速摇匀后倒入比色皿，在325nm下每隔30s测定一次吸光度，将其自氧化速率控制在0.0600.065a/min，然后计算线性范围内每分钟内吸光度的增加即回归直线的斜率，以ph8.2 tris-hcl缓冲液为空白对照，并记录结果。2.2.3.2 加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定 严格按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml的样品液，同时蒸馏水的加入量要分别减去相对应加入的样品液的体积，以ph8.2 tris-hcl缓冲液为空白对照，测定各组分溶液吸光度值。为了验证所提取的蛋白质以及黄酮类物质的抗氧化活性大小，本次实验选用0.05mg/ml的维生素c作为检测的对照。2.2.3.3计算清除率抑制率（%）=（a1ta2t）（a1t）100% 式中：a1t为邻苯三酚自氧化时反应速率10 a2t为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率3 结果与讨论3.1 蛋白质的提取分离一般蛋白质在低离子强度介质中都表现为盐溶（salted in），但在高离子强度介质中却表现为盐析(salted out)。本次实验使用的硫酸铵是最常用的盐，在水中溶解度比较大，并且受温度影响小，更重要的是其对蛋白质不仅无害处，而且还起稳定作用，分级效果较好且价廉。此次实验可采用：a.直接加固体粉末盐；b.加饱和盐溶液；c.对浓盐溶液进行透析等方式。本实验采用的是加固体粉末盐沉淀蛋白质。盐析时应缓慢加入硫酸铵，并一边加入一边搅拌，从而防止硫酸铵溶解时局部浓度过高。选用40%和80%两个浓度，从而获得这两个梯度的蛋白质来检验其抗氧化性。经硫酸铵沉淀的蛋白质，在做下一步测定以前，需要除盐，以恢复蛋白的活性，排除盐的干扰。除盐的方法用透析法。透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质与其它小分子物质比如无机盐、单糖以及色素等分开。将样品液置于半透膜中，然后将透析袋放于水中或适当的低离子强度的缓冲液中，因此无机盐类和小分子代谢产物，如atp、辅酶等，因为其扩散作用而通过半透膜从而被除去，大分子的蛋白质仍留在透析袋中。在透析的过程中需不断更换新的缓冲液，大约12h后，可用饱和bacl2检测，如不浑浊即表明透析的终止。因为本次实验提取的对象为活性蛋白质，因此整个提取过程中都应保持温度不易过高，避免造成活性蛋白质失活。因此，在提取的整个过程中，浸提、离心，盐析以及透析过程都应保持在4环境中进行。盐析时溶解硫酸铵应在冰水浴中进行，从而防止蛋白质失活。3.2 抗氧化性结果分析原始数据及分析邻苯三酚自氧化斜率k抑制率%时间t(min)00.511.522.533.54吸光度a00.0180.0370.0550.0710.0880.1040.1190.1350.033绿茶40%蛋白质ka1(0.1ml)1.61.6061.6151.6151.6171.6181.6241.6321.6320.0370a2(0.3ml)0.3420.3590.3760.3940.410.4270.4430.4580.4730.0323a3(0.5ml)1.0121.0231.0321.0431.0521.0611.071.0791.0870.01845.5a4(0.7ml)1.9241.9281.931.9451.9461.9471.9491.951.950.00778.8a5(0.9ml)2.3292.332.3312.3312.3312.3322.3312.3312.3320100绿茶80%蛋白质ka10.0820.0980.1150.1320.1480.1640.180.1950.210.0323a20.250.2580.2650.2750.2830.2910.30.3080.3160.01651.5a30.4130.4170.4230.4250.4290.4340.4370.4410.4450.00778.8a40.5810.5850.5860.5890.5920.5950.5980.60.6020.00584.8a50