HPLC法分析溶剂和光照对白藜芦醇反式向顺式转化的影响.pdf

中国酿造 2010 年 第 7 期 总第 220 期 j. 中国卫生检验杂志， 2005， 15 （6 ） ： 707-708. 3 史玉坤. 甜蜜素衍生产物的色谱 / 质谱确定j. 中国卫生检验杂志， 2006， 16 （5 ） ： 617-618. 4 邵铁锋， 李雪岷， 陈勤伟， 等.高效液相色谱法测定酒中甜蜜素j. 中国 酿造， 2004 （12 ） ： 31-32. 5 gb/t 5009.97 - 2006. 食品中环己基氨基璜酸钠的测定s. 6 顾建华. 毛细管气相色谱法测定黄酒中甜蜜素含量j. 中国卫生检验 杂志， 2007， 17 （5 ） ： 940-941. 7 张燕， 赵永福， 许红. 葡萄酒中环己基氨基磺酸钠(甜蜜素)的气相 色谱法测定j. 中外葡萄与葡萄酒， 2003 （3 ） ： 54-55. 白藜芦醇 （resveratrol 简称res. ） 化学名称为3， 4， 5-三 羟基二苯乙烯， 分子式为c14h12o3， 分子量为228.25， 是一 类主要存在于葡萄、 虎杖、 藜芦等植物中的多酚类化合物， 现已证实具有抗菌、 抗肿瘤、 抗炎、 抗过敏、 降血脂、 抗氧化 等调节免疫、 化学预防及雌激素样作用等多种药理活性， 是一种重要的植物抗毒素1。广泛地应用于医药、 保健品、 食品、 化妆品等领域2。 天然白藜芦醇存在的形式有顺式和反式， 还可以与 糖形成糖苷， 在肠道中糖苷酶的作用下释放出 res.。用于 含量分析和功能实验的反式白藜芦醇标准品在市场上有 大量供应， 而顺式白藜芦醇通常是通过日光照射3-4与紫外 照射 （波长254nm5或360nm6） 后经分离获得。julia等7 研究了紫外波长大小、 液面与紫外灯间距、 溶剂种类和溶 液表面积对反式白藜芦醇向顺式异构体转化的影响， 但 是没有考虑日光和详细的溶剂对转化过程的影响。本实 验采用相同间距和表面积，考察8h内甲醇、 12.0%vol乙醇 和乙醇3种稀释溶剂， 以及日光、 254nm紫外光和365nm紫 外光3种光照条件下反式白藜芦醇向顺式异构体转化情况， 以期为顺、 反式白藜芦醇的含量分析和进一步的功能实验 提供基础和依据。 1 材料与方法 1.1 材料 高效液相色谱仪 （waters2487、 waters2475、 waters600 controller和waters 600 pump型 ） ： 美国waters公司； 紫外分 析仪 （ 254和365型 ） ： 上海科艺光学仪器厂； 分析天平 （ab204-n， shanghai mettler-toledo group ） ； 甲醇 （色谱纯） 、 乙醇 （分 析纯 ） 、 蒸馏水、 反式白藜芦醇 （纯度99% ） ： 陕西森弗； 色 谱用水为超纯水。 1.2 方法 1.2.1 样品储备液的制备 精密称取50.0mg的反式白藜芦醇， 甲醇溶解并定容至 100ml棕色容量瓶， 置于冷冻室中， 备用。 1.2.2 白藜芦醇反式向顺式转化过程的实验设计 溶剂的影响： 3只100ml容量瓶中， 各吸取20ml样品 储备液， 再分别用12.0%vol乙醇、 甲醇、 乙醇定容， 得到3份 不同溶剂， 浓度均为100g/ml的反式白藜芦醇应用液。 分 别转入3只200ml的烧杯中于波长365nm紫外灯下照射 15min、 30min、 1h、 2h、 4h、 8h， 再转入原容量瓶， 分别用 12.0%vol乙醇、 甲醇、 乙醇定容后， 各取100ul样品， 0.45m 滤膜过滤后待测。 光照条件的影响： 3只100ml容量瓶中， 各吸取20ml 样品储备液， 均用12.0%vol乙醇定容， 得到初始溶剂均为 20.0%vol甲醇+9.6%vol乙醇+70.4%水， 浓度为100g/ml 的反式白藜芦醇应用液， 分别于254nm紫外光、 365nm紫外 hplc法分析溶剂和光照对白藜芦醇反式向顺式转化的影响 周丽1， 邵继红1， 王峰1， 王素芳2， 李李2 （1.徐州医学院 公共卫生学院， 江苏 徐州 221002； 2.安徽医科大学 公共卫生学院， 安徽 合肥 230032 ） 摘要： 以反式白藜芦醇为材料， 通过不同溶剂和光照条件下反式白藜芦醇向顺式异构体转化过程进行试验， 采用hplc法分析白藜 芦醇由反式向顺式转化情况， 结果表明， 溶剂种类和光照条件对顺式白藜芦醇转化率和纯度均有十分重要的影响。 