样品前处理技术在色谱分析中的应用.pdf

兰州大学 博士学位论文 样品前处理技术在色谱分析中的应用 姓名：杨彩玲 申请学位级别：博士 专业：化学 分析化学 指导教师：张海霞;刘满仓 20080501 样品前处理技术在色谱分析中的应用 中文摘要 色谱分析已成为当今分析化学领域应用最广泛的一种分析测试手段，应用范围 涉及医药、环保、生命科学、石油化工等几乎所有基础和研究领域。由于色谱分析 常常用于各种复杂的基体以及低含量组分的分析，消除基体干扰，提高分析灵敏度， 延长仪器寿命是一个普遍需要解决的问题，因此，对样品进行色谱分析前处理变得 非常重要。迄今为止，样品前处理的方法很多，本质上可分为两大类：一类是对检 测器响应弱( 或无信号) 的样品，通过衍生技术改变其物理和化学性质，使之成为可 被检测的化合物。另一类是通过对复杂基体样品中低含量组分进行分离、纯化和富 集以获得同样效果。这主要包括液一液萃取( l 比) 、超临界流体萃取、微波辅助萃 取、固相萃取( s p e ) 、固相微萃取( s p m e ) 和液相微萃取( l p m e ) 等。本论文在 综述前人工作的基础上，围绕样品前处理技术进行研究，开展了如下具有原始创新 性的工作。 ( 1 ) 以n b d c l 为衍生试剂，建立了柱前衍生高效液相色谱法测定胰岛素的灵敏分 析新方法； ( 2 ) 以n b d c l 为衍生试剂，建立了柱前衍生高效液相色谱法测定胰岛细胞中游离 氨基酸的分析方法； ( 3 ) 建立了液相微萃取一高效液相色谱测定血桨中的防己诺灵碱和粉防己碱的分 析新方法； ( 4 ) 混合传统吸附剂，采集小体积空气样品，以固相萃取和热解吸浓缩进样装置 两种方式解吸被吸附物质，利用g c m s 对空气中污染物进行定性分析。 本论文共分为五个部分： 第一章：从两个方面，针对样品前处理技术在色谱分析中的应用进行了综述。 ( 1 ) 衍生技术分别从紫外衍生技术和荧光衍生技术两个方面进行了总结。总结了 衍生试剂的选择、衍生反应条件等方面情况； ( 2 ) 分离、纯化和富集技术该内容总结了液相微萃取、固相微萃取、固相萃取三 种萃取技术的原理、发展和实际应用。其中，以液相微萃取为重点内容进行了详细 介绍。 第二章：提出了以n b d c l 为衍生试剂，利用柱前衍生高效液相色谱技术测定胰岛 素的灵敏分析方法。对该衍生反应的条件进行了优化，得到了以0 1 m 的磷酸盐缓冲 溶液( p h9 0 ) 为衍生介质、反应温度5 0 、反应时间2h ，避光下进行的最优条件。 色谱分析在利用c 1 8 柱和流动相为乙腈水体系( 含有0 1 的n 1 a ) ( v v ：3 0 7 0 ) 的条件下完成。该分析方法灵敏准确。 第三章：同样以n b d c l 为衍生试剂，建立了柱前衍生高效液相色谱技术测定胰岛 细胞中游离氨基酸的新方法。该工作分离并检测了白鼠胰岛中1 5 种游离氨基酸的含 量，并对基体效应和衍生反应条件进行了考察。氨基酸衍生物的分离通过h p l c 二元 梯度模式实现。方法准确，灵敏，重复性好。 第四章：建立了液相微萃取一高效液相色谱法测定血桨中防己诺灵碱和粉防己碱的 新方法。该工作利用中空纤维支撑三相微萃耿和高效液相色谱分析测定血浆中的粉 防己碱和防己诺灵碱，以探索高疏水性化合物利用中空纤维支撑三相微萃取的适用 性，各种影响萃取的参数被优化，并与其它样品前处理方法进行比较。结果表明， 与其它萃取方法相比，三相微萃取具有更高的预浓缩能力和有效的样品净化能力。 该方法具有低的检测限，良好的重现性和线性。 第五章：利用固相萃取和气质联用技术定性分析了空气中的污染物。该工作利用 混合传统吸附剂，采集小体积空气样品，以固相萃取和热解吸浓缩进样装置两种方 式解吸被吸附物质，减少了实验操作中有机溶剂用量，并缩短了样品处理时间，利用 g c m s 定性了兰州不同地区空气中污染物。 关键词：高效液相色谱；荧光衍生；胰岛素；氨基酸；液相微萃取 a b s t r a c t h i g hp e r f b 珊a n c el i q u i dc h r o m a t o 伊a p h i cm e t h o d ( h p i j ( 、) i sb e c o m i n gw i d e l yu s e d i n a n a l v t i c a lc h e m i s t r yf i e l d ，s u c ha sm e d i c i n ea n a l y s i s ，e n v i r o n m e n tp r o t e c t i o n ，l i f es c i e n c c a i l dp e t r o c h e m i c a li n d u s t r ) r h o w e v e r ，m a l l ys a i n p l e sf o rh p l cw e r ec o m p l e x 明dl o w e r c o n c e n t f a t i o n s o ，r e m o v i n g i i l t e r f e r e n t sf r o ms 锄p l e sb e f o r eh p l c锄l y s i s卸d i m p t o v et l l es e n s i t i v i t y0 