大孔吸附树脂法富集纯化荆芥穗总黄酮的工艺研究.pdf

?制剂与质量 ? 收稿日期: 2010?05?07 作者简介: 黄志宏 ( 1985?), 男, 在读硕士研究生, 研究方向: 中药新药研究与开发; te: l 020?39358183 , e? mai:l hzh193 yahoo?com? cn 。 * 通讯作者: 蒋东旭, te: l 020?39358130 , e? mai: l 315652651 qq? com。 大孔吸附树脂法富集纯化荆芥穗总黄酮的工艺研究 黄志宏 1, 2, 蒋东旭1, 2* , 赖小平 1 , 2 ( 1?广州中医药大学新药开发研究中心, 广东 广州 510006 ;2?东莞广州中医药大学中医药数理工程研究 院, 广东 东莞 523808) ? ? 摘要? 目的: 对大孔树脂富集纯化荆芥穗总黄酮的工艺条件及参数进行优化。方法: 先以总黄酮比吸附量和 解吸率为指标, 通过静态吸附与解吸试验对 9种树脂型号进行筛选, 再通过动态吸附与解吸试验对富集纯化工艺 参数进行全面优化。结果: hp?20树脂对荆芥穗总黄酮的吸附与解吸性能较好; 确定最佳吸附条件为径高比 1 6 , 样品溶液 ph值为 6?0, 浓度 0?4 g(生药 ) /ml, 吸附流速 2 bv /h和最佳吸附量 133?76 mg(总黄酮 ) /g(干树脂 ); 最 佳解吸条件为 80% 乙醇洗脱, 洗脱流速 4 bv /h和溶剂用量 3 bv。结论: hp?20树脂可有效地对荆芥穗总黄酮进行 富集纯化。 关键词? 大孔树脂; 荆芥穗; 总黄酮; 富集纯化 中图分类号: r284?2? ? 文献标识码: a? ? 文章编号: 1001?4454(2010) 09?1476?05 study on the enrichm ent and purification of total flavonoids in schizonepeta tenuifolia bym acroporousadsorption resin huang zhi?hong1 , 2,ji ang dong?xu 1, 2, la ix iao?ping1 , 2 ( 1?guangzhouuniversity oftraditionalchinesem edicine , guangzhou 510006, china ;2?dongguanm athe matica, l engineeringa cade ? my ofchinesem edicine , guangzhouuniversity oftcm, dongguan 523808 , china) abstract?objective : to establish an opti mum enrichmentand purification process of totalflavonoids inschizonepeta tenuifolia by macroporous resins?m ethods : 9 kinds of resinswere compared and the best onewas chosen? then the technique condition for separating and purifying total flavonoids fro m schizonepeta tenuifolia was studied? results : hp?20was selected for its excellent adsorption and de ? sorption properties ,80%ethanolwas found to be the best elution solution?the best resultwas based on the follows: ph value?6?0 , feeding rate?2 bv /h , sa mple concentration?0?4 g/ml, the ratio of total flavonoids to hp?20 macroporous resin?133?76 mg/g , elution flo w ing rate?4 bv /h, eluting agentamount?3 bv?then the purity reached74?31% and the yieldwas 97?13% ?conclusion: the totalfla ? vonoids ofschizonepeta tenuifolia can be effectively purificated and separated byhp?20 macroporous resin? keywords? m acroporous resins ; schizonepeta tenuifolia briq?; total flavonoids; enrichment and purification ? ? 