疗药物对微波消融肝肿瘤的增敏作用.pdf

中国人民解放军军医进修学院博士学位论文瘤内注射化疗药物对微波消融肝肿瘤的增敏作用姓名：冯蕾申请学位级别：博士专业：影像医学与核医学指导教师：董宝玮;梁萍20060526军医进修学院研究生学位论文原创性声明秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新”的学风，本人声明：所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其它个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其它教育机构的学位及证书而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：塞蓖日期：砧叶一“指导教师签名：访牵醐：蟊叶一形l军医进修学院研究生学位论文版权使用授权书论文作者签名掌毛日期“指导教师签名5 瓤略醐哪叶一“军医进修学院博士学位论文英文缩写词表军医进修学院博士学位论文瘤内注射化疗药物对微波消融肝肿瘤的增敏作用中文摘要目的应用微波消融治疗肝癌已经取得了突出疗效，然而对于较大肿瘤( 如 3 c m ) 要达到一次原位适形灭活仍有相当难度本研究的目的是应用肿瘤内注射化疗药物后行微波治疗，旨在对微波消融增敏，以实现对较大肿瘤的一次原位适形灭活材料与方法第一部分兔肝v x 2 肿瘤模型的建立1 开腹直视下建立兔肝v x 2 肿瘤模型：新西兰大白兔9 只，开腹暴露肝脏后将2 4 个肿瘤组织块埋植在兔肝左，右叶，于接种后1 7 d 行超声检查，同期剖腹现察肿瘤接种情况，肿瘤生长特点及并发症等；2 超声引导下建立兔肝v x 。肿瘤模型：新西兰大白兔4 0 只，于超声引导下将2 4 个肿瘤组织块接种在兔肝左，右叶，于接种后2 0 一3 6 d 行超声检查，同期剖腹观察肿瘤接种情况肿瘤生长特点及并发症等；3 两种建立模型方法的比较：取上述两组中接种后在同一时期观察的新西兰大白兔各9 只，比较两组肿瘤原位接种成功率生长特点及并发症等情况；其中3 只兔4 个肿瘤结节行超声造影检查第二部分瘤内注射化疗药物对微波消融肝肿瘤的增敏作用1 肿瘤内注射蒸馏水对微波消融范围的影响：新西兰大白兔7 只共1 0 个肝v x ：肿瘤结节，随机分至微波组及肿瘤内注射蒸馏水后行微波组两组( 每组5 个结节) 蒸馏水体积0 5 m l ；微波辐射功率5 w ，作用时间1 8 0 s 比较治疗后4 8 h 肿瘤消融范围；标本行病理检查2 肿瘤内注射化疗药物顺铂对微波消融肝肿瘤的增敏作用：新西兰大白兔2 7 只共4 0 个肝v x ：肿瘤结节随机分至微波组，瘤内注射顺铂组，瘤内注射碘油组，瘤内注射碘油后行微波组瘤内注射顺铂水溶液后行微渡组、瘤内注射以碘油溶解的顺铂组，瘤内注射以碘油溶解的顺铂后行微波组及未治疗组( 每组5 个结节) 以上各组碘油及蒸馏水体积均为2军医进修学院博士学位论文o 5 m l ；顺铂1 5 m g ，溶于蒸馏水或碘油内；微波辐射功率5 w ，作用时间1 8 0 s 比较上述8 组治疗后4 8 h 肿瘤灭活范围；标本行病理检查第三部分微波，碘油及顺铂诱导兔肝v x ：肿瘤细胞凋亡的初步研究第二部分中微波组，碘油组，顺铂组及未治疗组的1 4 只新西兰大白兔共2 0 个肝内v x 2 肿瘤结节，应用t u n e l 技术检测治疗后4 8 h 残癌区肿瘤细胞凋亡指数，分别比较三种治疗方法与未治疗组肿瘤细胞凋亡指数。结果第一部分开腹直视下肿瘤组织决肝内埋植接种方法原位接种成功率异位种植率分别为6 7 j l ( 1 2 1 8 ) 、2 5 ( 4 1 6 ) ，接种后1 8 1 9 d 肿瘤大小为( 1 3x1 1 ) c m ，肿瘤接种时间约为2 0 一3 0 m i n ，原位接种成功率与接种部位无关；超声引导下肿瘤组织块肝内埋植接种方法原位接种成功率，异位种植率分别为5 3 一7 6 j i ( 1 6 3 0 3 8 5 0 ) ，1 4 j 6 2 0 j i ( 6 4 4 4 2 0 ) ，接种后2 l 一2 2 d 肿瘤大小为( o 7 x 0 5 ) c m ，接种后3 1 3 8 d 肿瘤大小约为( 1 5x 1 3 ) c m ，接种时间约为1 2 4 0 m i n ，原位接种成功率与接种部位无关；两种接种方法原位接种成功率及异位种植率无统计学差别( 前者p _ o 3 2 ；后者肚0 6 2 ) ，接种后1 8 1 9 d 开腹组肿瘤长径及短径较接种后2 1 2 2 d 超声引导组大( p 均等于o 0 0 0 1 ) ，两种接种方法左，右叶接种成功率无差别( 前者p - o 6 2 ；后者p = o 6 4 ) ，超声造影检查可清晰显示肿瘤，开腹组手术后可出现腹壁切口疝，腹壁伤口感染及愈合不良腹腔粘连等并发症，而超声引导组可选择肿瘤接种部位，手术后可出现腹腔出血等并发症第二部分微波组及肿瘤内注射蒸馏水后行微波组二组消融范围分别为( 8 2 3 5 士4 3 1 ) 衄2 ( 8 7 4 9 6 5 7 ) 珊2 ，无统计学差别( p ；0 1 8 ) ；与未治疗组相比，微波，碘油及顺铂均可引起不同程度的肿瘤坏死( p 值均 o 0 0 0 1 ) ，肿瘤灭活范围分别为( 8 2 3 5 4 3 1 ) 岫2 、( 1 5 5 9 土1 2 8 ) m m 2 ( 2 3 2 7 士3 9 6 )衄f ：肿瘤内注射碘油后行微波组肿瘤灭活范围为( 8 0 4 0 4 1 6 ) 衄2 ，碘油不能对微波增敏( p = o 4 1 ) ：肿瘤内注射以碘油溶解的顺铂肿瘤灭活范围为( 3 8 6 7 4 0 6 ) 加f ，碘油可使顺铂增敏( p o 0 0 0 1 ) ；肿瘤内注射顺铂水溶液后行微波组肿瘤灭活范围为( 1 4 5 。