fh p l cm e t h o d sa r e 硫p o n a n t u pt 0n o w ，t h e r e a r em a n y s a m p l e sp r e t r e a t m e n tt e c h n i q u e sh a db e e nd e v e l o p e d f o rh p l c 觚a l y s i s t 、加l 【i n d sc a n b es u m m a r i z e df b rt h e s ep r e t r e a t m e n tt e c h n i q u e s t h ef i r s t k i n do ft e c l l i l i q u ei s d e r i v a t i z a t i o nr e a c t i o n f 0 rs o m ec o m p o u n d s ，t l l e yc 卸t b ed e t e c t e db yh p l c _ u v d e t e c t o ro rh p l c n u o r e s c e n c ed e t e c t o r 7 1 1 1 e s ec o m p o u n d sc a nb e d e t e c t e da f t e r d e r i v a t i z a t i o nt h r o u g l lc h e m i c a l r e a c t i o n 1 n h es e c o n di sp r e - c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e t i l i s k i n do ft e c h n i q u ei n c l u d e sl i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o n ( u 正9 ，m i c r o w a v ea s s i s t a n te x t r a c t i o n ， s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) ，s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ( s p m e ) 锄dl i q u i d p h a s e m i c r o e x t r a c t i o n ( l p m e ) ，e ta 1 i nt h i sd i s s e n a t i o n ，w eh a v ec a h i e do u ts o m eo r i 舀n a l s t u d i e sa sf b l l o w s ： ( 1 ) ar 印i d 柚ds e n s i t i v ep r e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n - h p “：m e t h o df o r 柚a l y s i so f i n s u l i nw a sa c c o m p l i s h e du s i n gn b d - c la sn u o r e s c e n td e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t ( 2 ) ar a p i da n ds e n s i t i v ep r e - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n - h p l cm e t h o df o ra n a l y s i so f f r e e 锄i n oa c i d si ni s i e t so fl a n g e r h a l l sw a sa c c o m p l i s h e du s i n gn b d c l a s n u o r e s c e n td e r i v a t i z a t i o nr e a g e m ( 3 ) as i m p l e ，m e x p e n s i v e a n de f ! f i c i e n tu q u i d - p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ( l p m e ) t e c h n o l o g yc o m b i n e dw i t hh 谫- p e 哟咖a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w a sd e v e l o p e df o r t h es i m u l t a n e o u sa n a l y s i so ft e t r 锄d r i n ea n df a n g c h i n o l i n ei n p l a s m as 锄p l e s ( 4 ) u s i n gm i x e dt r a d i t i o n a l s o r b e n t