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贵州大学 硕士学位论文 吡啶2，3-d嘧啶衍生物的合成与生物活性研究 姓名：徐波 申请学位级别：硕士 专业：有机化学 指导教师：欧阳贵平 20070501 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明弓l 用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究曾做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： i 龛1 1 !日期：星q q ：2 生i 茜 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：红金( 丝导师签名 日期；2 0 07 1 月 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 表皮生长因子受体酪氨酸激酶( e g f r m ( ) 是人们近年来发现的一个新的 抗癌的靶点，它的磷酸化作用与细胞的许多调节有关，一旦其过度表达时，细胞 的生长就会处于失控状态，从而导致恶性肿瘤的产生，因此寻找好的e g f r - t k 抑制剂己成为广大药物工作者所研究的热点。 为了寻找新的高效e g f r 抑制剂，指导开发治疗癌症的新靶标药物，本论文 以p d1 5 3 0 3 5 为先导化合物，将喹唑啉环上的8 位c 原子换成n 原子，以2 - 氨 基烟酸为原料设计合成了两类化合物：4 胺基吡啶【2 ，3 一d 】嘧啶类化合物1 6 个，4 硫代吡啶【2 ，3 d 】嘧啶类化合物4 个，经瓜、1 hn m r 、1 3 cn m r 和元素分析确证 了化合物结构。对关键中间体吡啶1 2 ，3 d 】嘧啶4 酮，采用微波辐射催化的绿色合 成方法，对其的合成进行了优化。其反应时间由原来的4 小时缩短到3 0 分钟， 其产率也由原来的6 8 9 提高到8 3 6 。 对目标化合物进行了体外抗肿瘤活性测试，发现1 6 个- 取代- 4 胺基吡啶 ( 2 ，3 卅嘧啶类化合物均无抑制活性，但是有一个4 硫代吡啶【2 ，3 - d 嘧啶化合物对 p c 3 细胞表现出了明显的离体抑制活性，其在1 0 州浓度时，对p c 3 细胞( 人 前列腺癌细胞) 的抑制率为4 9 7 。 该类化合物是首次报道对癌细胞具有抑制活性，为我们寻找高效的先导化合 物指明了方向，有进一步研究的价值。 关键词：吡啶 2 ，3 一d 嘧啶，e g f r 抑制剂，合成，生物活性 分类号：0 6 2 6 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a c t e g f r - t kh a sr e c e n t l yb e e nr e p o t e da san e w t a r g e tf o rs t u d y i n ga n t i t u m o ra c t i v c t i c s i t sp h o s p h o r r y l a t i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nr e g u l a t i n gt u l l l o rg r o w t ha n d m e t a s t a s i s h i g he x p r e s s i o no f e g f r h a sb e e na s s o c i a t e dw i t hm a n y t y p eo f t u m o r c e l lm a l i g n a n tp r o l i f e r a t i o n t h es t u d yo ni n b a b i t i o no f e g f r - t k h a s b e c a m ea h o t a r e ao f r e s e a r c h a sf i n dah i g h l ye f f e e t u le g f ri n h i b i t i o rt h a tc a l lg u i d et h el l e wd e v e l o p m e n to f n e wc o m p o u n dt ot r e a tc a n c e ri sac h a l l e n g i n gt a s k t a k i n gp d l 5 3 0 3 5a st h el e a d c o m p o u n d ，c a r b o na t o m a tt h e8 - p o s i t i o no fq u i n a z o l i n er i n gi ss u b s t i t u t e db y n i t r o g e na t o m 。