1 3 7 0 0 ) 咖2 ，顺铂可对微波增敏( p o 0 0 0 1 ) ；肿瘤内注射以碘油溶解的顺铂后行微波组肿瘤灭活范围为3军医进修学院博士学位论文( 1 6 5 3 0 5 0 8 ) 衄2 ，碘油溶解的顺铂也可使微波增敏( 肛o 0 1 4 1 ) 第三部分微波，碘油及顺铂均可诱导兔肝v x ：肿瘤细胞凋亡( p 值分别为 o 0 0 0 1 ，( o 0 0 1 及0 0 0 1 4 ) 结论1 。开腹直视下接种方法适用于无需开腹治疗方法的实验研究，而且肿瘤生长速度快、研究周期短。超声引导下接种方法适用于需开腹治疗方法的实验研究，该方法可以选择接种部位，尤其适用于评价微波、射频等局部热疗疗效的实验研究超声可以监测兔肝v 如肿瘤的成瘤过程，必要时可应用超声造影技术2 肿瘤内注射蒸馏水后行微波消融与单独微波消融相比，消融区范围有增加的趋势，但无统计学差异；微波碘油及化疗药均有不同程度的灭瘤作用；碘油不能使微波作用增敏；碘油可使顺铂作用增敏；以蒸馏水或碘油溶解的顺铂均可使微波作用增敏3 微波，碘油及顺铂可诱导兔肝v x ：肿瘤细胞凋亡。关键词v x ：肿瘤微波消融碘油化疗细胞凋亡4军医进修学院博士学位论文s e n s i t i z a 廿o no fm i c r o w a v ea b l a t i o nf o rh e p a t i ct u m o ri n d u c e db yi n t r a t i l m o r a lc h e m o t h e r a p 明6 cd 邝g si n j e c t i o na b s t r a c to b j t i v em i c r o w a v ea b l a t i o nt l l 唧y 细h 印a i i ct 吼阱h 鹄a c h j e v c ds a t i s f a c c o r y 缸e a 仃n e m s p o n s 镐h o w e v e f ，i ti sd i 佑训tt o 啪d i c a t ct i l m o 体b i g g e ft l l 锄3 锄i ns i t i l 舭dc m f - o n n a b l ya to n e 蜘k e 1 ba c i l i e v et h i sa i l n ，i n t 瑚血瑚1 砸ic h 锄o t h 唧a m cd m g si n j e c t i o nw 器1 l s c dt os e l l s i t i z eh e p a t i ct l l m o rt ol i l i c m w a v ei b l a t i m 嗤r e r i a l sa n dm e t h o d sp a r ti1 e s t a b l i s l 蚰e n to f r a b b i t l i 埘v x 2t 呦o rm o d c lb yt l l ec o d i o t o n 够n 硫n 州z 翰l a n dw t l i t cr a b b i 乜w e i m p l ；m t e dw i 也v x 2t 啪0 ri nt w ol i v e rl o b 鹤b yt l l ec o d i o 劬y u l n a u n de x 锄i i i a t i o 嬲w e 坞p i 桷皿o d1 7d a y sa r 日i m p la i ，_ t a l i o l l a tt l l cs 锄e 石m e 髓p l o r a _ t o i yl 印a f o t o i i l yw 嬲p a 晌肋e dt oo b s e r v et l l e 豫湖t so fi l n p l 锄觚o i l t h cf 缸u r eo ft 嘶0 r 鲥) w t l l a i l d啪p l i c a t i o n s 2 e s t a b l i s l l l i l e n to fr a b b i tl i v e rv x 2t l 】i n o fm o d e l 珊d 盯u l t r a 鲫蚴d 鲥d 锄c ep 彻t a i l c o 璐l y ：4 0n 哪z l a n dw l l i t cr a b b i t s 、v e 坞i i i l p l 锄t e dw i t hv x 2t 1 1 m o ri l i 铆ol i v e rl o b 锝岫d e ru l t r a s o u n dg 吐i d a l l o e u 1 妇m l de x 枷删o n sw e r ep 盯f o 莉e d2 m 弓6d a ) 唔a f i e ri n l p i a n 协畦o l la tl l l es 锄et i i n ec x p l 讲a t o 哆l a p a r o t o m yw 鹋讲赶o