st oc o l l e c ta i rs 锄p l e si nl e s sv o l u m et h a n t r a d i t i o n a lm e t h o d 弛dt 0d e s o r bt h es u b s t 孤c e sv i ah e a td e s o r p t i o n a i i d c o n c e n t r a t i o ni n j e c t o ro rs p e ，an o v e lm e t h o df o rq u a l i t a t i v e 觚a l y s i sp o l l u t a n t i l la i rw a s d e v e l o p e d f i v ep a r t sa f ei n c l u d e di nt h ed i s s e n a t i o n c h a p t e ri ：s 锄p l ep r e p a r a t i o nw 弱s u m m a r i z e d f r o mt 、os i d e s ： ( 1 ) d e r i v a t i z a t i o nt e c h n i q u e ：u v 锄dn u o r e s c e n c ed e r i v a t i z a t i o nw e r ci n t r o d u c e d i i i i i l c l u d i n gt h ec h o i c eo f d e r i v a t i z a t i v er e g e n t sa i l dd e r i v a t i z a t i v ec o n d i t j o n s ( 2 )i s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n de 埘c l l i i l e n tt e c q u e ：l i q u i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ， s o l i dp h a s em i a m x t r a c t i o na n ds o l i dp h a e x t r a u c t i o nw e r ei n t l 0 d u c e dh e r ew i t hl i q u i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n 硒t h ee m p h a s i si n c l u d i n gi t st h e o r y o p e r a t i o n 锄da p p l i c a t i o n c h a p t e ri i ：d e t e 姗i n a t i o n0 fi n s u l i nw i t hh p l ca n dp r e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o nu s i n g n b d c la sd e r i v a t i z a t i v er e a g e n t 舢ll 【i n d so fc 0 n d i t i o n sw h i c ha 虢c t e dt h ed e r i v a t i v e r e a c t i o ni n c l u d i n gt e m p e r a t u r e ，t i m e ，p ha n db u f f e re ta lw e r es t u d i e d 1 1 l eo p t i m a l c o n d i t i o n sa r e ：5 0 ，2h ，0 1m p h o s p h a t eb u f f e rw i t hp h9 oa n dt h ed e r i v a t i v er e a c t i o n w a sc a 盯i e do u ti nt h ed a r k t 1 l eh p u ：c o n d i t i 伽sa r e ：c 1 8 ，m o b i l ep h a s e ：a c n - o 1 t f a ( 3 0 ：7 0 ，v v ) c h a p t e ri i i ：f r e e 锄i n oa c i d si i li s l e t so fr a tw e r e m e a s u r e db yh p l c w i t hn b d c la s d e r i v a t i z a t i v er e a g e n tf o rp r e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n 1 5 锄i n oa c i d sw e r es e p a r a t e d 卸d a n a l y z e dw i t hg r a d j e n te l u t i o n t h em a t r i xa n da l lk i n d so fc o n d i t i o n sa 仃e c t i n