含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究.pdf

硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究摘要聚乙烯亚胺( p e i ) 是目前公认的具有较高转染效率的阳离子聚合物之一。其转染效率与相对分子量大小相关，一般分子量越大，转染效率越高，但细胞毒性也越大；反之则细胞毒性较小，同时转染效率不高。人们一直致力于找到一种转染效率高，同时细胞毒性低的转染载体。研究表明聚合物的母链上带有羟基不仅可以改善其水溶性，提高转染效率，并且可以提高可降解性，从而降低细胞毒性。本文采用不同分子量的聚乙烯亚胺( p e i ) 与多种含有二个或二个以上的环氧基交联剂反应，合成了7 2 种含羟基的聚乙烯亚胺衍生物。对这一系列p e i 衍生物进行水溶性评价，并以b 1 6 f 1 0 细胞、a 5 4 9 细胞为受体，增强型绿色荧光蛋白质粒( e g f p ) 为报告基因进行了细胞转染性能的实验。筛选出了几种转染效果良好的含羟基的阳离子聚合物。其中c 1 4 转染b 1 6 f 1 0 细胞的效率比b p e l 2 5 k d a 的转染效率高出5 5 倍，同时细胞毒性明显低于b p e l 2 5 k d a 。粒度测试结果表明，c 1 4 d n a 复合物粒径为1 3 9 1 9 7 n m 。以上结果表明，c 1 4 可以作为一种高效低毒的转染试剂应用于体外转染试验中。关键词：基因传递，羟基化，交联聚乙烯亚胺，细胞毒性 a b s t r a c t硕士论文a b s t r a c tp o l y e t h y l e n e i m i n e ( p e i ) i sc o n s i d e r e dt ob eo n eo ft h em o s te f f e c t i v ec a t i o n i cp o l y m e r sa sg e n et r a n s f e c t i o nv e c t o r s i t st r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c ya n dc y t o t o x i c i t yd e p e n d so nt h em o l e c u l a rw e i g h t g e n e r a l l y , t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c ya n dc y t o t o x i c i t yi n c r e a s e dw i t hh i g h e rr e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h t p e o p l eh a v eb e e nc o m m i t t e dt of i n d i n gag e n ed e l i v e r yc a r r i e rw i t hh i 2 9 he f f i c i e n c ya n dl o wc y t o t o x i c i t y s t u d i e sh a v es h o w nt h a tt h ep a r e n td l 血o ft h ep o l y m e rw i t hh y d r o x y lc a nn o to n l yi m p r o v ei t sw a t e r - s o l u b i l i t y , d e g r a d a t i o na n dt h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y , b u ta l s od e c r e a s e dt h ec y t o t o x i c i t y i nt h i sp a p e r , 7 2c a t i o n i cp o l y m e r sw e r ep r e p a r e db yc r o s s 1 i n k i n gd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t so fp e lw i t hav a r i e t yo ft w oo rm o r ee p o x y - b a s e dc r o s s 1 i n k e r s t h ep o l y m e r s 诵mg o o dw a t e r - s o l u b i l i t yw e r ea s s e s s e dw h e nb16 f10c e l l s ，a 5 4 9c e l l sw e r eu s