s t a r t i n gf r o m2 - a m i n o n i e o t i n i ca st h er a wm a t e r i a l ，w eh a v ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dt w ok i n d so fn e v o t y p ep y r i d o 2 ，3 - d p y r i m i d i n ec o m p o u n d s ：1 6 4 - a m i d o p y n d o 2 ，3 - d 】p y r i m i d i n ea n d44 - s - s u b s t i t u t e d - p y r i d o 2 ，3 - d p y r i m i d i n e t h e s t r u c t u r e so fa l lm e2 0c o m p o u d sa r ec h a r a c t e r i z e db yi l l1 hn m r 1 3 cn m ra n d e l e m e n t a la n a l y s i s t h es y n t h e t i cm e t h o df o rp y r i d o 2 ，3 d 】p y d i m i d i n e - 4 - o la st h ek e y i n t e r m e d i a t ei ss t u d i e da n do p t i m i z e d t h ep r e s e n tm e t h o di n v o l v i n gg r e e nm i c r o w a v e i r r a d i a t i o no f f e r ss e v e r a la d v a n t a g e s ，s u c ha sf a s tr e a c t i o nr a t e , h i 曲y i d d ，l e s s 日b y p r o d u c e dw i t l lm i m i m a lp o l l u t i o n t h ei nv i t r oa n t - c 疆n c e ra c t i v i t i e so ft h e2 0c o m p o u n d sa r et e s t e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h e1 6n - s u b s t i t u t e d - 4 - p y r i d o 2 ，3 - d p y r i m i d i n ec o m p o u n d sp o s s e s s e d w e a ka n f i c a n c e ra c t i v i t i e s h o w e r e r , o n e4 - s - s u b s t i t u t e d p y r i d o 2 ，3 - d p y r i m i d i n e c o m p o u n dw a sf o u n dt od i s p l a yad i s t i n c ta c t i v i t y t h i sk i n d o fc o m p o u n dw i t ha n i n h i b i t o r ya c t i v i t yw a sn o tr e l x | r t e de a r l i e r t h ei n v e s t i g a t i 0 4 ad i r e c t st oi d u n t i f ya n e f f e c t i v el e a dc o m p o u n ds e e m i n gw o r t ho f f u r t h e rr e s e a r c h k e y w o r d s ：p y r i d o 2 ，3 - d p y r i m i d i n e ；e g f ri n h i b i t o r ；s y n t h e s i s ；b i o a e t i v i t y 2 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 前言 据统计：近年来美、欧、日等国家和地区每年新增的癌症患者达4 0 0 万人左 右，全世界癌症死亡人数达6 3 0 万人。随着科技的进步，肿瘤化疗也取得了相当 大的进步，肿瘤患者生存时间明显延长，特别是对白血病、恶性淋巴瘤等的治疗 有了突破，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤9 0 以上的实体瘤的 治疗未能达到满意的效果。药学家和肿瘤学家越来越深刻地认识到：要提高肿瘤 治疗的疗效，必须从肿瘤发生发展的机制着手，才能取得新的突破性进展。表皮 生长因子受体酪氨酸激酶( e g f r - t k ) 是人们于近年来发现的一个新的抗癌的 靶点，它的磷酸化作用与细胞的许多调节有关，一旦其过度表达时，细胞的生长 就会处于失控状态，从而导致恶性肿瘤的产生。因此寻找好的e g f r 抑制剂已成 为广大药物工作者所研究的热点。 e g f r 的生物特性提示它能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点，针对肿瘤内偏离正 轨的信号传导通路的药物应该比传统药物具有更高的选择性和更低的毒性。然而， 肿瘤细胞内复杂的信号传导过程和受体之间的相互影响可能使高度特异的治疗 失效因此。