gs e p a r a t i o n a n dd e r i v a t i z a t i o nw e r es t u d i e d ，t h er e s u l t sa r es a t i s f i e d c h a p t e ri v ：d e t e 姗i n a t i o no ft e t 砌d r i n e 柚df 抽g c h i n o l i n ei i lp l a s m as a m p l e su s i n g h o l l o wf i b e r l i q u i d - p h a s e m i c r o e x t r a c t i o nc o m b i n e dw i t hh i g l l 一p e r f o 咖a n c el i q u i d c h r o m a t o 伊a p h yw a ss t u d i e d s e v e r a lp a r a m e t e r si n n u e n c i n gt h ee f f i c i e n c yo fl p m e w e r ei n v e s t i g a t e d 锄do p t i m i z e di n c l u d i n go r g a n i cs o l v e n t ，s t i r t i n gr a t e ，e x t r a c t i o nt i m e ， s a l tc o n c e n t r a t i o n ，o r g 柚i cm o d i f i e r 卸dp h t t l em e t h o ds e tu pw a sc o m p a r e dw i t ho t h e r t e c h n i q u e sa n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em e t h o di sp r i o rt oo t h e rt e c h n i q u e so nt h e s a m p l ec l e a n i n g 柚d e n r i c l u n e n tf a c t o r c h a p t e rv ：t h ep o l l u t a n t si na j ro fl a n z h o uc i t yw e r eq u a l i t a t i v e l ya j l dq u a i l t i t a t i v e l y a n a l y s e db yg c m s w i t hs o l i dp h a s ee x t r a c t i o n u s i n g am i x e da b s o r b e n ta n d h e a t d e s o r p t i o n 1 m es a m p l e 锄o u n t ，o 唱卸i cs o l v e n t 锄o u n tu s e d 柚dt h e 卸a l y s i st i m e o ft l l ee x p e r i m e n tw e r cl e s st h a nw i t h0 t l l e rm e t h o d s k e yw o r d sl l i g l lp e 晌肌a n c el i q u i dc h r o m a t o 伊a p h y ，f l u o r e s c e n c e d e r i v a t 讫a t i o n ， i n s u l i n ，a m i n oa c i d ，l i q u i d - p h a s em i c i d e x t r a c t i o n 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研 究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、 观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其 他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 攀 日期：垫鲤_ 蚰 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州 大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保 存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和 借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发 表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位 仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名身易杉糖师签名 日期： 兰州大学博上学位论文 第一章样品前处理技术在色谱分析中的应用 引言 色谱分析已成为当今分析化学领域应用最广泛的一种分析测试手段，应用范围涉 及医药、环保、生命科学、石油化工等几乎所有基础和研究领域，常常需要面对各 种复杂的基体以及低含量组分的分析。