i m e dt oo b s e r v et l l er e l t so fi 1 i l p l a n t a t i o i l ，t h ef c a t i eo f t i l l n o rg w t l l ，觚dc o n l p l i t i o 邶3 c 锄p a r i s 蚰b e t 、) l ，nm et w om e i l l o d s ：t h e 胞；l l l t so fl l l ei l n p l a n t a t i o i l ，m eo f 咖0 r 舯w n l ，锄dc o m p l i c a l i o mw e 犯c o m p a r c db e 呐e e l lt 、w掣o u p s c 伽删s o n o 舯p h yw 鹤p 盯f o 肋o di n3r a _ b b i 协w i t h4t i n n o 埽p a r t 1 t od e t e 姗i i l l ew h e i l 埘i 廊锄瑚。船ld i s t i l l e dw a 旧蜘。c t i o n 如l l o w 。db y5军医进修学院博士学位论文m i c m w a v ea b l a t i o nc 柚i n a r c a s ea b l a t i o na r 它a ：s e v e nn e wz e a l 觚dw l l i t cf a b b i t s 、i t l l1 0t l h n o r sw e r et r t 斌e dw i m ( 1 ) m i c i o w a v ea b l a t i o na l e( o u l p u tp o w 5 w ；石m e ，1 8 0 s ) ；( 2 ) i n 仃a 锄o r a l 坷e c t i o fd i s t i l l e dw a t 盯( v o l 啪e ，o 5 m i ) i 栅c d i a t e l yf o l l o w e db ym i 啪w a v ea b l a l i o n p a t h o l 晒c镊锄i n a t i o n 锄dt l l e 玎；s l l l t a n tt i l m o rd e s 仇l c d 锄丘o me a c h 乜a 劬蹦tw e f ee v a l u a t c d 2 t od a 缸i l l i n ew h 酣埘i n 仃a 乱酬c h 锄o t l l e r a p u t i cd n l g 蜘e c t i c 姐s s i 石z ev x 2t 哪0 rt ol i l i c w a v ca b l a t i ：2 7n e wz l a i l dw l l i t cm b b i t sw i l l l4 0t i l m o r s 删e dw i m ( a ) m i c m w a v ea b l a t i o na l o n e ( o l 啦m tp o w e r ，萝w ；t i m e ，1 8 0 s ) ；( b ) i n 打d f 啪o r a lc i s p l a t i l ld i s l v 。d 抽t 0d i s t 诅l e dw a t 盱i n j e c t i o na l o ( v o l u m c o 5i n l ；t o t a ld o s e ，1 5 m 曲；( c ) i n 廿a t l 瑚o r a lu l 昀- n u i dl i p i o d o l蜘。c t i a 1 0 i l e ( v o l 啪e ，o 5m 1 ) ；( d ) i n o r a lc i s p i a t i nd i s l v c di n t ou l 仃a - n u i dl i p i o d 0 1 蝎c c t i o n ( v o l 啪e o 5m l ；t o t a ld o s e ，1 5 m 曲；( e )1 1 l 恤- f l u i dl i p i o d 0 1i n j e c t i i 砌m 础a t d y 伽o w e db yi i l i c r o w a v ea b l a t i ；( dc i s p l a t h li n j e c t i o ni m m c d i a t e l yf o l l o w c db ym i c r o w 桃a b l a t i 叫( 曲i l l 仃a t i 】| n o f a ld s p la _ 妇d i s l v e di nl l l 婚日u i dl i p i o d o l 硒e c t i i i i 吼e d i a 坝yf o l l o w e db ym i c r o w a v ea b l a 吐o i l ；n o 锄咖吼t p a t h o l o 百ce x 锄i i l a t i a n dt i l en j s u l t a i l tt l h n o fd e s 雠u c t i o n 丘_ o me a c h 仃e a 恤e n tw e f e 酬u a t e d p a r t t 蛔o rc d l 删t o 畦ci