.7560.7570.7590.7620.7630.7640.7670.7690.7710.00390.9绿茶黄酮含量a=0.958浓度=0.0501mg/mlka12.4472.4622.4792.4962.5072.5180.02912.1a22.632.6362.6422.652.6522.6580.01166.7a32.5962.62.6052.6092.6152.620.00972.7a42.6262.6352.642.6412.6422.6420.00584.8a52.6622.6632.6632.6642.6642.6640100维生素c浓度0.05mg/mlka10.0250.0420.0630.0970.1360.1450.1630.180.1930.0440a20.0130.0290.0380.0520.0750.0990.1130.1270.140.0330a30.0040.0180.0290.0420.0570.0710.0860.1010.1170.02815.1a400.0090.0190.0280.0390.0490.0620.0720.0840.02136.4a500.0040.0080.0130.0190.0260.030.0350.040.0169.7图1加入0.1ml绿茶40%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图2加入0.3ml绿茶40%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图3加入0.5ml绿茶40%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图4加入0.7ml绿茶40%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图5加入0.9ml绿茶40%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图6加入0.1ml绿茶80%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图7加入0.3ml绿茶80%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图8加入0.5ml绿茶80%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图9加入0.7ml绿茶80%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图10加入0.9ml绿茶80%硫酸铵盐析蛋白质邻苯三酚吸光度值随时间的变化图11加入0.1ml（0.005mg）维生素c邻苯三酚吸光度值随时间的变化图12加入0.3ml(0.015mg)维生素c邻苯三酚吸光度值随时间的变化图13加入0.5ml(0.025mg)维生素c邻苯三酚吸光度值随时间的变化图14加入0.7ml(0.035mg)维生素c邻苯三酚吸光度值随时间的变化图15加入0.9ml(0.045mg)维生素c邻苯三酚吸光度值随时间的变化图16加入0.005mg绿茶中黄酮邻苯三酚吸光度值随时间的变化图17加入0.015mg绿茶中提取黄酮邻苯三酚吸光度值随时间的变化图18加入0.025mg绿茶中提取黄酮邻苯三酚吸光度值随时间的变化图19加入0.035mg绿茶中提取黄酮邻苯三酚吸光度值随时间的变化图20加入0.045mg绿茶中提取的黄酮邻苯三酚吸光度值随时间的变化3.2.1 邻苯三酚自氧化速率表1邻苯三酚自氧化速率时间/min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4吸光度/a1 0 0.018 0.037 0.055 0.071 0.088 0.104 0.119 0.135每隔30s所测邻苯三酚自氧化速率的吸光值结果见表1。