在色谱分析中，消除基体干扰，提高分析灵 敏度，延长仪器寿命是一个普遍问题，因此，对样品进行前处理非常重要。迄今为 止，样品前处理的方法很多，本质上可分为两大类：一类是对检测器响应弱的样品， 如没有紫外或荧光吸收( 或自身有弱吸收) 的待分析物，通过衍生技术改变其物理 和化学性质，使之成为可被检测的化合物，从而实现灵敏分析；与此同时，也达到 改善分离选择性的目的。另一类是通过对复杂基体样品中低含量组分进行分离、纯 化和富集以获得同样效果。这主要包括液一液萃取( u 正) 、超i 临界流体萃取、微波 辅助萃取、固相萃取( s p e ) 、固相微萃取( s p m e ) 和液相微萃取( l p m e ) 等。通 常，这些方法可以联合使用以期获得最佳分析结果。本文将对较新出现的各种前处 理方法的研究进展进行综述，并结合自己实验工作侧重于衍生技术和液相微萃取两 种主要方法。 一、衍生技术 随着液相色谱技术的发展，要求使用通用型的高灵敏检测器，但迄今为止，高 效液相色谱还没有一个足以同气相色谱相比拟的通用型检测器。例如，示差折光检 测器虽然是一通用型检测器，但其灵敏度远不如气相氢火焰离子化检测器，而且干 扰因素太多，在工作过程中很容易受到周围温度和流动相流速的影响，并且不能进 行梯度洗脱。紫外和荧光检测器比示差折光检测器则要灵敏得多，对温度变化不敏 感，适于梯度洗脱。但是要求被测样品有紫外吸收或能被激发产生荧光，故属于选 择性检测器。为了扩大高效液相色谱的适用范围，提高检测灵敏度和改善分离效果， 采用化学衍生法是一个行之有效的途径。化学衍生法是借助化学反应给样品化合物 接上某个特定基团，从而改善样品混合物的检测性能和分离效果。 高效液相色谱的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂( 一般称作化学衍 生试剂或标记试剂) 与样品组分在色谱分离之前或分离之后发生化学反应，从而使 得反应产物有利于色谱检测或分离。简言之，化学衍生法主要有以下几个目的： 兰州大学博上学位论文 ( 1 ) 提高对样品的检测灵敏度 ( 2 ) 改善样品混合物的分离度 ( 3 ) 适合于进一步作结构鉴定，如质谱，红外或核磁共振等。 衍生主要分为紫外和荧光衍生，下面我们将介绍这两种衍生方法。 1 紫外衍生技术 紫外衍生即加入发色团使正常形式下不能被检测的物质能够检测。发色团应具 有较大的摩尔吸收系数，使其吸收光谱能尽量提高检测灵敏度，使背景噪音变小。 一般情况下用于紫外衍生的试剂要有两个重要的官能团。第一个用于控制试剂与被 测物反应，第二个用于紫外检测，即发色团。 常用的紫外衍生试剂有4 一溴甲基一7 甲氧基香豆醛( b r m m c ) 、对一( 9 一葸酰氧 基) 苯甲酰甲基溴化物( p b r ) 、对一硝基苄基一n ，n ，_ 二异丙基异脲( f n b d i ) 、3 ，5 一 二硝基苄基一n ，n 一二异丙基异脲( d n b d i ) 、溴化对一溴苯甲酰甲基( p b p b ) 、卜氨 基萘( 1 n a ) 、3 ，5 一二硝基氯苄( d n b c ) ，4 一二甲基胺偶氮苯一4 一亚磺酰基( d a b s y l c 1 ) 、 卜萘异氰酸酯( n i c c 1 ) 、对一硝基苄基羟胺盐酸盐( p n b a ) 、3 ，5 一二硝基苄基羟胺 盐酸盐( d n b a ) 、n 一琥铂酰亚胺基一对一硝基苯醋酸酯( s 仙a ) 、n 一琥铂酰亚胺基 一3 ，5 一二硝基苯醋酸酯( s d n p a ) 等。 对于这些试剂文献中已有了广泛的报道。例如w o l f 卸dk o r f 等人对b r _ m m c 的衍生进行过详细评论，它可以用于脂肪酸，二羧基酸，含苯氧基的羟基酸类杀虫 剂，胆汁酸，维生素h 和它的类似物以及嘧啶化合物和前列腺素的衍生 1 。p b r 也 可以用于前列腺素衍生。经过衍生后的前列腺素可达到n g - p 咖l 浓度级的检测， 被成功用于测定小鼠和猪胃粘膜中的前列腺素 2 ，同时p b r 也可用于烷基磷酸的 衍生 3 ，其最大吸收波长为3 2 5 衄和4 9 0 姗。1 n a 很容易与羧基和酰氯化合物发 生反应 4 ，用它来定量脂肪酸检测限可以达到4n g l l ，定量s o c l 2 检测限可以到 1 0p m o l m l 。 此外，随着样品前处理技术的发展，化学衍生法也有了新的发展。例如在固相 顶空微萃取时，将衍生试剂置于纤维上，这样就可以萃取和衍生同时进行，以避免 溶剂损坏纤维上的吸附层。这种方法已经被用于血清中类固醇【5 】，多环芳烃化合物 及其代谢物的分析【6 】。 2 兰州人学博士学位论文 2 荧光衍生技术 高效液相色谱的荧光检测器比紫外检测器灵敏度更高。具有强紫外吸收的化合 物检测灵敏度可达n g 级水平，而荧光衍生物的检测水平一般为1 0 - 1 2 1 0 4 4m o l l 灵敏度比紫外检测器提高1 0 1 0 0 倍。h p l c 结合荧光检测方法所具有的高选择性、 高灵敏度以及试样用量少的特性，使得其对各种复杂生物样品中的分析物测定变得 更加灵敏、准确、快速。