荆芥穗为唇形科植物荆芥 schizonepeta tenuifo? lia briq?的干燥花穗, 为传统常用发散解表药, 含有 挥发油、 黄酮、 萜类、 有机酸等多种化学成分, 具解表 散风、 透疹之功, 用于感冒、 头痛、 麻疹、 疮疡初起等 症。同时, 荆芥穗也是各中药复方 (如银翘散 )中的 重要组成药物。有文献 !1?3对银翘散抗流感病毒有 效部位群研究发现, 荆芥穗为银翘散抗流感病毒的 主要药物, 且黄酮类成分为其主要的有效成分之一。 目前, 针对荆芥穗挥发油的研究报道较多, 而以荆芥 穗总黄酮作为有效部位进行的研究则较少。本实验 在建立荆芥穗总黄酮定量测定的基础上, 对大孔吸 附树脂法富集、 纯化荆芥穗总黄酮的诸多影响因素 进行了研究, 优选出最佳的工艺条件与参数, 为荆芥 穗总黄酮纯化的中试和工业化大生产提供了一定的 依据。 1 ? 仪器与材料 75gduv? vis分光光度计 (上海仪器三厂 ); thz?82恒温水浴振荡器 (浙江嘉兴电热仪器厂 ); sartoriuscp255d电子天平 (德国 ); fl?1 、 fl? 2大孔 吸附树脂 (天津欧瑞生物科技有限公司 ); hp?20大 孔吸附树脂 (日本 organo三菱化成公司 ), hpd? 300 、 hpd?600大孔吸附树脂 (沧州宝恩化工有限公 司 ), d?101大孔吸附树脂 (天津海光化工有限公 司 ), nka#、 ab?8 、 x?5大孔吸附树脂 (天津南开大 学化工厂 ); 荆芥穗, 购自广州采芝林药业有限公司 (经广州中医药大学陈建南研究员鉴定 ); 橙皮苷对 照品 (供含量测定用 ), 批号: 110721?200512, 中国药 品生物制品检定所; 其余试剂均为分析纯。 ?1476? journal of chinesem edicinalm aterials? ? 第 33卷第 9期 2010年 9月 2 ? 荆芥穗总黄酮的含量测定 !2 2?1 ? 线性关系考察 ? 精密称取橙皮苷对照品, 用 甲醇制成浓度为 0?425 mg/ml的标准溶液, 再分别 精密量取 0?5 、 1?0、 2?0 、 3?0 、 4?0、 5?0 ml 于 25 ml 容量瓶中, 加 5 % nano2溶液 1 ml, 摇匀, 放置 6 m in ; 然后加 10 % a l( no3)3溶液 1ml, 摇匀, 放置 6 m in ; 再加 4 % naoh 溶液 10 ml, 最后用甲醇稀释至 刻度, 摇匀, 放置 15 m in , 以甲醇同法操作制备空白 对照, 于 283 nm波长处测定吸光度。以吸光度 ( a) 对浓度 (c )进行线性回归, 得回归方程 a= 0?8497 c + 0?3541 , r = 0?9997 ( n = 6)。表 明橙 皮苷 在 0?0085 0?085mg/ml之间与吸光度呈良好的线性 关系。 2?2 ? 加样回收率试验 ? 精密量取 0?1 g(生药 ) / ml的荆芥穗提取液适量, 用甲醇制成每 1 ml相当 于含生药量 0?04 g的供试品溶液, 精密量取 1 ml 置 25 ml量瓶中, 按 nano2- a1( no3)3- naoh 法 显色并测定吸光度, 代入回归方程, 计算得荆芥穗粗 粉总黄酮含量为 4?18 % ( n= 3)。精密吸取已知含 量的供试品溶液 6份, 每份 1ml, 置 25 ml量瓶中, 分别加入对照品溶液 0?50、 0?50 、 0?75 、 0?75 、 1?00 、 1?00ml, 按 nano2- a1( no3)3- naoh 法显色测定 吸光度, 得平均回收率为 99?38 % , rsd= 1?24 % ( n = 6)。 3 ? 荆芥穗总黄酮纯化工艺 3?1 ? 吸附原液的制备 ? 取荆芥穗粗粉适量, 加 10 倍量 80 %乙醇, 回流提取 2次, 每次 1?5h , 合并两次 滤液, 回收乙醇至无醇味, 加水稀释成 0?4 g( 生 药 ) /ml的药液, 200 r/m in离心 10m in, 过滤, 即得。 