e da sr e c e p t o rc e l l sa n de n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) w a su s e d 懿r e p o r tg e n e s e v e r a lh y d r o x y l a t e dc a t i o n i cp o l y m e r sw i t hh i g ht r a n s f e re f f i c a c yw e r ef i l t e r e do u t t h ec 1 4 d n ac o m p l e x e se x h i b i t e d5 5 一f o l dg e n et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c ya n dr e d u c ec y t o t o x i c i t yi nc u l t u r e de e l l l i n e s ，c o m p a r e dt ot h en a t i v eb p e l 2 5 k d a a sc a nb es e e ni np a r t i c l es i z ea n a l y s i s ，p a r t i c l es i z eo fc14 d n ac o m p l e x e sw a sf o u n dt ob ei nt h er a n g eo f1 3 9 - 1 9 7 n m i ns u m m a r y ，t h er e s u l t si n d i c a t et h a tc 1 4i san e we f f i c i e n tr e a g e n tf o rg e n ed e l i v e r yi nv i t r o k e yw o r d ：g e n ed e l i v e r y ，h y d r o x y l a t i o n ，c r o s s - l i n k e dp o l y e t h y l e n i m i n e ，c y t o t o x i c i t yi i 硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究目录摘要喜。ia b s t r a c t i i1l 者论11 1 基因治疗概述。11 2 基因治疗的载体：21 3 阳离子聚合物载体。21 3 1 聚赖氨酸( p l l ) 31 3 2 聚d 氨酯。31 3 3 壳聚糖31 3 4 树状聚合物41 3 5 聚乙烯亚胺( p e i ) 51 4 可降解聚乙烯亚胺( p e i ) 的分类61 4 1 可降解的交联p e i 61 4 2 可降解的接枝p e i 81 5 本文的研究思路92 含羟基的交联p e i 聚合物的合成及表征。1 22 1 实验试剂及仪器1 22 1 1 实验试剂。122 1 2 实验仪器1 22 2 实验内容1 32 2 1 含羟基的交联p e i 聚合物的合成1 32 2 2 含羟基的交联p e i 聚合物的水溶性和基因转染性能评价1 62 2 3 含羟基的交联p e i 聚合物结构的表征。1 92 3 结果与讨论1 92 3 1 含羟基的交联p e i 聚合物的合成1 92 3 2 含羟基的交联p e i 聚合物的水溶性评价1 92 3 3 含羟基的交联p e i 聚合物结构的表征。2 02 4 本章小结2 23 含羟基的交联p e i 聚合物作为基因转染载体的性能研究2 33 1 实验材料及仪器2 33 1 1 实验材料。2 33 1 2 实验仪器2 41 1 1 目录 硕士论文 3 2 实验方法2 5 3 2 1l b 培养基的配制。2 5 3 2 2p e g f p 质粒转化e c o l i 2 5 3 2 3 质粒d n a 的扩增2 5 3 2 4 含羟基的交联p e i 聚合物d n a 复合物的制备2 6 3 2 5 胶体电泳实验2 7 3 2 6 体外转染实验2 7 3 2 7 转染效果的表征2 7 3 2 8 毒性实验2 7 3 2 9 复合物粒度分析实验2 8 3 3 结果与讨论2 8 3 3 1 胶体电泳实验2 8 3 3 2 体外转染实验2 9 3 3 3 毒性实验一3 3 3 3 4 复合物粒度分析实验3 5 3 3 5 含羟基的交联p e i 聚合物的结构与性能分析3 5 3 4 本章小结3 6 4 结论3 7 致谢3 8 参考文献3 9 i v 硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究1 绪论现代医学治疗的要求是高特异性和低副作用，生物药剂如蛋白和核酸可以满足这些要求，从而成为了新一代的药物。