但荧光检测器要求被检测样品能被激发产生荧光。对于荧 光较弱或不产生荧光的样品灵敏度则很低，甚至不能被检测。为了扩大检品范围，提 高检测灵敏度，常采用荧光衍生法。 衍生化反应的关键是衍生试剂的选择，从实际分离和检测经验方面考虑，用于 荧光衍生化反应的衍生化试剂应具备下列条件【7 1 ：( 1 ) 试剂应具有较大的摩尔吸光系 数。 ( 2 ) 试剂应具有良好的发光发色性能，与分析物结合后不减弱。( 3 ) 衍生试剂 对某一官能团的衍生反应具有高度选择性。( 4 ) 过量衍生试剂易从反应产物中分离， 衍生物应具有好的色谱分离稳定性。( 5 ) 在温和条件下能够很快定量地生成衍生物。 ( 6 ) 形成的衍生物的荧光信号应远高于溶剂的背景吸收，对比明显且检测灵敏度高。 ( 7 ) 试剂合成方法简单，原料易得、毒性小。( 8 ) 生成的衍生物在甲醇或乙睛溶液中 有足够的溶解度。( 9 ) 衍生物对光有足够稳定性【8 】。 目前常用的荧光衍生化试剂有：荧光胺( n u o r e s c 锄i n e ，又名胺荧) 、邻苯二甲醛 ( o - p h t h a l d e h y d e ) 、丹酰氯( d a n s y l c h l o r i d e ，d n s - c 1 ) 、4 一氯一7 - 硝基- 2 ，1 ，3 - 苯骈恶二 唑( n b d c 1 ) 等。荧光胺是最常用的荧光衍生化试剂，可同伯胺及大多数氨基酸反应， 反应迅速，衍生物具有高的荧光强度，而试剂本身则迅速水解为不发荧光的产物， 是一种理想的柱前衍生化试剂；丹酰氯是应用最广的荧光衍生试剂，常用于含氨基 药物的测定，同伯胺和仲胺都能反应，也可用于含酚羟基的药物如雌激素的测定； 邻苯二甲醛，常用于伯胺类及a 氨基酸类化合物的荧光分析。胺类化合物的衍生试 剂还有荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) 、芴代甲氧基酰氯( f m o c c 1 ) 、4 氯7 硝基2 ，1 ，3 苯骈恶二唑( n b d c 1 ) 、6 氨基喹啉琥珀酰亚胺碳酸酯( a q c ) 等。目前已开发出一 些醇和酸的衍生化试剂。醇、酚的衍生试剂有：羰基氯类，芴代甲氧基酰氯；磺酰氯 类，丹酰氯( d a i l s y l c h l o r i d e ，d n s c 1 ) ，卤代三嗪类，1 乙氧基4 _ ( 二氯三嗪) 萘 ( e d t n ) ；羧酸类化合物的衍生试剂有：4 溴甲基7 甲氧基香豆素( b r m m c ) ，7 n 哌嗪4 二甲氨基苯骈呋喃重氮( d b d p z ) 、9 葸重氮甲烷( a d a m ) 、4 氨甲基6 ，7 二甲基香豆素 d m c ) 、9 ( 2 羟乙基) 吖啶酮( 玎巳a ) 等。羰基化合物的衍生试剂还 3 兰州大学博士学位论文 有肼类，如d n s h 、c e o c h ；氨基类，如氨基甲基芘等【9 1 0 】。 衍生化反应从是否形成共价键来说，可分为两种：标记和非标记反应，标记反 应是在反应过程中，被分析物与标记试剂之间形成共价键。而所有其它类型的反应， 如形成离子对、光解、氧化还原反应、电化学反应等都是非标记反应。另一种区分 衍生化反应是根据衍生反应的场所，分为柱前衍生化( p f e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n ) ，柱 上衍生化( o n c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n ) 和柱后衍生化( p o s t c o l u m nd e r i v a t i z a t i o n ) 三种。 从是否与仪器联机的角度来分有在线( o n 1 i n e ) 和离线( o 仟- l i n e ) 两种。目前在h p l c 中 以离线的柱前衍生法( 简称柱前衍生法) 与在线的柱后衍生法( 简称柱后衍生法) 使 用居多【1 0 】。 柱前衍生是在色谱分离前，预先将样品进行衍生，然后根据衍生物性质进行色 谱分离并检测的方法，其优点是勿需考虑衍生反应的动力学因素，衍生化试剂、反 应条件和反应时间的选择不受色谱系统的限制，不需附加仪器设备。缺点是操作过 程较繁琐，容易影响定量分析的准确性，且衍生反应形成的副产物可能对色谱分离 造成较大干扰，从而影响分析结果。但使用柱前衍生化方法衍生效率高，所以柱前 衍生仍是目前分离分析中最常用的方法之一。 柱后衍生是将混合样品先经色谱柱分离，再进行荧光标记，最后进入检测器检 测的方法，是液相色谱中比较常用的一种手段。在分离柱和检测器之间连接一个小 型反应通道，反应混合物以恒定的速度流过，使得衍生反应的操作简便、重现性好， 并且可连续反应，便于实现分析自动化，因此引起了许多分析专家的兴趣。但由于反 应是在色谱系统中进行，对衍生试剂、反应时间和其它反应条件均有严格限制，需要 通过控制反应通道的尺寸、流动相的流量以及反应通道的温度来实现在特定温度下 特定时间内的反应，所以在一定程度上限制了它的广泛应用【9 1 0 】。 高效液相色谱荧光衍生化技术已经被广泛应用于醇、酸【1 0 】、糖【1 1 】，雌激素 f 1 1 1 2 】，生物碱的检测，其中在氨基酸样品的分析方面应用最为广泛【1 3 2 0 】，并且 获得了长足的发展，无论是检测手段，还是衍生方法都趋于完善。