n d i c 部i l l 重l l e 髑i d l l a lt i l m o ro fm ea 吒霉u u pi nm ec o n dp 疵w e r ec o i 印a r e dw i t ht l l a to fhg r o u p 陀s p e c t i v c i yb y 瑚i n gt u n e lt c “q u e r 髑u i 妇p a nit 哪o f s w e f e 飘l o c e s s f i l l l y i l n p l 勰硼i l l l 2 1 8 ( 6 7 坳i n m e g r o 印s b y m ec o e l i o t o m y ，诵t l lm ee c = t o p i ci m p l 柚t a t i 蛐m t 鼯o f4 1 6 ( 2 5 ) n 哪o fs i z ew 勰( 1 3 1 1 ) 咖1 跏1 9d a y s 雄e ri m p l 锄t a i t i o n t h ei n l p l a n 协矗o n6 m ew 勰a b o l l t2 0 v 3 0m i i l u t e s 1 、i l 觚s u c o 嘟舢yi i n p l 缸t e d 谢e d 丘锄1 6 3 0 ( 5 3 呦t o3 8 5 0( 7 6 叼i nt l l eg r o l l p s 吼d e rl l l t r a s o u n dg u i d a l l c e ，w i l l lt l l ee c b 叩i ch p l 锄t 撕m t 韶舶m1 4 ( 6 4 4 ) t o2 5 ( 4 1 6 ) 1 恤1 0 rs i z ew 鹤( o 7 o 5 ) c i n2 1 2 2d a y s6军医进修学院博士学位论文蛆盯i n l p l 粕t a t i 叽狮d ( 1 5 1 3 ) 锄3 l 一3 8d a y s 姐e fi l l l p l 锄o n 髓ei m p l a n t a t i o nt i m ew 勰a b l o u t1 2 4 0l i l i n u t 嚣t h e r ew e r e s i g i l i f i c a l l td i 丘确l c 鹤b 婀嘲it w dg r o u p si l lt l l e 鲫c c 鹤s f h l l yi l ls i t i la 1 1 de c i o p i ci m p l a n t a t i o nr a i e 他e细n 辟o 3 2 ；t l 地l a t p ：o 6 2 ) 1 n h el o n 百t i l d i n a l 觚dm e 咖s v e f a x i so ft i l m o 搀i l lt l l e 掣o u pb yt h ec o d i o t o m y1 s 1 9d a y sa f i e f 妇p i 孤删o nw e r cb i g g e rt l l 锄t l l o 蚰d e fu l 嘞啪dg i l i d 锄c c2 l 砣2d a y sa f t e ri m p l 雅t a t i o nr e s p e c t i v e l yo = o o o o lc h ) n c f cw 勰s i 鲥f i c 觚td i 胁l c ei nm es u c c 器s 如l卸l a n t a t i o nf a l eo ft l i el e f tm l dr i g h tl o b eb e 呻咖t l l e 伽og r o l l p s c o n 删s o n o j 昏r a p h y 啪s h o wt i 】m o fd i s t i l l c t l y c o d i o a d h 髂i o 船，w n di n 侥c t i o ni l l如d o m i 衄1w a j l sa n di n d s i 伽mh e f n i aw e o f i s 。mm eg m l 巾b yl l l ec o e l i 咖m y w h e f e 鹤i l i l p l 甜也砸a r 龃咖b ec ：h o s a n dc c l i a cb l o c d i n gc a nb es o e ni l lt 1 1 e 粤u 叩埘1 d e fu 1 打勰d u n dg u i d a i l o e p a r t c o a g l l l 撕a 玎龃i n d u 硎b ym e 饥神咖to fi n 咖o r a ld i s t i l l c dw 栅i 坷e c t i o ni m m e d i a t d yf o l l o w e db yl i l i c m w a v ea _ b l a t i w 鹞( 8 7 4 9 士6 5 7 ) n l m 2 ，w 雠e l a to fl i l i c 卿a v ca b l a t i 蛳a l ew a s ( 8 2 3 5 士4 3 1 ) l i l m 2口= 0 1 8 ) ；c 锄p a r 甜w i t h l e 伊唧o f 蛐e 峨m i c f o w a v ea b l a t i o i l ，i i i 峨i t i m i o r a ll i p i o d o l 侧e c t i o n ，锄di n 恤曲哪o r a lc i s p l 舳岫e c t i o n 啪d e s 砸1 c tt l l e t i l m 饥；锄d t h e d 舒t m c 矗o n 蝴w 勰( 8 2 3 5 4 3 1 ) l n l n 2 、( 1 5 5 9 1 2 8 ) m l n 2 、( 2 3 2 7 3 9 6 ) n 锄2 础删v d y 口 o 0 0 0 1 c h ) c i s p l a t i nw h 砷w 盱d i s l v e di nd i s t i l l 。