重组蛋白已用于临床治疗，但效果欠佳，因为其生物利用率低，在体内很快会被清除，毒性大且生产成本高【l j 。最近，基因疗法在介入治疗领域应用广泛，可以治疗多种疾病，包括传染病、遗传病、癌症等，它克服了蛋白治疗的缺点，成为一种新的治疗方法。所谓基因治疗就是核酸药物进入细胞，通过抑制或者调节特定基因的表达来调节细胞功能，从而达到预防、治疗甚至治愈多种疾病的目的【2 】。基因治疗是从根源上治疗疾病，这将会引发医学史上的一次革命，因此研究基因治疗的意义非常重大。1 1 基因治疗概述目前，基因治疗相关领域的研究已经取得了重大进展，作为一种全新的疾病治疗方法，基因治疗无疑加快了人类疾病治疗史的发展进程。基因治疗的过程包括以下几个步骤【3 j ：1 、d n a 的复合：基因运送载体与表面带负电荷的d n a 发生静电作用，将d n a进行压缩和包被，形成直径为纳米级的载体d n a 复合物；2 、细胞摄入：复合物吸附于细胞的表面，然后通过细胞内吞等作用进入细胞，形成内涵体；3 、内涵体的逃逸：内涵体在细胞内胀破，里面的载体d n a 复合物从中逃逸；4 、核定位：复合物在细胞质中迁移，被运送至细胞核附近；5 、d n a 的释放：复合物发生形变、破裂，将d n a释放出来；6 、核运输：d n a 通过核孔进入到细胞核中，载体d n a 复合物在细胞核内分离、降解，质粒d n a 进行转录和表达。上面过程中，以阳离子聚合物作为基因运送载体为例图示如下：婴嗍十警撼t -o n n ,阳高于聚台物+ ：! 。图1 1 基因治疗的过程示意图 1 绪论硕士论文由于许多基因的功能及r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 片段的制备及其作用机理等基础问题都已经探明，特定功能基因的获得，各种操作技术也业已成熟，因此核酸治疗学作为一种未来的理想中的治疗方法，最终还有一些具体的技术问题有待解决。这其中最重要的技术瓶颈就是高效、低毒的d n a r n a 运送载体的开发【4 1 。在这样的认识下，近年来，发达国家都加强了基因运送载体的研发工作，各种新的基因运送方法及运送载体层出不穷。1 2 基因治疗的载体基因治疗的优势日益明显，但由于缺少安全有效的传递系统，目前在临床治疗上仍受到一定的限制。大多数的核酸药物易被核酸酶分解，因此我们需要找到一种特殊的载体，可以成功地将核酸药物运至大量细胞中去而避免被酶解。用于基因治疗的运送载体可以分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。早期的基因传递研究主要集中在病毒载体上【5 1 ，病毒载体的体内外转染效率均很高，已应用于临床治疗，但它存在很多缺点，如高免疫原性、致病性、操作复杂、成本昂贵等 6 1 。非病毒基因传递系统可以克服以上缺点，较高的安全性使之逐渐取代了病毒载体。非病毒载体的优点是分子结构可控、尺寸大小多样、低免疫原性、稳定性好、具有细胞靶向性、成本低廉，易于规模生产等。基于以上各种优点，非病毒载体得到越来越多的关注。但非病毒载体的转染效率低，细胞毒性大【7 】。大多数非病毒载体是人工合成的材料，主要分为三大类：阳离子脂质体、树枝型聚合物和阳离子聚合物，其中研究较多的是阳离子聚合物。1 3 阳离子聚合物载体d n a 为双螺旋或开环结构，空间疏松，体积较大，无法直接进入细胞，阳离子聚合物可以通过静电作用，将表面带负电荷的d n a 分子压缩成环状的纳米级颗粒，起到保护d n a 不被酶降解的作用，同时紧密结合的微粒有利于细胞通过内吞、吞噬、胞饮作用进入细胞，增强了系统的穿透能力，有利于质粒d n a 透过细胞膜进行转染，并且可以中和d n a 上一部分负电荷，得到稳定的复合物。阳离子聚合物易于购买且价格不高，可以对其进行适当修饰来改善理化性质和生理特性，比如提高生物降解性和细胞靶向能力。阳离子聚合物载体具有一定的细胞毒性，因为其表面带有的正电荷会与细胞膜发生相互作用，引起细胞膜的不稳定，造成细胞膜破裂，使细胞凝聚或死亡。此外，影响细胞毒性的因素还有相对分子量，载体的相对分子量越高，则细胞毒性也越大。研究较多的阳离子聚合物载体有聚赖氨酸( p l l ) 、聚乙烯亚胺( p e i ) 、聚b 氨酯、壳聚糖、树状聚合物等 8 q 2 】。 硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究1 3 i 聚赖氨酸( p l l )聚赖氨酸( p l l ) 很早就被用作基因传递的运载体【”1 。p l l 是线性的多肽结构( 图1 2 ) ，可以生物降解，且降解后可被吸收，这对于体内转染是非常重要的。但是p l l 存在很多的不足：具有一定的细胞毒性；含有肽骨架，因此具有免疫原性；转染的效率较低；p l l d n a 复合物与细胞膜的非特异性连接，限制了其在特定细胞系的应用；赖氨酸- 氨基基团的p k a 值约为l o ，在生理p h 下所有的胺都是质子化的，带正电荷的p l l可以结合带负电荷的d n a 并将它导入细胞，但由于p l l 氨基基团的质子化作用，p l l - d n a 复合物不能成为质子海绵体促进裂解释放，内涵体不能快速地逃逸【1 4 1 。