关键词： 溶剂； 光照； 白藜芦醇； 转化 中图分类号： o657.7文献标识码： a文章编号： 0254-5071 （2010 ） 07-0173-03 effects of solvents and lights on transformation of trans-resveratrol to cis-isomer by hplc analysis zhou li1, shao jihong1, wang feng1, wang sufang2, li li2 (1. school of public health, xuzhou medical college, xuzhou 221002, china; 2. school of public health, anhui medical university, hefei 230032, china) abstract:using trans-resveratrol as raw material, effects of solvents and lights on resveratrol transformation from trans- to cis- were studied with hplc analysis. the results showed thattyoes of solvents and lightening conditions had important effects on conversion and purity of cis-resveratrol. key words:solvent; lights; resveratrol; transformation 收稿日期： 2010-02-26 作者简介： 周丽 （1977- ） ， 女， 安徽枞阳人， 硕士， 主要从事食品科学教学与科究。 分析与检测173 2010 no7 serial no220 china brewing a 转化前反式白藜芦醇色谱图 b 254nm紫外光下转化2h色谱图 光和日光下照射15min、 30min、 1h、 2h、 4h、 8h后， 再转入原 容量瓶， 均用12.0%vol乙醇定容后， 以下操作同上。 1.2.3 白藜芦醇含量测定条件 高效液相色谱仪为waters 2487、 waters 2475、 waters 600 controller和waters 600 pump型号； 色谱柱是zorbax eclipse xdb-c18柱 （150mm4.6mm， 5um ） ； 柱温30； 流动 相为55%甲醇溶液和45%纯水的二元梯度洗脱；流速为 1.0ml/min； 反式白藜芦醇定量为306nm， 顺式白藜芦醇 定量为288nm； 进样量为10l。 2 结果与讨论 2.1 分析方法的线性和检出限 在设定的色谱条件下， 分别取10l系列未照射反式 白藜芦醇标准溶液及于365nm紫外光下照射15min的顺、 反式白藜芦醇混合标准溶液， 进行分析， 以顺、 反式白藜芦 醇的质量浓度为横坐标， 以其检出峰面积为纵坐标， 进行 线性回归， 回归方程分别为： y顺式白藜芦醇=3954.9x+22392， r=0.9992； y反式白藜芦醇=36955x+42878， r= 0.9996。 当s/n=3时， 对白藜芦醇顺、 反异构体的最低检测限进行计算， 得出其 最低检出量依次为0.22ng、 0.31ng。 2.2 溶剂对顺式白藜芦醇转化率的影响 图1显示， 254nm紫外光照射条件下， 当稀释溶剂为纯 乙醇时， 1#和2#峰均为肩峰， 可能分别由2个结构类似的物 质组成， 365nm紫外光和日光照射后检测结果与此类似， 说明纯乙醇不适合作为白藜芦醇由反式向顺式转化的溶 剂； 而且， 实验中发现若反式白藜芦醇纯乙醇溶液暗光放 置12h后， hplc分析会出现同样的肩峰， 由此得出白藜芦 醇乙醇溶液稳定性较差。 从图2可以看出， 稀释溶剂为甲醇和12.0%vol乙醇水 溶液时，反应转化率均于照射2h时达到最大。经2样本比 较的秩和检验，p0.05， 尚不能认为2种溶剂条件下照射 2h后转化率有差别。 2.3 光照对顺式白藜芦醇转化率和纯度的影响 图3显示， 照射1h内， 3种光源条件下， 转化率均大幅度 上升； 1h2h时， 转化率增速减慢， 2h后转化率几乎保持不 变， 这可能是由于顺式白藜芦醇的产生与降解接近平衡。 