3?2 ? 大孔树脂的预处理? 将待处理的 9种树脂分 别装于柱中, 先用 95 %乙醇 (浸泡 4 h充分溶胀后 4 bv洗脱, 再用水洗至无醇味 ), 再用 5 % hcl( 3 bv 洗脱, 然后水洗至中性 ), 然后用 5 % naoh ( 3 bv洗 脱, 然后水洗至中性 ), 再用 95 %乙醇洗至乙醇洗脱 液加水不出现白色混浊即可, 最后用水洗脱至洗脱 液无醇味, 取出树脂, 分别置于三角瓶中, 标记备 用。 3?3 ? 大孔吸附树脂型号的选择 ? 3?3?1?静态吸附性能比较: 根据荆芥穗总黄酮的 理化性质和树脂的吸附性能, 选用 9种不同型号的 树脂进行试验。称取经预处理过的湿树脂各 2 g , 分 别置于 50ml具塞磨口三角锥形瓶中, 加入吸附原 液 20ml, 于室温 25 下振荡 ( 120 r/m in) 24h至吸 附平衡, 测定吸附液总黄酮含量, 计算吸附量 吸附 量 = (吸附前药液质量浓度 - 吸附后药液质量浓 度 ) %药液体积 /树脂干重 和吸附率 吸附率 (% ) = (吸附前药液质量浓度 - 吸附后药液质量浓度 ) / 吸附前药液质量浓度 % 100% 。 3?3?2?静态解吸性能比较: 将已吸附了荆芥穗总 黄酮的树脂分别过滤, 除去水液, 置 100 ml 具塞磨 口三角锥形瓶中, 加入 70 % 乙醇 50 ml, 室温 25 下振荡 ( 120 r/m in) 24h至解吸平衡, 测定解吸液总 黄酮含量, 计算解吸率 解吸率 (% ) = (解吸液质量 浓度 %解吸液体积 ) /吸附总量 % 100 % 。 3?3?3?树脂筛选结果: 综合比较 9种大孔树脂的 吸附量、 吸附率和解吸率 3项指标, 结果见表 1 , 最 后选择比表面积较大的非极性 hp? 20树脂纯化荆 芥穗总黄酮。 ? ? 表 1?9种大孔树脂对于黄酮类化合物吸附及解析特征 树脂型号 粒径 / mm 比表面积 / (m2/g) 平均孔径 / nm 极性 吸附量 / (mg /g) 吸附率 / % 解吸率 / % fl?10?3 1?0100 20020 30极性83?1049?7497?61 fl?20?3 1?0120 20025 35弱极性89?4553?5998?31 hp?200?3 1?260026非极性141?2884?5197?17 hpd?3000?3 1?2800 8705?0 5?5非极性138?7883?0594?72 hpd?6000?3 1?2550 6008?0极性135?2680?9296?48 d?1010?2 0?6400 60010?0 12?0弱极性127?5776?3586?38 nka#0?3 1?25160 20014?5 15?5极性75?7445?3898?72 ab?80?3 1?25480 52013?0 14?0弱极性132?2679?1589?41 x?50?3 1?25500 60029?0 30?0非极性120?8972?3279?54 3?4 ? hp?20树脂吸附荆芥穗总黄酮的影响因素 ? 3?4?1?样品溶液 ph 值考察: 取 6份浓度为 0?4 g (生药 ) /ml的药液 100ml, 调节 p h 值至 3?0 、 4?0 、 5?0 、 6?0 、 7?0、 8?0 , 在相同条件下以 2 bv /h的流速 进行动态吸附后, 用 2 bv蒸馏水按 4 bv /h冲洗, 至 冲洗液 molish反应为阴性。再用 80 % 的乙醇进行 洗脱, 均洗脱至洗脱液近无色。收集洗脱液, 分别定 容于 250ml量瓶中, 依法测定总黄酮吸附量。结果 见图 1 , 样品溶液的 p h 值对荆芥穗总黄酮吸附有较 大的影响, p h = 3?0时吸附量较低, 因为样品溶液酸 ?1477? journal of chinesem edicinalm aterials? ? 第 33卷第 9期 2010年 9月 性太强, 黄酮类化合物容易转变为佯盐, 不易被吸 附 !4, p h = 6?0时吸附量最大, 因为此时的酸度正好 能使黄酮类化合物在溶液中保持分子形式, 容易被 吸附。因此, 样品溶液吸附的最佳 p h 值为 6 , 故以 下实验中, 样品溶液浓度均调节 ph为 6?0 。 图 1? 不同 p h 值对树脂吸附量的影响 3?4?2?