向p l l骨架上连接组氨酸可以提高p l l 的转染效率，组氨酸可以促进内涵体的逃逸【1 5 】。壳聚糖或者脂质体类，如软脂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸与p l l 发生共轭反应，也可以提高p l l的转染效率 1 6 , 1 7 】，但其中的具体机制并不明确。图1 2 聚赖氨酸( p l l ) 结构式1 3 2 聚p - 氨酯最近，r o b e r tl a n g c r ，d a n i e la n d e r s o n 及其同事合成并评价了聚p 一氨酯的转染性能。聚p - 氨酯最大的优点就是能在细胞内快速地降解，且对细胞无有害影响( 图1 3 ) 。聚1 3 氨酯作基因载体的转染效率高低取决于其分子量、末端基团以及聚合物和d n a 的比例。其中转染效果最好的是以二胺作为末端基团的【l s l 。图1 3 聚p - 氨酯结构式1 3 3 壳聚糖壳聚糖因为生物相容性好、正电荷密度高( 图1 4 ) ，已成为非病毒载体研究领域的热点1 1 1 。壳聚糖载体转染效率的影响因素有很多：分子量、盐的形式、去乙酰化的程度、培养基的p h 等【2 】。壳聚糖的水溶性较差，释放出基因的能力弱，因此它的转染效率低心n i r 1 绪论硕士论文于其他的阳离子聚合物。为了克服以上两个问题，近年来人们对壳聚糖做了很多的修饰，合成了多种壳聚糖衍生物。壳聚糖的结构修饰可分为亲水性修饰和疏水性修饰【2 l 。加入带负电荷的试剂如透明质酸( h a ) 聚丫谷氨酸修饰壳聚糖，可以显著提高转染效率【1 9 】。h a 的电荷密度较低，聚y 谷氨酸壳聚糖d n a 复合物在细胞内化后可以分解成很多小的颗粒，这有助于d n a 的逃逸。加入的试剂类型和数量会影响细胞摄入、稳定、复合物粒径、压缩和分离d n a 的能力，从而影响转染的效率【l 川。o图1 4 壳聚糖结构式1 3 4 树状聚合物树状聚合物是一类具有高度分支化三维对称结构、低分散度的大分子。它具有大量的官能团，表面分布大量的伯胺更容易与质粒d n a 形成复合物，获得更高的转染效率。聚酰胺( p a m a m ) ( 图1 5 ) 和聚丙烯亚胺( p p i ) ( 图1 6 ) 的转染效率较高，已用于体内外转染实验【1 2 】，缺点是毒性较大。树状聚合物的毒性主要受以下因素的影响：化学结构、表面电荷和剂量。用聚乙二醇( p e g ) 做表面修饰可以改善其生物相容性【2 0 1 。4图1 5 聚酰胺结构式一儿 硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究图1 6 聚丙烯亚胺结构式1 3 5 聚乙烯亚胺( p e i )迄今为止应用最多的阳离子聚合物载体就是聚乙烯亚胺( p e i ) 。p e l 分子上每3 个原子中就有1 个胺基基团，这使其具有较高的正电荷密度。由p h 与质子作用之间的关系可以知道：在生理条件下，p e i 结构中的部分胺基基团会发生质子化反应，造成溶酶体发生肿胀破裂，即“质子海绵”效应，使p e i d n a 复合物可以释放至细胞质，很大程度上降低了d n a 在吞噬泡内富集和降解的作用，因而可以提高转染效率 2 1 1 。p e i 可分为线型p e i ( 1 p e i ) ( 图1 7 ) 和分枝状p e i ( b p e i ) ( 图1 8 ) ，它们均可进行体内、体外转染。p e l 分子结构中含有大量的伯胺、仲胺和叔胺基，具有很高的正电荷密度。带有正电荷的p e i 可以将带负电荷的质粒d n a 进行压缩和包被，二者结合，形成紧密的纳米级环状复合物。基因转染时，聚合物的用量多于质粒d n a ，因此形成的复合物表面带有正电荷，这很容易与带负电荷的细胞膜相互吸引，并被吞噬进入细胞形成内涵体。b e h r 的团队是最早发现p e i 具有转染效果的【2 2 j 。p e i 的转染效率受相对分子量影响很大。1 p e i 载体的最佳分子量是5 k d a 到2 5 k d a l 2 3 1 ，分子量高于2 5 k d a 的1 p e i的转染效率不再升高，但细胞毒性明显增大；分子量低于5 k d a 的1 p e i ，几乎无细胞毒性但也无转染效率。b p e l 2 5 k d a 是转染效率较高的阳离子聚合物载体之一，它在内涵体逃逸的过程中对p h 具有一定的缓冲作用，目前已广泛用于基因转染研究中，常被用作基因转染效率评价的参照物【2 2 】。但它的细胞毒性较大，因为不能自发地降解，因此低分子量的p e i ( l m wp e i ) 受到越来越多的关注。