此外高效液相色 谱衍生化技术在其它化合物如胺类、抗生素类、甾族化合物、儿茶酚胺等的分析检 测中，也有一定的应用【2 1 2 4 】。随着专一性强、灵敏度高的新型衍生化试剂的不断 开发，高效液相色谱荧光衍生化技术在生物样品分析和手性对映体分离分析方面蓬 勃发展8 1 。 4 兰州大学博上学位论文 二、分离、纯化和富集技术 1 液相微萃取技术 近年来，液相微萃取( l p m e ) 技术作为一种新的样品前处理方法蓬勃发展。该 技术与液液萃取相比，可以提供与之相媲美的灵敏度，更佳的富集效果。同时，该技 术集采样、萃取和富集于一体，灵敏度高，操作简单，而且还具有快捷，廉价等特 点。另外，它所需要的有机溶剂也仅仅是几微升至几十微升，是一项环境友好的样 品前处理新技术，特别适合于环境样品中痕量、超痕量污染物和生物样品中低浓度 药物的测定。 从外在形式进行划分，l p m e 可分为单滴溶剂微萃取( s d s m ) 和中空纤维膜液相 微萃取( h f l p m e ) 两种模式。1 9 9 6 年，c 锄觚e l l 和j e a n n o t 首次提出单滴溶剂微萃取 技术【2 5 】，利用悬挂在t e f l 伽棒端、与水不相混溶的有机溶剂液滴对水溶液中的分 析物直接进行萃取，萃取完成后从t e f l o n 棒顶端用微量进样器抽取有机溶剂再进行 气相色谱分析。萃取过程中，由于有机相液滴容易受到水相的影响，特别在高速搅 拌的情况下，有机相液滴很不稳定，容易脱落和变形，导致测定值也很不稳定；另 一方面，由于有机相溶剂的体积特别小，萃取后的样品量很少，不适合于液相色谱 分析。为了解决这个问题，p e d e r s e n b j e r g a a r dr a s m u s s e n 于1 9 9 9 年提出中空纤维膜 液相微萃取【2 6 】，即利用中空纤维壁的微孔和内腔支撑萃取溶剂进行萃取，增大了 萃取溶剂与样品溶液中分析物之间的传质面积，也同时保证了萃取溶剂的稳固性。 从萃取溶剂所处位置进行划分，“ m e 可分为浸入式萃取和顶空萃取。即萃取 溶剂直接浸入到样品溶液中或是悬在液面上空进行的萃取 从萃取机理进行划分，l p m e 又可分为两相微萃取( t w op h a s e l p m e ) 和三相 微萃取( n 睇ep h a s e l p m e ) 两种模式。使多孔中空纤维的微孔和内腔充满相同有 机溶剂，并使之固定在微量进样器的针头上( 或将有机液滴直接悬挂在进样器针头 上) ，分析物( a ) 从水相样品溶液( d 彻o rp h a s e ，给体相) 扩散进入有机相( a c c e p t o r p h a s e ，受体相) 的萃取模式称为两相微萃取。其萃取过程可表示为： a ( d o n o rp h a s e ) 一一a ( a c c e p t o rp h a s e ) 将有机溶剂固定在中空纤维的微孔中，使之形成一层有机液膜相( o r g a n i c p h 舔e ) ，并使中空纤维的内腔充满水相的萃取溶剂( a c c e p t o rp h a s e ) 。样品溶液，有 机液膜和水相的萃取溶剂三者共同组成一个“三明治“ 型的萃取系统。分析物首先 5 兰州大学博士学位论文 由给体相进入有机液膜，然后再反萃到受体相中的萃取模式称为三相微萃取。其萃 取过程可以表示为： a ( d o n o rp h a s e ) 一一a ( o r g l n j cp h a s e ) 一一a ( a c c 印t o rp h a s e ) 两相微萃取适合于在非极性有机溶剂中有较高溶解度的化合物分析，最常与 气相色谱( g c ) 联用，广泛地应用于环境样品中杀虫剂，除草剂及其它有机污染物 的分析。三相微萃取适于具有可离子化基团的碱性或酸性化合物的分析，因其水性 的接受相，可以与毛细管电泳( c e ) 和液相色谱( h p l c ) 联用，常用于环境样品 和生物体液中低含量组分的测定。 1 1 液相微萃取理论【2 7 】 液相微萃取是基于相平衡原理的一项技术。对于两相微萃取来说，当达到萃取 平衡时， k = c d 钾巳钾 ( 1 _ 1 ) 咒f2 行d + 刀d ( 1 2 ) 式中：k 为萃取达到平衡时分析物在受体相和给体相中的分自c 糸教；咒，、咒d 和n 。 分别为分析物在样品溶液中的初始量、以及萃取过程中在给体相和受体相 一中的量；c o 脚和c d 捌分别是两相平衡时分析物在受体相和给体相中的浓 度。 公式( 1 - 2 ) 也可以写为： c j ；c 。叼圪+ c 拍，屹 ( 1 _ 3 ) 分析物在受体相中的量也就可以表示为： q 一器 ( 1 4 ) 尺= 罂。害删 ( 1 5 ) c j 圪叱+ 屹 、。 铲c o 印箍悫 m 6 ) 式中：圪和分别是有机溶剂和样品溶液的体积；c ，和c o 分别是分析物在样品溶 兰州大学博士学位论文 液中的初始浓度和在受体相中的最终浓度：r 是萃取回收率；毋表示分析物的富集 倍数。 由于有机相的体积远小于样品溶液的体积，所以萃取达到平衡时，分析物就能 够在有机相被富集。公式( 1 6 ) 也说明要想获得高的富集倍数，就需要有低的相比 ( 吲虼) 和高的分配系数k 。 