树脂柱径高比的考察: 取 0?4 g(生药 ) /ml 的药液 100 ml, 分别上样于 3根径高比为 1 4 、 1 6 和 1 8的树脂柱上, 以相同的上样流速进行动态吸 附后, 依法分别测定洗脱液中总黄酮的含量。结果 见图 2, 合理的径高比可以提供较好的分离效果, 当 径高比过大时会影响到洗脱速度, 同时容易产生分 层、 气泡不容易消除、 样液容易堵塞树脂柱等问题, 因此, 为保证吸附量最大选择径高比为 1 6的树脂 上柱。 图 2? 不同径高比对树脂吸附量的影响 3?4?3?吸附流速考察: 取 0?4 g(生药 ) /ml的药液 100ml, 以 1 bv /h 、 2 bv /h、 3 bv /h 、 4 bv /h的流速 通过树脂柱进行动态吸附, 测定洗脱液中总黄酮的 含量, 计算吸附率, 结果见图 3 , 随着吸附流速的加 快, 树脂对总黄酮的吸附率明显下降, 故以慢速为 好, 但流速过慢会延长生产周期, 因此, 在吸附率相 差较小的情况下, 选择以流速 2 bv /h进行吸附。 3?4?4?样品溶液浓度考察: 选择 4个浓度药液 0?2 、 0?4 、 0?6、 0?8 g(生药 ) /ml, 依次加入量为 200 、 100 、 67 、 50 ml, 以 2 bv /h的流速进行动态吸附, 测 定洗脱液中总黄酮的含量, 结果见图 4 , 在一定浓度 范围内, 大孔吸附树脂的吸附量随着样品溶液浓度 的增加而增大, 但样品溶液浓度的增加又有一定的 限度。随着浓度的增大, 沉淀不断增多, 黏度也不断 增大, 容易堵塞树脂柱, 导致树脂吸附量降低。而样 品溶液浓度相对过低, 又会导致上样体积增加, 降低 生产效率。因此, 综合考虑后选用浓度为 0?4 g(生 药 ) /ml的样品溶液进行吸附。 图 3? 不同流速对树脂吸附率的影响 图 4? 不同浓度原液对树脂吸附量的影响 3?4?5?泄漏曲线考察: 取药液 100 ml按上述条件 上柱, 分段收集吸附流出液 ( 5 ml /段 ), 共计 20份, 测定各流份中荆芥穗总黄酮浓度, 以流份累计总体 积为横坐标, 各流份总黄酮浓度为纵坐标, 绘制吸附 泄漏曲线, 结果见图 5 , 当上样体积为 80 ml时, 总 黄酮开始泄漏, 因此, hp? 20树脂对总黄酮的最佳吸 附量应控制在 133?76mg/g以内。 图 5? hp?20树脂的吸附泄漏曲线 3?4?6?洗脱液浓度考察: 取药液 80 ml 按上述条 件上柱, 吸附完毕后, 用 2 bv 蒸馏水按 4 bv /h冲 洗, 至冲洗液 molish反应为阴性。再分别用 60 % 、 70%、 80%和 90% 乙醇进行洗脱, 均洗脱至洗脱液 近无色。收集洗脱液, 定容于 250 ml 量瓶中, 依法 ?1478? journal of chinesem edicinalm aterials? ? 第 33卷第 9期 2010年 9月 测定总黄酮的含量。结果见图 6 , 90 % 乙醇的解吸 率达 97?17 % 和 80 % 乙醇接近 ( 96?65 % ), 但高于 70 % 乙醇 ( 94?93 % )。因此, 确定以 80 % 乙醇为洗 脱溶剂。 图 6? 不同浓度乙醇对树脂解吸率的影响 3?4?7?洗脱流速考察: 按上述优化条件, 分别选用 不同流速 2 、 3 、 4 、 5 bv /h的 80 % 乙醇进行洗脱, 洗 脱至洗脱液近无色。收集洗脱液, 定容于 250ml量 瓶中, 依法测定总黄酮的含量。结果见图 7 , 洗脱液 的流速为 2 bv /h时, 解吸率最大, 而流速为 4 bv /h 时, 解吸率比流速 2 bv /h稍小, 但是可以缩短一半 的洗脱时间, 考虑到生产效率, 最后选择 4 bv /h为 洗脱流速。 图 7? 不同洗脱流速对树脂解吸率的影响 3?4?8?解吸曲线的绘制: 取药液 80 ml按上述条 件上柱, 吸附完毕后, 用 2 bv蒸馏水按 4 bv /h冲 洗, 至冲洗液 molish反应为阴性。再用 80%乙醇以 4 bv /h流速进行洗脱, 收集 20份洗脱液 ( 10 ml / 份 ), 测定洗脱液总黄酮的含量, 计算解吸率。以流 份编号为横坐标, 总解吸率为纵坐标, 绘制解吸曲 线。结果见图 8 , 流份 9的解吸率明显高于流份 8 , 但与流份 10及其以后的各流份相差不大, 表明此时 树脂床中的总黄酮基本解吸完全。按每段流份 10 ml计算, 溶媒用量为 90 ml, 相当于 3倍树脂床体 积, 所以解吸溶媒最佳用量为 3 bv。 3?5 ? 工艺验证实验? 