人们采用可降解的基团来连接到l m wp e i上，生成可降解的p e i ，从而提高其可降解性。低分子量水溶性好的基团可以促进降解和清除，使交联后的p e i 转染效率明显提高，并且细胞毒性明显降低。 l 绪论硕士论文少v 纣n图1 7 线型p e i ( 1 p e i ) 结构式n i - 1 21 4 n f哗h 2h 2 n 广、气尸h z 、一n j i 一(吵l 、n h ：h ：厂洲之n h 2图1 8 分枝状p e i ( b p e i ) 结构式1 4 可降解聚乙烯亚胺( p e i ) 的分类目前人们对可降解的聚合物运载体系越来越感兴趣。最早报道可降解p e i 作为基因载体的是t a r c h a ，他用p 氨基丙酰胺和l m wp e i 反应【2 4 】。b r e u n i g 等人向p e i 引入了二硫键，并且研究了细胞摄入水平与可降解p e i 的酯键的关系。结果显示，随着聚合物支链的增多，细胞摄入的水平逐渐提高，这表明高支链密度有助于基因的传递【2 5 1 。可降解的聚合物体系比较容易从细胞或体内清除，因此细胞毒性较小，并且可以促进d n a 的传递和表达。根据分子结构和合成方法的不同，我们把可降解的聚乙烯亚胺分为两大类：交联p e i 和接枝p e i 。1 4 1 可降解的交联p e i可降解的交联p e i 最早由g o s s e l i n 提出，他用二硫琥珀酰亚胺丙酸酯( d s p ) 、二叔丁基过氧化物( d t b p ) 交联l m wp e i t 2 6 1 。得到的交联p e i 表现出高的转染效率和较低的细胞毒性，因为交联上去的二硫键可以被细胞内的谷胱甘肽清除。聚合物的转染效率与交联剂种类及n p 值有关【2 6 j 。f o r r e s t 等人用1 ，3 丁二醇( 或1 ，6 己二醇) 丙烯酸酯交联p e l 8 0 0 d a l 2 7 1 ，其中丙烯酸酯基团与伯胺、仲胺反应，生成了很多支链，最终生成的聚合物的分子量是1 4k d a 。用1 ，3 丁二醇交联得到的聚合物的半衰期是4 小时，在生理条件下酯键可迅速水解得到二元醇和氨基酸【2 7 】。生成的可降解p e i 的大小、结构、压缩d n a 的能力均与p e l 2 5 k d a相当，但是转染效率要较之高出2 1 6 倍，同时细胞毒性明显降低。t h o m a s 及其团队用双琥珀酰亚胺辛二酸酯( d s s ) 与乙二醇双琥珀酰亚胺盐( e g s )6 硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究交联l m wp e i ，并进行了体内外转染实验【2 引。体外转染实验表明，该交联p e i 的转染效率高出l m wp e i5 5 0 倍，也高于b p e l 2 5 k d a ，同时细胞毒性明显低于二者。体内转染实验中，该交联p e i 的效率比未修饰的p e i 提高了1 7 8 0 倍，比b p e l 2 5 k d a 提高了2 倍，细胞毒性却没有增力i i 2 引。k l o e c k n e r 等人采用二叔丁基过氧化物( d t b p ) ，磷酸氢二钠( d s p ) ，己二醇二丙烯酸酯作交联剂合成了数量巨大的可降解阳离子聚合物库1 2 9 1 。其中，p e i s 0 0 d a 和乙二醇二丙烯酸酯合成的聚合物，转染效率高于p e l 2 2 k d a ，因为酯键的水解使其具有良好的生物相容性。k l o e c k n e r 还发现反应的温度对产物的可降解性能有一定的影响。高温( 6 0 ) 条件比低温( 2 0 ) 条件下产生的氨酯值高，从而可降解性较低【3 0 】。可降解的b p e i 的氨基密度比1 p e i 高，压缩d n a 的能力更强，i p e i 的氨基密度小，压缩d n a的能力较弱。因此人们多合成可降解的b p e i 。1 p e i 的半衰期短，很多裂口可以迅速地断裂，减小了链长，降低了分子量，b p e l 支链上的酯基亲水能力差，所以降解得很慢【3 n 。p e t e r s e n 用低聚l 乳琥珀酸作交联剂交联p e l l 2 0 0 d a ，合成了可降解的b p e i 。其运载的基因表达的能力是p e l 8 k d a 的1 0 倍，而几乎没有细胞毒性【3 2 】。a i m 及其搭档用含有双官能团的聚乙二醇( p e g ) 去交联不同分子量的p e i( 6 0 0 ，1 2 0 0 ，1 8 0 0 d a ) 合成了带有酯键的聚合物产物【3 引。p e g 上带有可降解的酯键，因此交联的p e i 转染2 9 3 t 细胞的能力比p e l l 8 0 0 d a 提高了3 倍之多，细胞存活率为8 0 ，但是转染效率略低于p e l 2 5 k d a1 3 引。k i m 在温和的反应条件下用不耐酸的亚胺交联合成了可降解的b p e i t 3 引。