菌株的选育及液体发酵工艺优化研究.pdf

陕西科技大学 硕士学位论文 纳豆激酶高产菌株的选育及液体发酵工艺优化研究 姓名：桂丽 申请学位级别：硕士 专业：生物工程 指导教师：齐香君 20070501 纳豆激酶高产菌株的选育及液体发酵工艺优化研究 摘要 纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ，n k ) 是由纳豆芽孢杆菌 b a c i l l 淞s u b t i l i s ( n a t t o v a t ) 分泌产生的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸碱性蛋白酶。n k 的纤溶 机制为：直接作用于交联纤维蛋白，对纤维蛋白原不敏感，不易引起出血 倾向：能够激活体内t - p a ，可以温和、持续的发挥纤溶作用；n k 可水 解纤溶酶原激活剂的l 型抑制剂( p a i 1 ) ，使其失活，p a l 1 的失活可直接使纤 溶作用增强。与目前临床上常用的血栓治疗药物链激酶( s k ) 、尿激酶( u - p a ) 、 组织型纤溶酶原激活剂( t - p a ) 等相比，纳豆激酶具有溶栓效果明显；不易引 起出血，安全性能好；能抗胰酶水解，经消化道吸收，不被破坏等优点。因 此，将纳豆激酶开发成新型口服溶栓药将具有广泛的市场前景。 本研究采用诱变育种的方法选育纳豆激酶高产菌株；以紫外、微波为单 因素分别对出发菌株b n 3 4 6 进行诱变，确定紫外诱变的最佳条件为4 0 w 紫外 灯、3 0 c m 照射时间2 0 s ，此条件下致死率为9 8 4 、突变率0 7 ，该条件下 诱变得到正突变株y s b n 8 、y s b n 3 6 2 ；微波诱变最佳条件为菌悬液浓度1 0 4 个，m l ，作用时间5 秒，此时致死率为9 9 2 ，突变率为2 5 ，该条件下得到 正突变株y s b n 4 l l 、y s b n 4 6 7 、y s b n 4 8 4 ，y s b n 4 9 7 。相同培养条件下测 得上述六突变株的产酶活性分别为出发菌株的1 2 8 、1 3 0 、11 8 7 ， 1 8 4 7 ，1 4 3 3 和1 2 4 1 ，其中y s b n 4 6 7 的固体发酵产酶活性为2 2 0 0 i u g ， 是出发菌株的1 8 4 倍；对其连续传代五次考察产酶能力差异，结果证明其遗 传性状稳定。同时，实验还研究了诱变菌株的筛选方法牛奶琼脂板法， 该法在诱变选育纳豆菌时能够大大减少工作量，科学可行。 实验还对琼脂粉纤维蛋白平板法、纤维蛋白平板法、琼脂糖纤维蛋白 平板法测定纳豆激酶活性的特点进行了比较研究；确定采用琼脂粉纤维蛋 白平板法测定纳豆激酶活性；该法具有溶圈明显、易于测量、机械强度好、 操作简便、成本低等优点，适用于纳豆菌的选育及纳豆激酶发酵工艺优化中 对纳豆激酶的测定，通过实验确定该法的具体操作为：琼脂粉纤维蛋白 平板法i ：将自制纤维蛋白原溶液与1 2 琼脂粉溶液分别置于5 5 水浴中恒 温1 5 m i n ，等体积混合，迅速摇匀后倒平板，每板中倒入1 5 m l ：琼脂粉 纤维蛋白平板法i i ：将自制纤维蛋白原溶液与等体积1 2 琼脂粉溶液混合， 共热至沸，倒板。测定酶活的条件：取酶液1 0 9 l 点板，2 5 ，放置1 6 h ，测 量溶圈的垂直直径并以直径积表示溶圈面积。实验确定该法的测定下限为 5 5 i u i n i ，精确测定范围为3 2 6 6 2 2 0 0 ( i u m l ) 。 本实验研究了突变菌株y s b n 4 6 7 的最适液体发酵产酶条件，单因素考 察后设计正交试验，确定了该菌株的最适摇床发酵条件为：麦芽糖l ，大 豆蛋白胨2 ，c a c l 2 ，k 2 h p 0 4 ，k h 2 p 0 4 各0 0 2 ；接种量4 ，温度为3 0 ， 初始p h 为6 5 ，培养基装液量为2 0 m l ( 1 0 0 m l 三角瓶) ，接种量4 ，摇 床转速为1 2 0 r r a i n 。在最适摇床发酵条件下，y s b n 4 6 7 液体发酵产酶活性 为1 2 3 2 i i ，m i ，。 关键词：纳豆激酶，纳豆菌，诱变育种，牛奶琼脂板菌株筛选法，琼脂粉 纤维蛋白板酶活测定法，液体发酵。 i i s t u d i e st ot h eb r e e d i n go f 别c 豇三h 孓n a t t o a n di t sl i q u i d - f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n a b s t r s c t n a t t o k i n a s e ( a l s on a m e da sn k ) i sap o t e n tf i b r i n o l y t i ce l l z y m e m a n y r e s e a r c h e r sp r o v i d e dr e p o r t so nt h ef i b i n o l y t i cf u n c t i o no fi t s u m ie ta 1 f u r t h e r l e m o n s w a t e dt h a to r a la d m i n i s t r a t i o i no fn a t t o k i n a s e c a p s u l e se n h a n c e d f i b r i n o l y s i si nc a n i n ep l a s m ai na ne x p e r i m e n t a lt h r o m b u s i sm o d e l n a t t o k i n a s e s h o w e sf o u rt i m e sg r e a t e rf i f i b r i n o l y t i ca c t i v i t yt h a np l a s m i n m o r e o v e r , s o m e f i b r i n o l y t i ca c t i v i t yw a sr e t a i n e di nt h eb l o o df o rm o r et h a n3 h a st ot h e f i b r i n o l y t i cm e c h a n i s mo fn a t t o k i n a s e ，t h ee r l z y m ew a sr e p o r t e dn o to n l yt o p o s s e sp l a s m i n o g e na c t i v a t o ra c t i v i t y ，b u ta l s