取药液 2份 ( 60 ml /份 ), 一 份按上述因素考察确定的最佳工艺条件进行试验, 将洗脱液和另一份药液减压浓缩、 真空干燥, 制备干 浸膏, 称重, 测定荆芥穗总黄酮含量, 计算精制度 精制度 =处理前干膏收率 /处理后干膏收率 和保 留率 (% ) 保留率 (% ) = 纯化后总黄酮含量 /纯化 前总黄酮含量 % 100 % 。采用相同方法进行 3次重 复试验。试验结果表明, 荆芥穗醇提后经过 hp?20 精制纯化后, 精制度达 3?49 , 荆芥穗总黄酮含量为 74?31 % ( rsd= 0?40 % ), 保留率为 97?13 %。 图 8? hp?20树脂的洗脱曲线 4 ? 讨论 4?1 ? 影响大孔吸附树脂吸附性能的因素有很多, 包括树脂的结构、 极性、 比表面积、 粒径、 孔径以及被 吸附分子的极性、 分子大小等。一般来说, 树脂的极 性与被吸附分子的极性相同或相近时吸附效果更 好; 树脂有较大比表面积时吸附量更大; 树脂孔径是 被吸附分子大小的 5 6倍时吸附性能最好 !5, 因 此, 本实验在筛选树脂时综合考虑到树脂的极性、 比 表面积和孔径等因素, 并最终结合各树脂的吸附与 解吸性能, 选用 hp?20树脂来分离纯化荆芥穗总黄 酮。 4?2 ? 目前, 应用大孔吸附树脂技术确定纯化工艺 最佳条件时, 每篇文献对于树脂柱的径高比、 上样液 质量浓度、 p h 值、 体积流量和最佳吸附量、 最佳洗脱 液浓度、 洗脱流速和溶剂用量等影响因素的筛选参 差不起, 有的只对其中几个因素进行考察, 而每个工 艺的主要和次要影响因素之间又存在较大的差 异 !6, 因此, 为保证纯化工艺的稳定可控, 本实验对 各影响因素进行了全面的考察, 同时在因素优化确 定后进行了工艺验证实验以保证纯化效果。 4?3 ? 树脂纯化工艺的影响因素复杂, 实验室得到 优选工艺参数只是为生产提供了参考。而要进行工 业化生产, 必须进行放大试验, 根据中试放大的试验 结果, 调整工艺参数。树脂纯化工艺的最后参数应 以中试放大后得到的参数为准。 参考文献 1 胡峻, 石任兵, 张援虎, 等 ?荆芥穗化学成分研究 j? 北京中医药大学学报, 2006, 29( 1): 38?40? 2 胡峻 ? 荆芥穗有效部位化学成分及其质量标准研究 ?1479? journal of chinesem edicinalm aterials? ? 第 33卷第 9期 2010年 9月 d?北京: 北京中医药大学, 2005? 3 张援虎, 周岚, 石任兵, 等 ?荆芥穗化学成分的研究 j ?中国中药杂志, 2006, 31( 15): 1247?1249? 4 陈建军, 钱俊青, 范长春 ? 大孔吸附树脂纯化乌药叶黄 酮化合物研究 j? 浙江工业大学学报, 2009, 37( 5): 530?534? 5 汤建萍, 周春山, 丁立稳, 等 ?大孔吸附树脂分离纯化荔 枝核黄酮类化合物的研究 j?离子交换与吸附, 2006 , 22( 6): 551?558? 6 从毛勉, 盛方标, 范鲁雁 ?大孔吸附树脂在分离纯化中 药复方中的应用 j ? 安徽医药, 2009, 13( 11): 1411? 1414? 收稿日期: 2010?05?07 基金项目: 国家自然 科学基金资助项目 ( 20976031); 广西 自然科学基金资助 项目 ( 0991030); 广西 研究生教 育创新计划 项目 ( 2008105930817 m 46); 广西教育厅科学研究项目 ( 2006 26); 广西大学科研基金项目 ( x081020); 广西青年基金项目 ( 0832008); 广西教育厅 科学研究项目( 200708lx180) 作者简介: 谢济运 ( 1966?), 男, 硕士研究生, 高级实验师, 主要从事化学工艺与林产化工研究; te: l 0711?3272702 , e? mai: l lzszxjy 126? com。 * 通讯作者: 陈小鹏, te: l 0711?3272702 , e? mai: l lil m gxu? edu?cn 。 减压内沸法提取湿地松松针中莽草酸的研究 谢济运 1, 2, 陈小鹏1* , 陈? 芳 1 ( 1?广西大学化学化工学院, 广西 南宁 530004;2?柳州师范高等专科学校, 广西 柳州 545004) ? ? 摘要? 以湿地松松针为原料, 高浓度乙醇为解吸剂, 低浓度乙醇为热提剂, 采用减压内部沸腾提取法, 对湿地 松松针中莽草酸进行提取工艺的研究。通