对于三相微萃取来说，当达到萃取平衡时，存在两个热力学平衡，即：样品在 给体相和有机相之间的平衡和样品在有机相和受体相之间的平衡。 由于分析物在三相中达到平衡，所以： 七，忌： 屯，；手苎毛告 ( 1 - 7 ) k 2 k 4 式中：“，f o ，址分别代表给体相、有机相和受体相中的分析物。七h ，幻，b ，k 分 别为传质速率常数。 萃取过程中，分析物在三相中量的关系为： 疗j = 一d + n 。+ 咒。( 1 8 ) 当萃取达到平衡时，有 c j 圪= c d 棚屹+ c 。钾圪+ c 。栅屹 ( 1 9 ) 即芒 ( 1 - 1 0 ) k ：，箬 ( 1 - 1 1 ) c 。州 、7 式中：、n 。、咒。和刀。分别为分析物在样品溶液中的初始量以及萃取过程中在给体 相、有机液膜相和受体相中的量；g 代表分析物在给体相中的初始浓度，c 正叼、g 叼、 c 叼分别代表分析物在给体相、受体相和有机相中的平衡浓度；局和恐分别代表 分析物在有机相与给体相之间的分配系数和在受体相与有机相之间的分配系数。 那么，分析物在受体相和给体相间的分配系数k 形就可以写为： k 。= k l k 2 ( 1 - 1 2 ) 7 矗 萃取平衡时，分析物在受体相中的量以。脚为： 7 兰州大学博士学位论文 k 。f v s y a 吃棚2 瓦舌赢 ，a 。1 咖州 尺一旦= 1 0 0 k 匕 ，a c 1 k 。圪+ k l 圪+ 圪 ，a 铲鲁2 箍。磊一 c j 1 0 叱k + ，+ ( 1 1 3 ) ( 1 1 4 ) ( 1 - 1 5 ) 式中：c 。表示分析物在受体相中的最终浓度。 由上述理论可知，在三相微萃取中，分析物的富集因子同样是受分析物在两相 中的分配系数和相比的影响。高的分配系数( k j ，憨) 和低的相比( 乞，乞) 能 够使分析物获得高的富集倍数。 1 2 液相微萃取模式 1 2 1 单滴溶剂微萃取 如图1 1 所示，c 柚t 、e l l 和j e 锄n o t1 2 5 】最初利用该装置，在t e n o n 棒端悬挂一 滴耻l 的j 下辛烷，并插入水相样品溶液中，在搅拌器搅拌下，萃取一定时间后，分 析物在正辛烷中得到富集。然后，该液滴通过气相色谱( g c ) 的微量进样器被抽回 进行g c 分析。由于萃取和进样需使用不同装置分开操作，较为麻烦，h e 和k e 对该装置进行了改进，将有机液滴悬挂在气相色谱的微量进样器针头代替t e n o n 棒， 使萃取和进样通过一支进样器便可完成【2 8 】。这种萃取模式因萃取溶剂浸入样品溶 液也称作直接浸入萃取( d i - i j m e ) 或静态萃取( s i j p m e ) 。 图1 1 液相微萃取示意图 f i g1 1 i u u s t 髓仰o f t h e i v e n tm i c r x t 珊c t i 仰s y s t e m 8 兰州大学博士学位论文 不 为了提高萃取效率，h e 和l e e 提出了动态微萃取( d - l p m e ) 【2 8 】，如图1 2 所 a ) o r | 垦a n j c s o l v c mp l u g aqucouss a m p i ep i u g 曜a n i c 瓤l i v c mc n f i c h 叫w i i ha 衄l y t c s 图1 2 动态液相微萃取示意图 f i g 1 2o p e r a t i o no fd y n a m j ci i q u i d - p h a s em j c r o e x t r a c t i o n 操作过程为：( 1 ) 微量进样器中预先吸入少量有机溶剂( 如甲苯) ；( 2 ) 拉动进样 器活塞缓慢吸入3 群品溶液，停留3s 使分析物与针筒内壁的有机液膜充分作用； ( 3 ) 将样品溶液缓慢推出，停留3s 后，重复该操作2 0 次。由于吸样过程使得原有机 溶液在针筒内壁形成了一层薄而均匀的有机液膜。分析物在水相和液膜中进行第一 次分配。当推出样品溶液时，已含有分析物的液膜重新与有机溶剂混合，再次吸入样 品液时，新的液膜又重新形成，分析物在水相和新的液膜中进行第二次分配。多次 重复操作，极大地提高了萃取效率，对于氯苯类化合物的富集倍数可高达2 7 倍，远 高于静态萃取( 1 2 倍) 。另外，通过注射泵辅助进样器活塞完成往复运动，还可以 提高分析的精密度。借助注射泵，k e 对水样中多环芳烃类化合物( n s ) 进行富集， 所得富集倍数大于2 8 0 倍，并且精密度也有所改善( r s d = 6 0 ) 【2 9 】。 对于挥发性和半挥发性化合物，j e a n n o t 提出了顶空单滴微萃取( h s s d m e ) 【3 0 1 ， 即将有机液滴悬于样品溶液的上方进行萃取。由于液滴悬空，因而允许样品溶液接 9 兰州大学博士学位论文 受高速搅拌，而液滴的稳定性丝毫不受影响。并且来自样品的基体干扰也大大减小。 此模式下，分析物在水相，顶空及有机溶液三相中进行分配，萃取速率决定于分析 物在水相的传质速率【3 0 】。因此，对样品溶液进行高速搅拌十分有利于提高萃取效 率。但同时，顶空单滴微萃取要求萃取溶剂应具有较低的蒸汽压，这恰与适合g c 要 求的溶剂应具有较高蒸汽压相矛盾，因此，在h s s d m e 中，选择合适的溶剂成为一 个主要问题。 为了克服h s s d m e