dw a t 盯o rl i p i o d o lc o u i ds e 岫m z en l m o rt om i c w a v ea b l 雠i o i l w h i kl i p i o d o lo o u l dn o t( p o o 0 0 1 ，p o 0 0 0 l ，a n dp = o 4 l 础恻i v d y ) 1 kd e s 咖c t i 绷w 鹤( 1 4 5 1 3 士7 o o ) m 1 2 ，( 1 6 5 3 0 士5 0 8 ) m m 2 ，锄d ( 8 0 4 q 斟1 6 )删n zr e ：s i c c 虹v e ly “p i o d o l 啪s e 璐i 6 z et i n n o ft oc i s p l 地锄dl h ed e s m l c t i o n绷w 勰( 3 8 6 7 “0 6 ) 删伊 o 0 0 0 1 ) p a r t c o n l p 鲫c dw i mt 1 1 e 粤m l po f n o 心蜘e n t ，t i l m o ro e l la l 0 p t o t i ci l l d i c c sm 嘲s e ds i 鲈i f i 啪t l yi nt l l eg r o l l p so f m i c f o w a v ea b l a t i o l l ，l i p i o d o l ，锄dc i s p l a t i n心删v e l y ( p 5 0 ) 与瘤内局部注射化疗药物联合治疗肝癌，国外报导较少阴，国内未见报道，而其中微波消融与瘤内注射化疗药物联合应用国内外均未见报道，因此本研究应用瘤内注射化疗药物后行微波消融，旨在对微波增敏，以期进一步提高对较大肝肿瘤的治疗疗效。军医进修学院博士学位论文第一部分兔肝v x 2 肿瘤模型的建立引言瘤内注射化疗药物对微波消融的增敏作用需通过动物实验来判定。理想的动物肝癌模型应与人类的肝癌生物学行为相同或相近；造模成功率高而且动物损伤小、死亡率低；研究中可重复性好；造模方法简便易行，动物大小、体形等需适合于所做的病因、诊断、治疗的实验研究；所用方法对人体无害或较少危害，环境污染小动物性肝癌模型按照其肿瘤来源可分为自发性、诱发性及移植性肝癌模型。其中自发性肝癌在发生学上与人类肝癌相似，主要是反映动物的肿瘤易感性和环境致癌物质、促癌物质的积聚程度，多发生在近交系小鼠，发生的时间与比例和品系、性别、环境、饲养有关。其特点是发生率低且不稳定，发生时间较难预测且参差不齐，荷瘤动物个体在动物( 性别、体重、肿瘤发生时间等) 和肿瘤( 大小、数目、部位等) 两方面差异较大。目前多用于病因学研究和移植性肿瘤的瘤源。诱发性肝癌模型是指用化学、物理、生物的致癌因素作用于实验动物，形成肝癌，其中化学药物( 如氨基偶氮染料、芳香胺类化合物、亚硝胺和黄曲霉素等) 诱导法最常用。可以单用一种化学药物，也可用多种药物与不同的促癌剂、肝大部分切除等按不同的顺序组合成不同的综合诱发肝癌方案。其特点是诱导周期长( 3 5 个月，甚至1 也年) ，死亡率高达5 3 8 2 ，肝癌出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表现不均一。目前多用于肝癌病因学、发生学、发病机理、遗传及生物学特性的研究。移植性肝癌是指用肝癌( 源于动物或人) 移植到动物体内( 肝脏、肝外组织或器官) 或非肝脏来源的恶性肿瘤( 如乳腺癌【3 2 ) 、鳞癌【3 3 】、结直肠剖3 4 1 等)移植到动物的肝脏所形成的荷肝癌动物模型。瘤源可以是自发的、诱发的或人肝癌患者被切除的标本。受体动物多为裸小鼠、裸大鼠、大鼠、兔，其它动物如猪、犬则很少被采用，因为这两种动物移植型肝癌因排斥成功率低，难以成活。鼠类因为体型偏小，不适于且常常不能耐受介入治疗的实验研究，1 2军医进修学院博士学位论文而兔体型较大，较适合于肝肿瘤影像诊断及介入治疗的实验研究。兔的移植性肝癌动物模型常用的是兔肝v x 2 肿瘤模型。其瘤源v x 2 肿瘤细胞株起源于s h o 口c 病毒诱发的兔乳头状瘤衍生的鳞状上皮癌，经过7 2 次移植传代后正式建立株，命名为v x 21 3 5 ，3 6 1 。该肿瘤株建立于第二次世界大战前夕，由s i i l i l l l 和r o 璐等报告并获得承认由于兔缺乏针对该肿瘤的抗体，故可以接种在兔的肝脏、肾脏、肌肉和骨骼等处，具有接种简单、接种成功率高、实验周期短的特点，容易制成原位肿瘤动物模型1 3 7 ，姗。