照射2h时， 365nm紫外光照射条件下白藜芦醇转化率为 92.5%， 分别比日光和254nm照射条件下高17.4%和29.3%。 图3光照对白藜芦醇转化率的影响 figure 3. effects of lights on conversion rate of resveratrol 图2溶剂对白藜芦醇转化率的影响 figure 2. effects of solvents on conversion rate of resveratrol analysis and examination 图1 乙醇溶剂中254nm紫外光下转化2h色谱图 figure 1. chromatograms of resveratrol in ethanol under 254 nm for 2 h 174 中国酿造 2010 年 第 7 期 总第 220 期 图4c显示， 365nm紫外光照射条件下， 反式白藜芦醇 转化产物较单一， 即顺式白藜芦醇纯度较高； 日光照射 0.5h时， 溶剂由无色转为淡黄色， 且随着时间的延长， 颜色 逐渐加深， hplc分析显示 （见图4d ） ， 这些淡黄色物质可 能是极性稍强的白藜芦醇降解产物， 基于此观察， 得出顺 式白藜芦醇不适合由日光照射而得； 254nm紫外光照射条 件下， 8h内肉眼观察， 溶液无色， 但经hplc分析结果发现， 同样有极性较强的物质产生， 见图3b。 3 结论 溶剂种类和光照条件对顺式白藜芦醇转化率和纯度 均有十分重要的影响， 乙醇不适合作为反式白藜芦醇向 顺式异构体转化的稀释溶剂， 甲醇和12.0%vol乙醇作为溶 剂， 转化结果差异无统计学意义； 而从转化率和转化产物 纯度两方面来看， 365nm是白藜芦醇由反式向顺式转化的 最佳光源。因此， 在检测条件一定时， 用hplc法可检测白 藜芦醇结构转化中转化率和转化产物的变化， 根据反应 转化率和顺式白藜芦醇的纯度， 从而可以确定最佳的反 应溶剂和光照条件。 参考文献： 1 李环宇， 王君高， 苏峰， 等. 葡萄酒中白藜芦醇与人体健康j. 中国 酿造， 2009 （7 ） ： 20-22. 2 孙娜， 康彦芳. 白藜芦醇的研究进展. 天津化工， 2009， 23 （5 ） 5-7. 3 camont l, cottart ch, rhayem y, et al. simple spectrophoto- metric assessment of the trans-/cis-resveratrol ratio in aqueous solutions j. anal chim acta, 2009, 634(1):121-128. 4 chen x, he h, wang g, et al. stereospecific determination of cis- and trans-resveratrol in rat plasma by hplc: application to pharmacokinetic studiesj. biomed chromatogr, 2007, 21(3):257-65. 5 leiro j, alvarez e, arranz ja, et al. effects of cis-resveratrol on inflammatory murine macrophages: antioxidant activity and down-regu- lation of inflammatory genesj. j leukocyte biol, 2004, 75:1156-1165. 6 martinez-ortega m v, carcia-parrilla m c, troncoso a m. resveratrol content in wines and musts from the south of spain j. nahrung, 2000, 44: 253-256. 7 l魷pez-hern譧ndez j, paseiro-losada p, sanches-silva a t, et al. study of changes of trans-resveratrol caused by ultraviolet light and determination of trans- and cis- resveratrol in spanish white