这种聚合物在酸性环境下会很快分解，半衰期只有2 5 小时，转染效果与p e l 2 5 k d a 相当，细胞毒性比p e l 2 5 k d a 小。c h o 和他的同事们最近通过迈克尔加成反应，用多种交联剂交联l m wp e i ，合成了一系列可降解的b p e i 。聚羟亚丙烯酸酯( 2 5 0 0 d a ) 和p e i1 8 0 0 d a 通过迈克尔加成反应生成可降解的b p e l l 3 5 】，该物质压缩d n a 的能力很强，与d n a 形成的复合体在生理条件下的粒径低于1 5 0 n m 。该物质对人肺癌细胞( a 5 4 9 ) ，人胚肾细胞( 2 9 3 t ) 和人肝癌细胞( h e p g 2 ) 的转染能力均高于p e l 2 5 k d a ，且细胞毒性较低。在另一项研究中，c h o 用聚己内酯( p c l ) 作为交联剂与b p e i ( 6 0 0 ，1 2 0 0 ，1 8 0 0 d a ) 反应合成可降解的b p e i 。该聚合物在生理条件下的半衰期是4 5 5 天。该聚合物压缩d n a 的能力较强，而且形成的复合物很稳定，形成的复合物的粒径低于2 0 0 n m ，细胞毒性很低。基因表达效果最好的是p c l p e i 1 2 ( m w l 2 0 0d a ) 复合物，体外转染的效率比p e l 2 5 k d a 高出1 5 2 5倍。而且该复合物以喷雾形式成功地通过肺部进入了细胞中【3 6 】。该组还用甘油甲基丙烯酸二酯和p e i l 2 0 0 d a 合成了一种新型可降解的b p e i 。该物质可将d n a 压缩至1 5 0 n m以下的颗粒，在生理p h 下的z e t a 电位为3 0 5 5 m v 。超支化的结构使其降解地很慢，半衰期为9 1 0 天。丙三醇的水溶性和p e i 的“质子海绵”效应的协同作用使该物质对人宫 l 绪论硕士论文颈癌细胞( h e l a ) 、h e p g 2 、2 9 3 t 细胞的毒性明显降低，转染效率也高于b p e l 2 5 k d a 。此外，该物质也可用于体内转染。s u n 最近用胱胺双丙烯酰胺作交联剂交联了p e l 8 0 0 d a ，合成了带二硫键的p e i t 37 1 。p e n g 等人用硫化丙烯作交联剂与p e l 8 0 0 d a 发生开环反应，生成带二硫键的p e i t 3 8 】。二硫键易水解，所以生成的交联p e i 的毒性比p e l 2 5 k d a 小很多，而转染效率却高很多。1 4 2 可降解的接枝p e i为了降低细胞毒性，很多研究人员用线型或者超支化的l m wp e i 合成接枝共聚物。常用的接枝剂有非离子亲水性环糊精( c d ) ，可降解聚合物如聚己酸内酯( p c l ) 、壳聚糖、葡聚糖和聚丙烯亚胺树状分子等。最早报道用环糊精( c d ) 接枝高分子量p e i ( 瑚wp e i ) 作为基因载体的是d a v i s及其同事眇j 。确切地讲，c d p e i 是一种被修饰的复合体，但它在生理条件下不能降解。t a n g 用1 3 - c d 碳酸酯与p e l 6 0 0 d a 发生缩聚反应，得到可降解的聚合物。将该聚合物置于3 7 的p b s 缓冲溶液( 1 4 0m mn a c l ，2 7m mk c l ，1 0m mn a e h p 0 4 ，1 8m mk h 2 p 0 4 ，p h7 4 ) 中，一个月内其分子量从6 1 k d a 降至3 0 k d a ，这是因为聚合物中的氨基甲酸酯胺甲萘可以水解1 4 0 1 ，但它在t r i s 缓冲溶液( 5 0 m mt r i s h c l ，1 5 0 m m n a c i ，p h7 6 ) 中的降解作用并不明显。y a n g 以含a - c d 基团的物质作为接枝剂，与l m wp e i 反应合成了一种阳离子聚合物。这种聚合物的结构很稳定，在生理条件不会发生水解，可以与d n a 复合产生较稳定的复合物。它具有很长的支链，因此转染效果比b p e l 2 5 k d a 好，而细胞毒性较低【4 1 1 。p a r k 用3 种不同分子量的聚z , - - 醇丙烯酸酯( p e g d a ) 与p e l 4 2 3d a 发生了迈克尔加成反应 4 2 1 。该共聚物的分子量是7 1 2 k d a ，在3 7 的p b s 缓冲溶液中可降解。p e g d a的分子量会影响共聚物的转染效率，随着p e g d a 分子量的增加，p e g 的电子屏蔽效应增大，复合体的细胞摄取会受到不利的影响。以h e p g 2 和人成骨肉瘤细胞( m g 6 3 )为受体细胞进行转染性能的评价实验，其转染效果比b p e l 2 5 k d a 高，毒性比b p e l 2 5 k d a低1 4 2 。