兔v x 2 肝肿瘤是目前国内最大动物的实验性肝癌模型【捌，是血供丰富的实体瘤，肿瘤内含有丰富的滋养血管，无明显的血窦腔，直径 2 o c m 的肿瘤中央常有较明显的坏死灶，肿块生长巨大时于瘤周可见卫星灶形成，因此类似人的肝细胞肝癌。同时，兔肝v x 2 肿瘤病理形态学表现为肝鳞状上皮癌，尽管与人肝细胞肝癌对化疗药物敏感性有一定区别，但不是本质性差别，二者对化疗的敏感程度大致相当，都属于中度敏感。因此，目前常将兔肝v x 2 模型用于肝癌肿瘤影像诊断学、抗癌药物的筛选、抗癌药物药代动力学和肿瘤介入治疗学的基础研究【柏啦l 。临床上常常应用开腹直视下将肿瘤组织块植入肝内的方法建立兔肝【2肿瘤模型。随着影像技术、尤其是影像引导下介入技术的迅速发展，我们提出在超声引导下经皮将肿瘤组织块种植在肝内的接种方法。目前影像引导下肿瘤组织块肝内种植法国外未见报道，国内报道较少【4 3 ，伽。在本部分研究中，我们应用开腹直视下及经皮超声引导下两种接种方法建立兔肝v x 2 肝癌模型，并且比较了两种建立模型的方法，进而总结出适于瘤内注射化疗药物对微波消融肝肿瘤增敏研究中的动物模型建立方法。1 3军医进修学院博士学位论文第一节开腹直视下兔肝内v x ：肿瘤接种方法应用较多的肝乜肿瘤接种方法有肿瘤细胞悬液种植、肿瘤组织块悬液种植及开腹直视下肝内肿瘤组织块埋植3 种方法。其中肿瘤细胞悬液、肿瘤组织块悬液种植在操作过程中由于悬液常常从注射针孔溢出引起异位种植导致种植失败，因此本研究选择开腹直视下兔肝内肿瘤组织块埋植的接种方法，观察其种植成功率、肿瘤生长特点及并发症等情况。材料与方法一、实验材料新西兰大白兔9 只，体重2 肚3 o k g ，雌雄不限。动物由解放军总医院实验动物中心提供。v ) ( 2 瘤株由解放军总医院骨科研究中心提供。明胶海绵( 南京金陵制药厂生产) 预先剪碎备用。兔麻醉用速眠新注射液( 长春军需大学兽医研究所生产) 肌肉内注射，剂量0 3 m ，同时应用地西泮o 5 m g ，l ( g肌肉内注射以加强麻醉。二、v x 2 肿瘤组织块制备将冻存v x 2 瘤株组织块按一般细胞培养技术1 复苏，将复苏的肿瘤组织块在无菌条件下剔除坏死组织及较大纤维组织后，剪切成小于1 0 i i l m 的碎块，用生理盐水清洗，然后与i u p m i - 1 6 4 0 培养液( 含5 的胎牛血清) 混合后装入注射器内，用1 8 号注射针头注入兔后腿外侧肌肉内，2 3 周后于接种部位可扪及实性包块。在无菌条件下取出肿瘤组织块，切取肿瘤包块边缘生长旺盛的鱼肉样组织，剔除坏死组织及较大纤维组织，剪成小组织碎块，用生理盐水反复清洗去除残留血液后，按常规组织冻存方法冻存在液氮中备用。接种前将冻存瘤块按一般细胞培养技术复苏后用眼科剪剪成小块，大小约o 5 i n m 0 5 姗o 5 i 呦，放于r p m i - 1 6 4 0 培养液中备用。三、实验方法( 一) 开腹直视下兔v x 2 肝内肿瘤模型的建立兔手术前禁食8 h 以上，麻醉成功后将兔固定在兔台上，备皮后常规消毒铺巾。于兔上腹部剑突下作1 4军医进修学院博士学位论文一正中纵行切口，长约4 c m 左右，逐层进入腹腔暴露肝脏后，将肝脏牵出体外，用眼科手术镊夹取一小块瘤块斜行穿入肝实质较厚处，沿隧道拔出眼科镊后，再次夹取i 一3 个瘤块沿原隧道轻轻放入肝内，每只兔均接种两个部位，肝左叶及右叶各一处，然后将明胶海绵l 2 块填塞并紧贴在肝表面伤口处。确认无活动性出血后将肝脏回纳入腹腔，腹腔内滴入庆大霉素8 万单位预防感染，逐层关腹。均于手术后给予青霉素4 0 万单位肌注，待兔清醒后送回动物房内兔笼观察。( 二) 模型成功判断方法于接种后1 7 d 无菌条件下剖腹暴露肝脏，观察接种部位有无肿瘤出现、肿瘤大小，然后穿刺活检取部分肿瘤组织送病理，以镜下见到浸润性癌巢证明接种成功。同时观察腹腔内大网膜及邻近脏器有无新生肿瘤、有无针道种植及腹膜种植。于剖腹后l 砣d 处死动物，完整取出整个肝脏，观察肝表面有无新生肿瘤出现，然后每隔o 孓l c m 切割肝脏，在断面上继续寻找有无新生肿瘤，同时观察腹腔内有无新生肿瘤及转移情况。四、超声仪器及肿瘤的超声监测采用a c u s o ns e q l 】o i a5 1 2 型超声仪( 配穿刺系统) ，6 l 3 探头，频率4 o 巧o m h z ，用于肿瘤组织穿刺活检；1 5 l 8 w 探头，频率8 肛1 3 。0 砌z ，用于肿瘤接种后观察肿瘤生长情况e s t e1 鼬n d u 8 超声仪，探头频率1 3 4 m h z ，用于肿瘤接种后观察肿瘤生长情况。于接种后7 d 、1 7 d 应用超声观察肝内接种肿瘤情况、有无针道种植、大网膜种植等异位种植情况发生以及腹腔内有无淋巴结转移。五、病理检查于剖腹探查后l 2 d 处死动物，完整取出肝脏，沿肿瘤中心剖开，测量肿瘤长径及短径。取肝脏新生肿瘤、腹腔内新生肿瘤及肿大淋巴结，用锄多聚甲醛溶液固定4 8 h 以上，石蜡包埋，连续5 “m 切片，h e 染色，光学显微镜观察。六、统计学方法统计学软件采用s t 啦7 o 。计量资料应用均数标准差( ；圭s ) 表示，计数资料应用率表示，两组率比较采用f i 出凹确切概率法。p o 0 5 差异有统计学意义。军医进修学院博士学位论文结果一、原位接种成功率及异位种植率肿瘤种植后，在肝内接种部位出现肿瘤结节生长，视为该肿瘤原位种植成功；肝内接种部位未出现肿瘤，在邻近肝脏的其它脏器、腹壁或腹腔内出现肿瘤生长者视为该接种肿瘤异位种植( 异位种植主要是由于接种肿瘤从接种部位逆出而引起) 。