由表1可知，邻苯三酚自氧化速率a1t=0.033邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化，生成有色中间产物和超氧阴离子自由基（o2-）, 而超氧阴离子自由基对自氧化又具有催化作用，提取样品对邻苯三酚自氧化的抑制率可作为它对超氧阴离子自由基的清除率来表现，可以根据自氧化速率的改变来计算提取物对o2-自由基的清除率。图21 邻苯三酚吸光度随时间的变化3.2.2 不同组分的蛋白质样品液对邻苯三酚自氧化速率的影响邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化，生成有色中间产物和超氧阴离子自由基（o2-）, 而超氧阴离子自由基对自氧化又有催化作用，提取样品对邻苯三酚自氧化的抑制率可作为它对超氧阴离子自由基的清除率来表现，根据自氧化速率的改变来计算提取样品对o2-自由基的清除率。加入不同量的用40%硫酸铵盐析提取的活性蛋白质时，对超氧阴离子自由基的清除率比较见表2。表2 绿茶40%硫酸铵盐析提取的活性蛋白清除率加入量/ml 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9清除率/% 0 3 45.5 78.8 100图 22 不同量绿茶40%盐析所得蛋白质对清除率的影响由图22可知，当加入不同量的40%硫酸铵盐析提取的活性蛋白质时对超氧阴离子自由基的清除率有所不同。并且随着提取的样品液加入量的不断增加，其对超氧阴离子自由基的清除率也随着增加，呈现出量效关系，而且其清除率维持在较高的水平。说明用40%硫酸铵盐析提取的绿茶中活性蛋白质具有较强的清除超氧阴离子自由基（o2-）的能力，具有较好的抗氧化性。加入不同量的用80%硫酸铵盐析提取的活性蛋白质时，其对超氧阴离子自由基的清除率比较见表3。表3 绿茶80%硫酸铵盐析提取的活性蛋白质清除率加入量/ml 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9清除率/% 3 51.5 78.8 84.8 90.9图 23 不同量绿茶80%盐析所得蛋白质对清除率的影响图23可知，当加入不同量的80%硫酸铵盐析提取的活性蛋白质时够很明显的降低邻苯三酚的自氧化速率，呈现明显量效关系，并随着提取样品液加入量的不断增加，其对超氧阴离子自由基的清除率也随着增加，但随着浓度的不断增加到一定程度后，抑制率就不再随浓度增大而再大幅度的提高。当加入量在0.1ml到0.5ml范围内时，其抑制率随样品液加入量的增加而增大的幅度比较大，而当加入量达到0.5ml后，清除率数值的增加值就趋于平衡。因此表3说明用80%硫酸铵盐析提取的绿茶活性蛋白质具有较强的清除超氧阴离子自由基（o2-）能力，具有非常好的抗氧化活性。本次实验用0.05mg/ml的维生素c作为检测的对照时，其对超氧阴离子自由基的清除率如表4。表4 维生素c清除率加入量/mg 0.005 0.015 0.025 0.035 0.045清除率/% 0 0 15.1 36.4 69.7图24 加入不同量维生素c的清除率图 25 0.5mlvc与等体积40%和80%盐析所得蛋白质清除率的比较图25表明，当加入0.5ml的40%盐析所得蛋白质，其抑制率比0.5ml的0.05mg/ml维生素c高出接近30个百分点。而用0.5ml的80%盐析蛋白质，其抑制率高于0.5ml的0.05mg/ml维生素c的抑制率约20个百分点，因此说明绿茶中40%与80%盐析所得蛋白质都具有比较好的抗氧化活性。 图 26 0.7mlvc与等体积40%和80%盐析所得蛋白质清除率的比较图26表明，当加入0.7ml的40%盐析所得蛋白质，其抑制率比0.7ml的0.05mg/ml维生素c高出接近一倍。而用0.7ml的80%盐析蛋白质，其抑制率高于0.7ml的0.05mg/ml维生素c的抑制率一倍还多，因此说明绿茶中40%与80%盐析所得蛋白质都具有比较好的抗氧化活性。 图 27 0.9mlvc与等体积40%和80%盐析所得蛋白质清除率的比较图27表明，当加入0.9ml的40%盐析所得蛋白质，其抑制率比0.9ml的0.05mg/ml维生素c高大约25个百分点。而用0.9ml的80%盐析蛋白质，其抑制率高于0.9ml的0.05mg/ml维生素c的抑制率20个百分点，因此说明绿茶中40%与80%盐析所得蛋白质都具有较好的抗氧化活性。 