p a r k 通过静脉注射和喷雾方式对多种器官进行了体内转染评价，结果表明，该物质对肺部、肝脏的转染效果明显，转染效果均高于b p e l 2 5 k d a ，且降解性和毒性均很小。喷雾比静脉注射的效果好，n p 值为2 7 时，对肺进行喷雾的转染效果比静脉注射高出1 5 0 0 倍，而给药量只是静脉注射的十分之一【4 3 】。壳聚糖及其衍生物具有一定的生物相容性、可降解性及低毒性，因此也常被用作非病毒载体，但转染效果并不理想。w o n g 以氮杂环丙烷与壳聚糖( 3 4 0 0 d a ) 水溶液为底物，缩聚产生p e i 壳聚糖 4 4 1 。因为“质子海绵”效应，该聚合物的转染效果和安全性均高于p e l 2 5 k d a 。对小鼠肝脏进行转染实验，结果表明其转染效果高出p e l 2 5 k d a 近5 8 倍。j i a n g 用高碘酸氧化的壳聚糖与p e l l 8 0 0 d a 反应，合成了另一种壳聚糖p e i t 4 5 1 。它可以将d n a 进行适当压缩和包裹，避免其受到核酸酶的破坏。聚合物d n a 复合物的粒径 硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究随着n p 值的增大而减小，粒径均低于2 5 0 n m 。n 壳聚糖p e i 4 6 】或p e g 壳聚糖p e i 具有一定的肝脏靶向性【4 7 j 。其转染肝脏的能力强于b p e l 2 5 k d a 。一般来讲，p e g 可以提高聚合物的水溶性，降低聚集度，减小细胞毒性，削弱血清蛋白的调节作用。在另外一项研究中，l o u 把带环氧基团的p e g 连接到壳聚糖p e i 上，得到的聚合物毒性明显降低【4 8 】。在该聚合物存在的情况下，细胞的存活量比含壳聚糖的更多，基因的表达能力也更强。l u 及其团队用p e l 8 0 0 d a 和n 马来酸壳聚糖通过迈克尔加成反应合成了p e i - n 马来酸壳聚糖【4 9 】，并以2 9 3 t 和h e l a 细胞为受体细胞进行了转染实验，结果表明该聚合物转染能力很强，并且毒性很低。葡聚糖是一种典型的可降解天然多糖，在人体内可以发生酶解，经过改造后可作为基因转染载体。s u n 用修饰后的葡聚糖与p e l 8 0 0 d a 反应合成了葡聚糖p e l l 5 0 】，其细胞毒性低于b p e l 2 5 k d a ，转染效果高于b p e l 2 5 k d a 。s u n 还合成了羧甲基葡聚糖p e i ，该聚合物的内涵体破裂能力很强，因此转染效果高于b p e l 2 5 k d a ，而毒性却小于b p e l 2 5 k d a t ”】。r u s s 合成了p e i 聚丙烯亚胺( p p i ) 树状分子1 2 0 ，该聚合物转染b 1 6 f 1 0细胞的能力与b p e i2 5 k d a 相当。通过综述以上内容，我们发现，交联和接枝p e i 作为转染载体均具有较好的转染效率和较低的细胞毒性，但交联反应较为简单且转染效率更高，因此这种方法更为适用。1 5 本文的研究思路目前已经找到抑制过度表达基因的策略，这对治疗癌症等疾病具有重大的意义【5 2 1 。为实现基因治疗的宏伟目标，当下急需解决的问题是基因传递的效率不高、细胞毒性又较大，这一技术瓶颈问题。研究发现安全高效的阳离子聚合物载体有望改变目前的研究现状，聚乙烯亚胺作为基因运送载体的研究具有非常巨大的潜力。聚乙烯亚胺对于基因传递具有很大的促进作用，合成方法简单经济，很多结构的改变可以通过简单单体的组合来实现。通过阅读大量文献，我们发现，高效的基因转染载体具有如下的结构特征：一个多胺结构的主链含有多个仲胺、叔胺结构及适当数量的羟基，带有羟基的化合物的转染效率明显较高【5 3 1 。2 0 0 8 年d a n i e lga n d e r s o n 及其团队通过双丙烯酸类单体与各种胺进行聚合反应合成了数量巨大的聚合物库【5 4 1 ，结构如图1 9 ，对作为基因转染的潜在载体进行了性能评价，结果发现c 3 2 组合合成的聚合物具有较高的转染效果和较低的细胞毒性，但如果获得好的转染效率，进一步的研究发现必须在所得的聚合物c 3 2 的二个端基进行氨化，使得聚合物有较多的胺基【5 5 1 。这导致后来的一些研究开始聚焦在含羟基的多胺类聚合物体系。9 1 绪论硕士论文b 电霆。i o 炙多c 矿妒幽d 勺u 汁9 础e 勺bf 勺岬。o 吖泌淞如m 翎v 协 叩图1 9d a n i e lqa n d e r s o n 及其团队合成的聚合物结构库l o l i t az a l i a u s k i e n e 及其团队采用含有氨基和羟基的小分子进行反应【5 6 1 ，合成多种主链含有氨基和羟基的结构，如图1 1 0 ，这些结构与聚乙烯亚胺p e i 极为相似。通过对其转染性能进行评价，筛选出了高转染效率、低细胞毒性的聚2 羟基烷基亚胺( p 唧) 。