本组接种9 只兔1 8 个肿瘤，原位接种成功( 即在肝内接种部位出现肿瘤结节) 1 2 个，原位接种成功率6 7 ( 1 2 1 8 ) ；异位种植率2 5 ( 4 1 6 ) ，3 个异位在腹壁，1 个异位在大网膜，具体情况见表1 1 1 。表1 1 1 开腹直视下接种v x 2 肿瘤的生长情况二、肿瘤生长情况于剖腹后1 砣d 处死动物测量肿瘤大小，接种1 踮1 9 d 后肿瘤长径为1 扣1 8 c m ，平均为( 1 3 o 3 ) 伽；肿瘤短径为o 弦1 6 锄，平均为( 1 1 o 3 ) c m 。三、肿瘤接种时间接种时间是指每只兔麻醉成功后开始接种到两个部位均接种结束的一段时间。每只兔接种时间约为2 o r t i i n 。平均接种时问为( 2 6 5 ) m i n 。四、接种部位与肿瘤生长的关系本组9 只兔共接种1 8 个肿瘤，经病理证实接种后肝内出现1 2 个肿瘤，接种后左、右叶原位接种成功率分别为7 8 ( 7 丹) 、5 6 ( 5 9 ) ，经统计学检验分析，原位接种成功率与接种位置无关( p = 0 6 2 ) ，具体见表1 1 2 。1 6军医进修学院博士学位论文p ；o 6 2 ( f i s h 日确切概率法)五、并发症及转移1 只兔于手术后1 h 发现腹壁切口疝，疝内容物为肠管，肠管颜色正常，将其还纳回腹腔后逐层关腹，因发现及时，手术后兔恢复情况良好；1 只兔出现腹壁伤口感染，腹壁伤口愈合不良，感染深至肌层但并未达到腹腔，清创后抗感染治疗，恢复情况良好；9 只兔均有不同程度的腹腔粘连，其中2例粘连严重，分离困难。1 只兔伴腹腔淋巴结转移，于肝左叶旁可见1 枚肿大淋巴结，大小约( 1 2 o 9 ) 锄。六、病理结果大体观察：肿瘤在肝实质内呈灰白色鱼肉样结节状，无包膜，质地较硬，当结节较大时肿瘤剖面中心可见液化坏死，呈黄白色液体状物( 图1 1 1 ) 。在低倍光镜下可见肝内浸润性癌巢，呈多个境界清楚的圆形结节，癌巢与肝实质无明显边界，问质分界不清，结缔组织较少，瘤巢边缘分布着被浸润的肝索结构。肿瘤细胞弥散排列，可见纤维间隔，新生毛细血管丰富。高倍镜下见瘤细胞异型性明显，大小不等，形状不一，大多呈梭形或多角形，呈不规则排列。胞浆丰富，淡红染色。核肥大，其大小及形态各异，染色浓淡不均，核分裂像多见。问质内可见淋巴细胞、浆细胞浸润，可见实体样或假腺体样结构( 图1 1 - 2 ) 。讨论以往研究卅常常是制各种兔成功后从种兔取得肿瘤组织块后立即接种到兔肝内，但是我们认为这种方法比较适宜小批量建立肝癌模型。由于多次传代后的瘤株接种后出现的肿瘤会较早出现坏死且坏死明显、不同传代次1 7军医进修学院博士学位论文数的瘤株恶性程度不同可能会影响肿瘤种植成功率及生长速度，因此，在大批量建立模型且需要比较不同建模方法时，将种兔瘤株制备好后统一在液氮中冻存、接种前复苏应用更为适宜，而且冷冻保存可以避免频繁传代中肿瘤被污染和肿瘤细胞株连续体内传代产生的变异，并可节省人力、物力。目前文献报导肿瘤细胞悬液注射法原位接种成功率在2 0 9 红l o o ，肿瘤组织块肝内埋植法原位接种成功率在7 3 母5 。悬液注射接种方法因细胞悬液制备复杂，存在因接种时间过长、胰蛋白酶消化过度引起肿瘤细胞死亡导致接种失败的不足；注射过程中含瘤细胞的悬液不易局限于接种部位、容易由接种部位溢出，导致种植成功率低，也易发生腹腔转移和针道种植；所建模型常常是弥漫型肝癌且较早发生转移，实验动物的一般情况较早开始恶化，限制了其在研究中的应用；由于接种细胞数量远远少于接种瘤组织块，在早期肿瘤生长速度较慢。与悬液注射接种方法相比，开腹直视下瘤组织小块肝内埋植法保证了瘤细胞正常生长的浓度，组织块成为瘤细胞抵御机体免疫力的屏障，延缓了清除过程，增强了对新环境的适应能力，并可在肝内形成孤立性结节，增加了实验的可比性i 硼，而且肿瘤组织块肝内埋植法成瘤时间较悬液注射接种方法短f 4 6 ，4 7 ，4 9 1 。一般接种后两周左右肿瘤生长至o 8 3 o c i n ，接种3 周时肿瘤生长至1 5 巧0 c m 雏5 3 】。在本组实验研究中，采用肿瘤组织块肝内埋植法原位接种成功率6 7 ，接种后1 如1 9 d 肿瘤大小约1 2 1 8 c m 。可以看出，即使都采用肿瘤组织块肝内埋植这一接种方法，原位接种成功率及成瘤时间各家报导也有很大差别，结合我们自身的体会，认为这可能与接种肿瘤组织块的活力、数量及接种经验有关。为了提高原位接种成功率，在接种过程中应注意以下几点：( 1 ) 从种兔后腿肌肉内取肿瘤组织制备瘤株时，取材要选取肿瘤边缘生长旺盛的部位，当肿瘤较大时，肿瘤与周围肌肉组织分界不清，注意此时不要误取到肌肉组织，一般来讲，肌肉组织质地较生长旺盛的肿瘤组织软；取到的瘤组织块应用生理盐水反复清洗去除残留血液，并剔除坏死组织及较大纤维组织。( 2 )在取材、修剪及接种过程中，要注意无菌原则，避免感染导致接种失败。( 3 )将瘤组织小块塞入肝脏后，应以明胶海绵填塞并紧贴在肝表面伤口处。此时明胶海绵不仅能起到止血的作用，而且还可以避免瘤块逆出造成腹腔或腹壁1 8军医进修学院博士学位论文种植。( 4 ) 接种过程中要维持适当的麻醉深度，力求麻醉平稳。在关腹前如果麻醉状态浅，缝合腹膜时由于牵拉痛兔反射性腹压加大，肠管易鼓出体外，此时瘤块可能会由于腹压加大从隧道中挤出或在回纳肠管时肝伤口表面明胶海绵蹭落，从而造成大网膜或腹壁种植。