3.2.3 绿茶中黄酮提取物的浓度以及得率3.2.3.1芦丁浓度与对应的吸光度之间的关系 表5 芦丁浓度与对应的吸光度之间的关系浓度（mg/ml）吸光度0.01280.02560.03840.05120.06400.1250.4120.7031.0061.245 图28芦丁标准曲线实验测得绿茶中黄酮吸光度a=0.958从而查表得黄酮的浓度为0.0501mg/ml由黄酮得率（%）提取液量*稀释倍数/称样量*100%，而量得绿茶黄酮提取液体积为200ml，故黄酮得率（%）=0.0501*200/50000*100%=0.02%3.2.4 绿茶中提取的黄酮样品对邻苯三酚自氧化速率的影响加入不同量的绿茶中提取黄酮样品液时，对超氧阴离子自由基的清除率比较见表6。表6 绿茶中提取黄酮的清除率加入量/mg 0.005 0.015 0.025 0.035 0.045清除率/% 12.1 66.7 72.7 84.8 100图29 不同量绿茶中提取黄酮对清除率的影响由图29可知，当加入不同量的绿茶中提取黄酮时对超氧阴离子自由基的清除率是不同的。并且随着提取的样品液加入量的不断增加，其对超氧阴离子自由基的清除率也随着增加，呈现出量效关系，而且其清除率维持在比较高的水平。当加入量到0.045mg时，邻苯三酚的自氧化基本被全部抑制。说明绿茶中提取的黄酮具有较强的清除超氧阴离子自由基（o2-）的能力，具有非常良好的抗氧化性。实验同样用0.05mg/ml的维生素c作为检测的对照，结果如下。图30 0.025mgvc与等量绿茶中提取黄酮的清除率的比较图30表明，当加入0.025mg绿茶中提取的黄酮，其抑制率比等量的维生素c高出许多接近3倍有余。因此说明绿茶中提取的黄酮具有非常好的抗氧化活性。 图31 0.035mgvc与等量的绿茶中提取的黄酮清除率的比较图31表明，当加入0.035mg绿茶中提取的黄酮，其抑制率比等量的维生素c高出一倍多。因此说明绿茶中提取的黄酮具有较好的抗氧化活性。 图32 0.045mgvc与等量绿茶中提取的黄酮清除率的比较图32表明，当加入0.045mg绿茶中提取的黄酮，其抑制率比等量的维生素c高大约35个百分点，因此说明绿茶中提取的黄酮，比起相同质量的vc，具有更好的抗氧化活性。 3.2.5 绿茶中提取的多肽蛋白、黄酮类物质与vc抗氧化性能的比较图33 绿茶中各提取成分与维生素c的抑制率的比较（加样0.5ml）由图33可知，当加入相同量（0.5ml）绿茶中提取的蛋白质以及黄酮并以维生素c为对照时，对超氧阴离子自由基的清除率有所不同。总的来说绿茶中的蛋白质和黄酮对超氧阴离子自由基的清除率都比维生素c高。而且其清除率都维持在比较高的水平。相对而言，黄酮与80%浓度盐析蛋白质比维生素c对超氧阴离子自由基的清除率高出3倍左右，而40%浓度盐析蛋白质比维生素c只高出2倍左右。说明绿茶中提取的黄酮以及蛋白质具有较强的清除超氧阴离子自由基（o2-）的能力，具有非常好的抗氧化性。图34 绿茶中各提取成分与维生素c抑制率的比较（加样0.7ml）由图34可知，当加入相同量（0.7ml）绿茶中提取的蛋白质以及黄酮并以维生素c为对照时，对超氧阴离子自由基的清除率有所不同。总的来说绿茶中的蛋白质和黄酮对超氧阴离子自由基的清除率都比维生素c高。而且其清除率都维持在非常高的水平。此时各个浓度盐析蛋白质以及黄酮的清除率都在80%以上，由此说明绿茶中提取的黄酮以及蛋白质具有较强的清除超氧阴离子自由基（o2-）的能力，具有良好的抗氧化性。图35 绿茶中各提取成分与维生素c抑制率的比较（加样0.9ml）由图35可知，当加入相同量（0.9ml）绿茶中提取的蛋白质以及黄酮并以维生素c为对照时，其对超氧阴离子自由基的清除率是不同的。数据表明绿茶中的蛋白质和黄酮对超氧阴离子自由基的清除率都比维生素c高。并且其清除率都维持在相当高的水平。此时40%浓度盐析蛋白质以及黄酮的清除率都接近于100%，由此说明绿茶中提取的黄酮以及蛋白质具有较强的清除超氧阴离子自由基（o2-）的能力，具有非常好的抗氧化性。4 结论与讨论4.1 结论为了探索绿茶中功能成份，多肽或蛋白以及黄酮类物质茶多酚，他们的抗氧化性能和作用，实验采用邻苯三酚自氧化法测定绿茶中提取的抗氧化蛋白质以及黄酮对超氧