尽管p h p 不具有可降解性，但它的细胞毒性很小，转染效率很高，更重要的是它适用的细胞系范围较宽，是非常好的阳离子转染试剂的候选化合物。 n h 叫o h , # n h o hn h “ n h o hn h 叫p h pp h p ep h p p图1 1 0 含氨基和羟基的小分子聚合产物库据此，我们可以得出如下结论：氨基和羟基结构对于提高细胞转染效率，降低细胞毒性具有一定的作用。我们认为聚合物的母链上带有羟基不仅可以改善水溶性，降低细胞毒性，而且可以提高转染效率。由于b p e l 2 5 k d a 有较高的转染效率，但有较大的细胞毒性。所以我们选用无细胞毒性的l m wb p e i ( 6 0 0 d a ，1 8 0 0 d a ，2 7 0 0 d a ) 与含有二个、三个及四个环氧基的交联剂进行反应，合成了含羟基的交联p e i 聚合物，由于参与反应的单体都是低细胞毒性或无细胞毒性的，且一些结构还含有体内可降解的化学键，这有利于细胞毒性的降低，从而获得的交联产物极有可能是低细胞毒性的物质，而且这些交联产物带有羟基，所以水溶性得到了改善。这种产物的胺基充足，所以不须进行端位氨化也可能有较高的转染效率。此外，研究表明基因转染载体的毒性随着伯胺数量的增多而增大，因此通过减少伯胺的数量可以有效地降低细胞毒性。而环氧基交联剂容易与伯胺反应将其转化成仲胺基或叔胺基，这样在总的n 含量不变的情况下引入了羟基，很有可能既提高了转染效率，又降低了细胞毒性。本研究组的前期研究工作可以证明该研究方案具有合理性。本论文的主要研究内容如下：( 1 ) 采用无细胞毒性的b p e i ( 6 0 0 d a ，1 8 0 0 d a ，2 7 0 0 d a ) 与多种含有二个、三个及四个环1 0p 曼长嚣艾拳蕊p摹u盯雎 硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究氧基的交联剂反应合成了一系列含羟基的交联p e i 聚合物。探索了反应物比例、环氧基团数量，反应时间和反应温度等因素对所得聚合物结构、水溶性及细胞转染效率的影响。( 2 ) 对合成的一系列含羟基的交联p e i 聚合物进行水溶性评价、基因转染实验、细胞毒性测试、复合物粒径测试、胶体电泳实验，从中筛选出理想的基因传递载体。通过讨论，探索聚合物的结构与转染效率及细胞毒性之间的关系，找出最佳的转染实验条件，建立了规范的转染方法。 2 含羟基的阳离子聚合物的合成及表征硕士论文2 含羟基的阳离子聚合物的合成及表征2 1 实验试剂及仪器2 1 1 实验试剂表2 1 实验试剂列表试剂名称生产厂商及规格l ，4 丁二醇二缩水甘油醚乙二醇二缩水甘油醚异氰尿酸三缩水甘油酯n ，n ，n ，n 四环氧丙基- 4 ，4 二氨基二苯甲烷环己烷1 ，2 二羧酸二缩水甘油酯双酚a 二缩水甘油醚b p e l 6 0 0 d ab p e l l8 0 0 d ab p e l 2 7 0 0 d a二氯甲烷碳酸氢钠乙二胺四乙酸二钠氯化钠氯化钾十二水合磷酸氢二钠磷酸二氢钾s i g m a - a l d r i c h ( 9 5 )梯希爱( 上海) 化成工业发展有限公司( 分析纯)东京化成工业株式会社( 9 8 )s i g m a - a l d r i c h ( 9 8 )东京化成工业株式会社( 分析纯)上海创赛试剂( 分析纯)上海创赛试剂( 9 9 )上海晶纯试剂有限公司( 9 9 )上海创赛试剂( 9 9 )南京化学试剂有限公司( 分析纯)上海凌峰化学试剂有限公司( 分析纯)国药集团化学试剂有限公司( 分析纯)南京化学试剂有限公司( 分析纯)上海凌峰化学试剂有限公司( 分析纯)西陇化工股份有限公司( 分析纯)西陇化工股份有限公司( 分析纯)2 1 2 实验仪器表2 2 实验器材列表仪器名称生产厂商电子天平( b s 2 2 4 s 型)集热式恒温加热磁力搅拌器( d f 1 0 i s 型)三用紫外分析仪( z f 7 型)透析袋( m w c o3 , 5 0 0 )真空干燥箱冷冻干燥机( f d v 1 2 0 0 型)赛多利斯科科学仪器( 北京) 有限公司巩义市予华仪器有限责任公司南京大卫仪器设备有限公司上海创赛科学仪器有限公司上海一恒科学仪器有限公司日本东京理化器械株式会社1 2 硕士论文含羟基的阳离子聚合物的合成及其基因传递性能的研究表2 2 实验器材列表( 续)仪器名称生产厂商循环水式真空泵( s h z d 型)恒温水浴锅( 肌型)旋转蒸发器( r 2 0 l 型)玻璃仪器气流烘干器( k q - 8 型)h a i e r 冰箱( b c d 2 15 f i t 型)电热恒温鼓风干燥箱( d h q 914 0 a )调温电热器红外光谱仪( f t i r - 8 4 0 0 s 型)核磁共振仪( 5 0 0 m 型)巩义市予华仪器有限责任公司上海叶拓仪器仪表有限公司上海申科机械研究所巩义市予华仪器有限责任公司海尔有限公司上海精宏实验设备有限公司通州市申通电热器厂s h