因此新的生物药品和传统药物相结合可能是最有效的，临床前研究也 发现了抗e g f r 治疗的疗效及激活放化疗的作用。此外，在很多恶性肿瘤中， e g f r 的表达往往与较差的预后和较低的生存率相关。因此可以推测，如果有药 物能阻断e o f r 的活性，那将会抑制其磷酸化和信号传导，从而起到多重途径的 抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。 表皮生长因子受体酪氨酸激酶( e g f r 哪( ) 抑制剂是一种靶向作用于细胞 内酪氨酸信号通路的小分子物质。酪氨酸激酶( t k ) 抑制剂能竞争性地与a t p 结合位点结合从而阻断配体激活表皮生长因子受体( e g f r ) 。他们的小分子结构 使其能轻松地进入肿瘤，并且能通过口服用药。多种酪氨酸激酶抑制剂在开发中， 其中最常用的是喹唑啉和吡咯吡咯并口比啶并嘧啶。 当前研究最多的一类e g f r 抑制剂是喹唑啉类化合物，本论文结合喹唑琳已 报道的喹唑啉类化合物中活性较高的化合物，对文献进行综合分析。尤其是分析 在抑制e g f r - t k 方面有优异表现的4 - 苯胺基喹唑啉类化合物( 代表化合物 p d l 5 3 0 3 5 ) 。发现将喹唑啉化合物的苯环变为吡啶环，做成4 - 氨基吡啶【2 ，3 棚嘧 啶的化合物较少，这样可以利用吡啶环上n 原子的共轭吸电子效应，以期能找 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 到更好的抗癌药物。在此基础上设计了两类化合物：4 - 氨基- 毗啶 2 ，3 卅嘧啶类衍 生物和吡啶【2 ，3 捌嘧啶硫醚类衍生物。 经过生物活性测试，有一个4 硫代吡啶 2 ，3 词嘧碇化合物对p c 3 细胞表现出 了明显的离体抑制活性。该类化合物癌细胞的抑制活性尚未见报道，为我们寻找 高效的先导化合物指明了方向，有进一步研究的价值。 4 壅苎2 登! 竺塑星堡主兰垒堡塞 一、文献综述 1 1e g f r 抑制剂研究的进展 表皮生长因子受体酪氨酸激酶( e g f r - t k ) 是在文献中最早描述的一个酪 氨酸激酶，它的磷酸化作用与细胞的许多调节有关，一旦其过度表达时，细胞的 生长就会处于失控状态，从而导致恶性肿瘤的产生。同时，许多其他的受体和非 受体酪氨酸激酶也逐渐成为研究课题中有吸引力的研究对象。 表皮生长因子受体( e g f r ) 广泛分布于哺乳动物的上皮细胞膜上，与细胞的 增殖、死亡和分化有关。e g f r 家族由4 个成员构成，包括：e g f r ( h e r l e r b b 一1 ) ， e r b b - 2 ( h e r 2 n e u ) ，e r b b - 3 ( h e p 3 ) 和e r b b - 4 ( h e r 4 ) 。它们的结构相似( k o l i b a b a ks ，1 9 9 7 ) ：( 1 ) 细胞外配体结合区，呈现配体特异性；( 2 ) 疏水跨膜区，使受 体锚定在膜上，有高度同源性；( 3 ) 细胞内酪氨酸激酶区，为受体的胞质区，具 有酪氨酸激酶活性，可以使自身磷酸化或催化外源性底物发生磷酸化。e g f r 酪 氨酸激酶是细胞外生长信号传递到细胞内的枢纽。当配体与e g f r 结合时，受体 发生二聚化，激活内在的酪氨酸激酶活性，使自身酪氨酸残基发生磷酸化，与下 游含s h 2 和p t b 区域的蛋白结合，激发信号级联反应。 e g f r 酪氨酸激酶介导的细胞生长信号通路在癌症的形成和发展过程中起 重要作用。激活e g f r 会产生细胞分裂的信号，增加细胞的运动性抑制细胞的凋 亡，从而导致细胞的无规律的生长( y a r d e ny ，c ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在众多e g f r 在许 多不同的实体瘤患者中过表达，包括t n , 细胞肺癌( n s c l c ) 、乳腺癌、卵巢癌、 头颈癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌和胶质细胞瘤等，常与术后不良、放 化疗抗性、肿瘤血管形成和肿瘤的转移有关，已成为肿瘤治疗的理想靶点( 见图 1 1 ) 。 5 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 图1 1 小分子e g f r 抑制剂作用原理图 f i g1 it h ep r i n c i p l ed i a g r a mo ft h er o l ep l a y e db ys m l lm o l e c u l e s 1 9 8 7 年，a k i y a m a ( a k i y a m at ，e ta l ，1 9 8 7 ) 首次报道e g f r 小分子抑制 荆槲皮素( q u e r c e t i n , 1 ) 和燃料木黄酮( 金雀异黄素，金转停，o e n i s t e h a , 2 ) 等天 然黄酮和异黄酮化合物，对a t p 有相对较弱的非选择性竞争性。