( 5 ) 手术过程中避免瘤块接触非接种部位，避免异位种植出现。( 6 ) 肿瘤组织块大小及数目尽量一致，接种深度大致相仿，这样肝内生长的v x 2 肿瘤结节大小较一致，能增加实验的可比性。开腹直视下肿瘤组织块肝内埋植法常见的并发症是腹腔粘连、手术后腹壁伤口感染、愈合不良及腹壁切口疝等。手术后在关腹时缝合不当可能会形成腹壁切口疝；手术后在伤口未愈合前行超声检查，伤口不仅限制扫查范围，而且未消毒的耦合剂容易引起伤口感染、愈合不良；手术后腹壁切口无法覆盖敷料，兔舔咬伤口易导致伤口感染；伤口愈合后瘢痕组织后方的声衰减，常常影响超声观察肝内情况；更为严重的是，开腹接种方法9 只兔全部出现了程度不同的腹腔粘连，2 只粘连严重者二次手术进入腹腔相当困难，这直接影响了肿瘤接种成功后的进一步治疗问题。结论1 应用开腹直视下肿瘤组织块肝内埋植法可成功建立兔肝癌模型。本组实验研究中，该方法原位接种成功率为6 7 ，异位种植率为2 5 ，异位种植常常发生在腹壁皮下种植针道及大网膜，原位接种成功率与接种部位无关。接种后l 耻1 9 d 肿瘤大小约( 1 3 1 1 ) 锄。接种后可以出现腹壁切口疝、腹壁伤口感染、愈合不良及腹腔粘连等并发症。2 开腹接种法手术后出现程度不同的腹腔粘连，可造成二次手术进入腹腔困难。因此这种建模方法适于模型建立成功后采用不开腹进行的治疗方法( 如经股动脉肝动脉栓塞等) 。当需开腹进行治疗时，应寻找其它更适宜的建模方法。1 9军医进修学院博士学位论文第二节超声引导下经皮免肝内v x ：肿瘤接种方法由本部分上一节的研究中我们可知，开腹直视下肿瘤组织块肝内埋植法接种肿瘤后常常出现程度不同的腹腔粘连，造成二次开腹进行肿瘤治疗时出现进入腹腔困难，费时费力。为了解决这一闯题，我们考虑到采用无需开腹的接种方法。目前无需开腹的接种方法有肿瘤细胞悬液注射法、肿瘤组织块悬液注射法，但是这两种方法较易引起异位种植、形成模型常为弥漫型肝癌，因此有必要寻找一种新的、无需开腹的模型建立方法。目前，超声引导下经皮穿刺技术经过4 0 年的发展，已成为临床上一种重要的诊断治疗手段。超声引导下肝穿刺技术成熟，安全可靠，无严重并发症。在这一基础上，我们提出在超声引导下经皮穿刺将肿瘤组织块种植在肝内这一新的接种方法。本节研究观察了这种接种方法的种植成功率、肿瘤生长特点及并发症等情况。材料与方法一、实验材料新西兰大白兔4 0 只，体重2 o k g ，雌雄不限。动物由解放军总医院实验动物中心提供。接种用针具采用1 8 g 引导针，针芯改制。选择与引导针内径匹配但长于引导针的针芯，将其前方针尖及部分针杆钳断，其长度以完全放入引导针后较引导针长o 5 c m 左右为宜，然后将断端磨平，平头针芯即改制成功( 图l - 2 1 ) 。明胶海绵( 南京金陵制药厂生产) 预先剪碎备用，每块大小约1 咖l 衄l 衄。其余同本部分第一节。二、v x 2 肿瘤组织块制备同本部分第一节。三、实验方法( 一) 超声引导下兔v x 2 肝内肿瘤模型的建立兔手术前禁食8 h 以上，麻醉成功后将兔固定在兔台上，备皮后超声检查兔肝，选择肝实质较厚且远离血管及重要脏器处为接种部位。碘伏消毒后铺巾，然后在超声引导下经皮穿刺接种肿瘤。将剪碎的明胶海绵l 2 块用平头针芯推入引导针内5 咖左军医进修学院博士学位论文右，然后取剪碎的2 4 个瘤块紧随其后放入针鞘内，再将明胶海绵1 2 块紧塞其后( 在塞入瘤块后如针尾内有残存培养液，可用明胶海绵或滤纸吸去，否则最后塞入的明胶海绵变湿后会造成推入困难) ，用平头针芯将三者推至近针鞘针尖处约1c i l l ；然后用尖刀切皮，在超声引导下将引导针插入到预定部位，用平头针芯将瘤块及明胶海绵继续推入到预定部位，当上述瘤块及明胶海绵由针芯进入肝脏时手术者会有落空( 突破) 感，同时超声可以看到在预定部位出现一强回声团( 为瘤块、明胶海绵及空气混合物，见图1 2 - 2 ) 确定接种成功后拔针，局部压迫片刻。每只兔均接种两个部位，肝左叶及右叶各一处；均于手术后给予青霉素4 0 万单位肌注，待兔清醒后送回动物房内兔笼观察。( 二) 模型成功判断方法于接种后2 0 d 或3 肌3 6 d 无菌条件下剖腹暴露肝脏。其余同本部分第一节四、超声仪器及肿瘤的超声监测采用a c ：i i s s e q l | o i a5 1 2 型超声仪( 配穿刺系统) ，6 l 3 探头，频率4 o 6 o m h z ，用于超声引导下接种肿瘤及肿瘤组织穿刺活检；1 5 l 8 w 探头，频率8 肌1 3 o m h z ，用于肿瘤接种后观察肿瘤生长情况。e s 鲫t et 。c h n o sd u 8超声仪，探头频率1 3 卅m h z ，用于肿瘤接种后观察肿瘤生长情况。于接种后7 d 、2 0 d 、3 6 d 应用超声观察肝内接种肿瘤情况、有无针道种植、大网膜种植等异位种植情况发生以及腹腔内有无淋巴结转移。五、病理检查同本部分第一节。六、统计学方法统计学软件采用s 胁7 o 。计量资料应用均数标准差( x 土s ) 表示。计数资料应用率表示，两组率的比较采用f 检验。p o 0 5 差异有统计学意义。结果一、原位接种成功率及异位种植率本组在实验早期摸索技术要领时，共接种1 5 只兔3 0 个肿瘤，原位接种成功( 即在肝内接种部位出现肿瘤结节) 1 6 个，原位接种成功率5 3 ( 1 6 ，3 0 ) ；军医进修学院博士学