此外天然的吲 哚咔唑( i n d o l e c a r b a z o l e ) 、星形孢菌素( s t a u r o s p o r i n e ，3 ) 、薰草菌素( 1 a v c n d u s t i n , 4 ) 和制表菌素( e r b s t a t i n , 5 ) 也都是较弱的e g f r 非选择性抑制剂( t a n a o k it ，e ta l ， 1 9 8 6 ；m a r ks ，e ta l ，1 9 8 9 ；o s h e r o vn ，c ta l ，1 9 9 3 ；b u r g c ram ，e ta l ，1 9 9 5 ；r a m a d 笛 l c ta l ，1 9 9 4 ) 。 6 争p努蝴。 9 m 洲。 洲文 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 o h 4 h 。、：n h c h 。 5 为了找到新的更好的e g f r 抑制剂，对人们近年来在这方面药物研究中的工 作按结构特征分类来进行介绍。 1 1 1 含喹唑啉结构的化合物 p d1 5 3 0 3 5 是第一个报道的选择性e g f r 酪氨酸激酶小分子抑制剂。随后有 数百种e g f r 酪氨酸激酶的小分子抑制剂陆续被报道。 p a r k e - d a v i s 公司( f r ydw ，da l ，1 9 9 4 ) 报道的喹唑啉衍生物( p d 一1 5 3 0 3 5 ) 6 是一种有效的选择性e g f r 抑制剂，对e g f r 的i c 5 0 值为2 9t u n o l l ，即使其浓度高 达5 0t t m o l l 时，仍不能抑制其它酪氨酸激酶。各种细胞类型的实验中，在纳摩 尔浓度下化合物6 也可阻断e g f r 自身的磷酸化。因此，化合物6 可作为e g f r 抑 制剂的标准物。但化合物6 的水溶性较差，对于肿瘤模型的体内评价较为困难。 化合物6 是可逆性抑制剂，而不可逆性抑制剂可以在更低浓度下阻断酶的细胞活 性。为此p a r k e - d a v i s 公司( s m a i l ljb ，e ta l ，2 0 0 0 ) 发现，通过与受体中靠近a r p 结合部位的半胱氨酸残基公价结合，2 硫代腺苷能不可逆的抑制e g f r 和e r b 2 。 因此利用上述原理合成化合物( p d - 1 5 8 7 8 0 ) 7 ，模拟实验表明：其丙烯酰胺基 能与e g f r 第7 7 3 位半胱氨酸形成共价键，对分离酶的i c 5 0 值为0 7l a n o l l 。 6 - i r o 7 b r i a n 等( b r i a nd ，e ta l ，1 9 9 7 ) 研究了系列吡咯并喹唑啉类化合物的构效关 系，发现在吡咯并喹唑啉类化合物的1 n 位置取代和与其相对应的吡啶并嘧啶类 化合物相比活性依然很好，然而在3 - c 位置取代则没有预期的活性。在他们研究 的该类化合物中，化合物8 的活性较好其抑制e g f r 酶活性的i c 5 0 值为o 3 7 7 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 t t m o l l 。 8 d i s c a f a n i 等( d i s c a f a n icm ，e ta l ，1 9 9 9 ) 合成了含丁炔酰胺基结构的化合 物( c l - 3 8 7 7 8 5 0 ) 9 ，其是不可逆抑制剂，对e g f r 酶的抑制活性和自身磷酸化 的i c 5 0 值分别为3 7 0p m o l l 和5n m o l l ，在a 4 3 1 异种移植模型实验中，采用口 服给药时表现出抑制作用。 9 p o l l a c k 等( p o l l a c kv 气e ta l ，1 9 9 9 ) 报道了另一种喹唑啉衍生物 ( c p 3 3 5 7 7 4 ) 1 0 ，其抑制分离e g f r 的i c 5 0 值为2n m o l l ，在e g f r 自身磷酸化 实验时i c 5 0 值为2 0n m o l l ，并能在培养实验时阻断人结肠癌细胞的生长。进一 步研究表明，在细胞培养时和异种模型实验时均可抑制人头颈肿瘤细胞系h n 5 的增值。 1 0 z a l 1 9 c a 公司( c i a r d i e l l of ，e ta l ，2 0 0 0 ) 研制了化合物( z d 1 8 3 9 ) 1 1 ，它可 竞争e g f r - t k 催化区域上m g - a t p 结合位点，对分离酶的i c 5 0 值为2 0 n m o l l ， 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 在许多异种移植模型实验中口服均具有活性。由于该化合物具有新型抗肿瘤作用 机制，激起人们对它临床用于治疗各种实体肿瘤的兴趣。且该药已获得了日本卫 生省及美国f d a 的新药批准，用于治疗非小细胞肺癌及胰腺癌。 厂、 弋 o s l - 7 7 4 ( t a r c e v a ) 是辉瑞( p f i z e r ) 公司研究开发的，临床前研究表明： o s i 7 7 4 对纯化的e g f r - t k 的l c 5 0 是2n m o f l ，对体外细胞自动磷酸化的i c s o 是2 0n m o f l ，在i l m o l l 水平抑制d i f i 人结肠癌细胞系生长，为一可逆性a t p 竞争性抑制剂。o s i - 7 7 4 也使细胞周期停留在g 1 期( s i ull ，e ta l ，1 9 9 9 ) ，上 调p 2 7 哪。o s i - 7 7 4 体外能诱导癌细胞凋亡，体内对各种移植肿瘤具有抗肿瘤活 性( k a r pdd ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。与顾铂合用，大大增强抑瘤活性，而对体重及致死 毒性影响很小( p e r e z - s o l e r e ta l ，2 0 0 1 ) 。 临床研究表明，o s i 7 7 4 的一周最大耐受量为1 6 0 0 m g ，副作用为腹痛 ( s h e r w o o d v ，c ta l ，1 9 9 0 ) 。2 8 名接受o s i 7 7 4 治疗的病人，1 2 名存活( 9 2 2 个月) ， 包括1 1 名肺癌病人中的5 名，5 名头颈癌病人中的3 名。o s i - 7 7 4 的i i 期临床研究正 在进行之中，并己有报道：5 7 例晚期的顺铂治疗失败的h s c l c 病人，用o s i - 7 7 4 治疗，1 例完全缓解，6 例部分缓解，1 7 例病情稳定( d r i s c o l ld ，e ta l ，1 9 9 9 ) 。 c i - 1 0 3 3 ( p d1 8 3 8 0 5 ) 1 2 是p a r k e r - d a v i s 公司研究开发的，是一种选择性的 不可逆e g f r 酪胺酸激酶抑镑4 剂( s h i n d m ，c t a l ，2 0 0 1 ) ，对a 4 3 1 细胞e g f r - t k 的i c s o = 7 4n m o l l ( s h e r w o o dv ，e ta l ，1 9 9 9 ) ，d r i s c o l ld 等( d r i s c o ud ，e ta l ， 1 9 9 9 ) 已证明c i 1 0 3 3 具有体内抑制a 4 3 1 和h 1 2 5 肿瘤的活性。c i - 1 0 3 3 目前正 在进行i 期临床试验，己有报道，5 0 例晚期癌症病人用剂量渐增的c i - 1 0 3 3 ( 5 0 6 5 0 m g d ，每三周口服7d 1 ，分子中的丙烯酰基使得它的毒性增大，毒性包括皮疹和 腹泻( s h i n d m ，e t a i ，2 0 0 1 ) 。 9 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 f a ( e k b 5 6 9 ) 1 3 为4 胺基喹啉衍生物，不可逆抑截j e g f r 酪氨酸激酶，选 择性的抑铝i j e g f r 和h e r 2 的酪氨酸激酶活性。g r e e n b e r g e r 等人( g r e e n b e r g e r l m ， e ta l ，2 0 0 0 ) 报道，e k b 5 6 9 在体内外均有较好的活性，对e g f r 酪氨酸激酶的 i c 5 0 为1 3 3n m o l l ：抑制e g f r 过表达细胞的细胞内磷酸化，i c s 0 约为1 5r a n o l l ； 面对其他酪氨酸激酶，则需要l o 倍以上的剂量。e k b 5 6 9 对e g f r 或h e r 2 过 表达细胞的生长有明显的抑制作用，e c 分别为1 4 - - 6 6 和1 2 5 0 n m o l l ，抑制作 用与g 0 g 1 期不可逆停滞有关。在裸鼠的异种移植肿瘤模型中，口服1 0m g k g d ， 连续1 0d ，抑制e g f r 过表达肿瘤细胞的增长，而对于无e g f r 过表达肿瘤细胞的 增长没有抑制作用。 h n 腹 1 3 2 0 0 0 年m o d n ( m o r i nmj ，2 0 0 0 ) 综述了过去1 0 年来从致癌基因到抗癌药 的发展，尤其对小分子选择性酪氨酸激酶抑制剂的抗癌活性做了总结，如喹唑啉 类化合物：z d1 8 3 9 ( b e s s a 啪) 、c p 3 5 8 7 7 4 ( o s i - 7 7 4 ) 、p d1 8 3 8 0 5 ( c 1 1 0 3 3 ) 、 z d - 4 1 9 0 ( 1 4 ) 。结构式如图1 9 所示。 1 4 其中z d1 8 3 9 对e g f r 酪氨酸激酶的i c 5 0 = 2 5n m o f l ，对e r b b 家族中e r b b 2 的i c 5 0 = 1 3i _ t m o f l ，对e g f 独立分裂抑制的i c 5 0 为8 0n m o f l ，厨时在抑制 1 0 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 e g f r 信号传导途径上也有很高的活性。c p 3 5 8 7 7 4 也是一个具有选择性e g f r 功能的抑制剂，对e g f r 酪氨酸激酶的i c 5 0 = 2n m o l l ，对e r b b 2 用同样具有高 的选择活性，对v - s r o 、c - a b l 和i g f - i 受体选择性抑制活性也较高，对抑制e g f r 过量表达的癌细胞的i c 5 0 = 2 0n m o l l ，同时还具有e g f r 特定酪氨酸磷酸化抑 制作用，其e d s o 为1 0m g k g ，对e g f r 磷酸化激酶也有抑制活性。p d1 8 3 8 0 5 也表现出同样好的活性，同时对其它e r b b 激酶( 如e r b b 2 、e r b b 3 、e r b b 4 ) 选择 性抑制效果也较好。而z d4 1 9 0 是一个v e g f r 的抑制剂，对k d r 的i c 5 0 = 2 9 n m o l 几，对f i t - 1 的i c 5 0 = 7 0 8n m o l l 。z d1 8 3 9 已经进入i i i 期临床，c p3 5 8 7 7 4 已经进入i i 期i 临床，p d1 8 3 8 0 5 和z d4 1 9 0 已经进入i 期临床。 2 0 0 1 年j o n e s 等人( j o n e she ，e ta l ，2 0 0 1 ) 报道了一个e g f r 选择性酪氨酸 激酶抑制剂和表现出对l n c a p 细胞抗雄性激素作用化合物一z m2 5 2 8 6 8 。此 化合物在过去五年期闻已经被报道通过影响e g f r 信号传导途径，进而表现出对 人体前列腺癌细胞的雄性激素有抑制作用，而且对m a p k 的信号传导也有一定 的阻断作用。j o n e she 等人对l n c a p 细胞和各种生长因子( 如e g f 、t g f - c r 、 b f g f 、5 c # - d h t 、口f g f 、k g f 、i g f i 、p d g f 等) 存在或缺乏下或存在z m2 5 2 8 6 8 下用细胞计数的方法测定其抗雄性激素的作用。采用w e s t e r nb l o t 的方法对雄性 激素受体的表达、e g f r 的表达以及用免疫印迹的方法鉴定了活化的m a p k 和 m a p k 信号串联的改变。结果表明：z m2 5 2 8 6 8 对l n c a p 细胞正常生长无影响， 在lp m o l l 药剂浓度下，可对e g f 、t g f 口刺激的l n c a p 细胞抑制6 0 以上； 而对b f g i 、5 a - d h t 刺激的l n c a p 细胞无抑制作用。在lp m o l l 药剂浓度下可 有效的降低免疫活化的e g f r 的表达，而对雄性激素受体无作用；同时，在此浓 度下对由e g f 激活的m a k p 的信号也会有规律的降低，但对5 a - d h t 无影响。 最终表明z m2 5 2 8 6 8 是一个有效的选择性对l n c a p 细胞e g f r 抑制作用，而对 抗雄性激素和e g f r 传导途径之间没有相互的交叉作用。 2 0 0 1 年r u s n a k 等人( r u s n a kdw e ta l ，2 0 0 1 ) 报道了一个喹唑啭类化合物 g w2 0 1 6 _ n - 3 氯4 【( 3 - 氟苯基) 氧】苯基) 一【5 一( 【2 一( 甲磺酰) 乙基】胺基) 甲 基) 2 呋喃基】4 喹唑啉氨1 5 ，通过生物活性测定表明其对e g f r 和e r b b 2 酪氨 酸激酶有抑制作用，i c 5 0 可达1 0 2n m o l l 和9 8n m o l l ，对e r b b - 4 的i c 5 0 为3 6 7 n m o l l ，c - s r c 的i c s 0 为3 5 0 0n m o l l ，对其它的酶( 如c r a f - i 、m e k 、e r k 、 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 c - f i n s 、c d k l 、c d k 2 、p 3 8 、t i e - 2 、v e g f r - 2 等) l c 均大于1 0 0 0 0n m o l l 。 同时，还测定了对不同细胞( 如h n 5 、a 4 3 1 、b t 4 7 4 、c a l u - 3 、n 8 7 等) 的e g f r 或e i b b 2 酪氨酸激酶的抑制作用，结果表明：对于大部分细胞处理7 2h ，其i c s o 均小于0 1 6l j i r a o l l ；还与另两个喹唑啉化合物z d l 8 3 9 、o s i 7 7 4 作了比较，优 于或接近两者的抑制效果，而对于正常细胞基本无影响。g w2 0 1 6 是一类选择 性的对于癌细胞的e g f r 或e r b b 2 或两者均有的过度表达的治疗药剂，对于h n 5 和b t 4 7 3 癌细胞，对大剂量3 0m g k g 或1 0 0m g k g 口服每天二次，对癌细胞有 很高的抑制作用，而对正常体细胞影响很小。 。够b ， 1 5 2 0 0 1 年l i c h t n e r 等人( l i c h t n e rrb ，e ta l ，2 0 0 1 ) 利用1 2 5 i 标记的e g f ( 1 0 0 c i m m 0 1 ) 与4 3 1 癌细胞结合在喹唑啉酪氨酸激酶抑制剂p d1 5 3 0 3 5 、z d1 8 3 9 存在下测定其不同浓度下的抑制效果，结果表明：在1 0 3 0 0n m o f l 下p d1 5 3 0 3 5 和z d1 8 3 9 能完全阻断由e g f r 引起的磷酸化作用。同时，一系列的数据表明 喹唑啉化合物不仅引起e g f r 通过螯合作用形成无活性的二聚体，而且使配位变 得非常复杂，降低了有效配位的水平。经典模型如图1 2 所示，新提出的模型如 图1 3 所示。 凶凶翌罔 凶凶佥蹩酋 图1 , 2 抑制剂存在下e g f r 和受体结合的经典模型 f i g1 2t h ec l a s s i c a lm o d e lo f e g f rb i n d i n gi t sr e c e p t o rw i t hi n h i b i t o r 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 m m k 到k 到 翌 图1 3 抑制荆存在下e g f r 和受体结合的新模型 f i g1 31 km w m o d e lo f e g f rb m d i n gi t sf e c 印0 0 r 谢t hi n h i b i t o r s ：娜 1 3 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 7 的i c s o 为3 6 - l m o l l ，单纯的s m a 5 2 的i c 5 0 为5 9f l f n o l l ；但处理2 h ，1 8 的 i c 5 0 大于1 0 0 岬o l l 。在对e g f r 酪氨酸激酶抑制活性测试中，s m a 4 1 的l c ，o 为0 2 t m o l l ，而单纯的1 8 的i c 卯为1 0 2f m o l l 。对e g f 引导的e g f r 自动磷 酸化抑制作用试验中，i c s o ( s m a 5 2 ) 为8 4 4b t m o l l ，i c 5 0 ( s m a 4 1 ) 为1 2 5p m o l l 。 在d n a 损伤试验中，药剂浓度从2 5 1 0 0u m o l l ，处理3 0r a i n 和2h ，1 7 能明显 的比1 8 损伤d n a 的程度强。 h h 3 1 4 c 7 h k n h h i ：1 7 弋c h 3 n 2 0 0 3 年n o r m a n n o 等人( n o r m a n n o n ，e t a l ，2 0 0 3 ) 总结了一个喹唑啉化合物 z d l 8 3 9 ，对e g f r 、e r b b 2 、e r b b 3 、e r b b 4 的酪氨酸激酶均有较高的抑 制活性。对e g f r 和e r b b - 2 的i c 5 0 在0 8 2t a m o v l 之间，但药剂浓度在5i u m o l l 时，对e r b b - 2 过度表达有较高活性，而对e g f r 无活性。在对e r b b 组受体的 表达抑制活性，对e g f r 、e r b b - 2 、e r b b 3 分别达到4 0 8 0 、1 8 6 0 、2 5 8 5 。 2 0 0 2 年o r t u 等人( o r t ug ，e ta l ，2 0 0 2 ) 报道了一个带放射性喹唑啉化合物 n c m l 0 3 l - n - 4 一【4 ，5 一二氯一2 - 氟苯基氨基】喹唑啉- 6 基) 丙烯酰 1 1 c 】胺2 1 的 合成，此化合物是一个e g f r - t k 抑制剂，可作为抗癌药物。对a 4 3 1 细胞的生 物活性测试表明，i c s o 为0 0 3 7 n m o l l 。在1 5 0 p m o l l 药剂浓度下，对e g f r - t k 自动磷酸化抑制率处理1h 达到8 2 5 ，处理2 h 达到9 5 处理8h 达到9 7 5 。 通过测定该化合物的放射性，室温处理2 0r a i n 后，表明在细胞中存在有6 7 n c m l 0 3 。还通过阳离子发射断层x 射线照相法( p e f ) 对注射1 8 f p d g 和 i l l c m l 0 3 的癌细胞进行了扫描分析。同时，通过检测其降解产物的放射性和用 t l c 方法推导出了【l l c m l 0 3 ( 2 1 ) 的降解方式如图1 1 5 所示。 吖拶三1 1 0 f 0 h = n 1 9 1 4 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 广1 1 旷 o 吮，h j j o 2 l2 2 2 0 0 2 年m o n t g o m e r y ( m o n t g o m e r yrb ，2 0 0 2 ) 报道了两个喹唑啉类化合物 2 3 和2 4 ，是抑制e g f r - t k 的突变剂，能阻断e g f r v i i i 的多信号传导通道。 对n i h 3 t 3 细胞e g f r v i i i 酪氨酸酶抑制试验结果表明：2 3 在1p m o f l 药剂浓度 下处理2 4 h 或者5 0 0 n m o l l 药剂浓度下处理4 8 h 均有一定的抑制效果。对c 0 1 2 细胞试验表明有抑制m a p k 的活性，在1p m o l l 药剂浓度下处理2 4h ，2 3 和 2 4 抑制率均达到5 0 左右。a g l 4 7 8 对h c 2 细胞试验表明在1p m o f l 药剂浓度 下对吐m k p 1 无明显的抑制活性，而对nm k p 2 在0 5 邶a o f l 药剂浓度下有明 显抑制活性，在l m o f l 药剂浓度下抑制率达到1 0 0 。 h n q c , ih n q 卧 ：复泠：薹脚 2 3 2 4 2 0 0 3 年陈惠等人( 陈惠，2 0 0 3 ) 为了进一步开发新型4 氨基喹唑啉类选择性 的e g f r 酪氨酸激酶抑制剂，先后合成了十个新的喹唑啉类化合物，并进行了生 物学的实验。首先合成了已有文献报道，并且证实有良好生物学活性的五个喹唑 啉类化合物。再以2 氨基5 硝基苯甲腈为起始原料，分别经过水解，环合，氯代， 取代，还原，成碱等六步反应，合成了十个新的具有生物活性的4 - 苯胺基喹唑啉 类席夫碱化合物，并对每一步的反应产物作了相关的结构鉴定及谱图说明。并选 择了三种肿瘤细胞来检验所合成的4 苯胺基喹唑啉类席夫碱化合物的生物活性， 用一种正常细胞作对比试验，考察它们对肿瘤细胞的的生物选择性。具体采用了 m t t 法进行检验，并获得了良好的效果。它们分别应用于四种细胞：h h c c 细胞， b e a p 3 7 细胞，a 4 3 1 细胞) 及n i h 3 t 3 细胞，经过m ，兀生化学实验及统计学分析发 现，化合物v 和化合物v i 对几种肿瘤细胞的抑制活性普遍较好，且当与正常细胞 n i h 3 t 3 的抑制活性比较，发现所有这几个化合物的选择性都较好。在立体选择 1 5 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 性方面，在a ：o 0 5 的置信区问范围内，d 型和l 型的立体构型对四种细胞的抑制 活性均有显著性差异，并且均呈现d 型优于l 型的趋势( 除了化合物( d ) 和( l ) - 4 - ( 1 苯乙基氨基) 6 - 硝基喹唑啉对a 4 3 1 细胞的抑制力为l 型 d 型。 2 0 0 4 年w o o d 等人( w o o de e ta l ，2 0 0 4 ) 研究了一个对e g f r 有抑制作用的 喹唑啉类化合物g w5 7 2 0 1 6 ，与z d1 8 3 9 、o s i - 7 7 4 、c i - 1 0 3 3 作了比较，结果如 表1 1 所示： 表1 1 在临床过程中发展的e 南b 酶抑制剂 t a b l e1 1e r b bi n h i b i t o r si nt h ep r o c e s so f c l i n i c a ld e v e l o p m e n t c o m p o u n d e g f re r b b 2e i b b 4 l c s o ( n m o l l ) g w 5 7 2 0 1 6 r r n 。h 3 妁 z d l 8 3 9 n 吖、 、 泛沏 o s i - 7 7 4 c 1 1 0 3 3 0 4 0 圭o 1 8 7 0 = t ：9 01 1 3 0 ：1 = 3 7 0 0 7 4 - o 11 0 0 0 哇1 0 01 5 3 0 2 7 0 3 0 士2 01 2 7 士4 23 8 8 士1 7 4 mj i n 等( y ij e ta l ，2 0 0 5 ) 试图寻找对e g f r e r b b - 2 信号传导的双重抑制 剂，首次合成研究了5 取代4 羟基8 硝基喹唑啭类系列化合物，其中化合物2 5 1 6 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 具有抑制e g f r 和e r b b 2 双重的活性。并且抑制率最高，其i c 5 0 值分别为 o 0 1 t t m o f l ，1 3t a n o l l 。为今后的双重抑制剂的研究提供了一个有前途的平台。 r a c h i d 等( r a c h i dz ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 合成了系列新型喹唑啉类化合物，其中 化合物2 6 抑制e g f r 酶活性的i c s o 值为0 0 1 0g m o l l 。 c i z o j u o z a s 等( j u o z a sd ，e ta l ，2 0 0 6 ) 合成了系列含有亚硝基脲结构的氨基喹唑啉 和酰脲基喹唑啉，通过对它们的比较，以期找到影响e g f r 抑制剂活性的结构参 数。发现当亚硝基脲或酰脲集团与喹唑啉平面之间的扭转角越小，活性越高。其 中稳定的亚硝基脲喹唑啉化合物2 7 ，其抑制e g f r 酶活性的i c s o 值为2 0 4n m o l l ， 被认为是有进一步研究价值的结构。 1 1 2 含吡啶并嘧啶结构的化合物 r e w c a s t l e 等( r e w c a s t l egw ，e ta l 。1 9 9 6 ) 为改善抗癌药物水溶性较差的 缺点，制备了含有碱性吗啉基丙基和二甲基丁基的衍生物2 7 ，2 8 和2 9 。2 7 抑制 分离酶和e g f 受体自身磷酸化的i c s o 值分别为7 4t a n o f l 和3 8t t m o l l ，2 8 的 i c 5 0 值分别为1 9t t m o l l 和8 it t m o f l 。2 7 和2 8 在裸鼠实验时能阻滞人体a 4 3 1 1 7 贵州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 细胞异种移植肿瘤的生长。毗啶并嘧啶衍生物”抑制e g f r 自身的磷酸化的i c s o 值为1 3r a n