ot od i r e c t l yd i g e s tf i b r i nb yl i m i t e d p r o t e o l y s i s c o m p a r e dt ot h ec o m h l o nm e d i c i n es u c ha ss k 、u k 、t p a 、a p s a c e | a 1 ，n ki sm o r es a f e rt oi k q ea n de a s i e rt og e t s ot h er e s e a r c ht ot h e1 1 s e m c n to f n ki l lb o t hf o o da n dm e d i c a li n d u s t yi so fg r e a ti m p o r t a n c e 、色t a k et h eu l t r a v i o l e tr a ya n dm i c r o w a v et ot r e a tt h ej u n i o rs t r a i nb n 3 ”6 ( w h o s ea c t i v i t yo f n kp r o d u c i n go nn a t t oi s1 2 0 0 i u g ) a n dc o n f i r mt h eb e s t s i t u a t i o no ft h e mw o r k i n gs e p a r e t e l y t h eb e s tc o n d i t o nt ou s et h eu l t r a v i o l e tr a y i st ot r e a tw i t ht h ep o w e r4 0 w ，3 0 c mo ft h ed i s t a n c ea n do ft h et i m e2 0 s i nt h i s c o n d i t o n ，t h ed e a t h r a t ei s9 8 3 a n dt h em u t a n t - r a t ei s0 7 ，a n dw eg e tt w o m u t a n t - s t r a i n sn a m e dy s b n 8a n dy s b n 2 6 2 t h eb e s tc o n d i t i o nf o rm i c r o w a v e i sw i t ht h ep o w e r 7 0 0 wa n dt h ef r e q u e n t m e n t2 4 5 0 m h z ，5 s0 f t h et r e a t t i m ea n d 1 0 m lo ft h ec o n c e n t r a t i o n u n d e rt h ec o n d i t i o nt h ed e a t h - r a t ei s9 9 2 a n dt h e m u t a n t - r a t ei s2 5 ，a n dw eg e tf o u r m u t a n t - s t r a i n sn a m e dy s b n 4 l l 、 y s b n 4 6 7 、y s b n 4 8 4 、y s b n 4 9 7 w bc o m p a r et h ea c t i v i t yo ft h es i x m u t a n t - s t r a i n sa n dt h ei t m i o rs t r a i n ，a n dt h e i ra c t i v i t ya r eo f1 2 8 、1 3 0 、 1 1 8 7 ，1 8 4 7 ，1 4 3 3 、1 2 4 1 a st h ej u n i o ro n e t h e a c t i v i t yo f s o l i d - f e r m e n t a t i o no f y s b n 4 6 7r e a c h e s2 2 0 0 hj m i ，( w h i c hi s1 8 4t i m e sa st h e j u n i o rs t r a i n ) a n di t sc h a r a c t o rh a sb e e np r o v e ds t e a d yb yf i v et i m e sc o n t i n i o u s l y p l a n t e d w ba l s oc o m p a r e dt h er e l a t i o n s h i po ft h es t r a i n sc o n f i g u r a t i o na n di t s c a p a b i l i t yt op r o d u c en k a n dc o n f i r mt h a tt h es t r a i no fb e r e rc a p a b i l i t ym u s t w i t ht h ec h a t a c t o ro fb e i n gl o n gi nc e l l f o r m ，a n dt h ec e l l sa g eo fl o n gc h a i n s i w i t hj u s tal i t t l es p o r e s m e a n w i l e ，w er e s e a r c h e dt h em e t h o du s e di ns t r a i n s c r e e n i n go f m u t a n t - b r e e d i n g - 刈i l k a g a r - p l a t em e t h o d ，a n di tc a l lg r e a t l yc u t d o w nt h ew o r k m e n tw i t hi t sc h a t a c t o rs c i e n t i t i ca n df e a s i b l e t 1 1 i sa r t i c l ea l s os t u d i e so nt h ew a yo fa g a r - f i b r i np l a t e sa n dc o m p a r e si t w i t ht h ef i b r i np l a t e sm e t h o d sa n dt h ea g a r o s e - p l a t e sm e t h o d s 耵1 er e s u l t s s h o wt h a ta g a r - f i b r i np l a t e sm e t h o dc a nb ee f f i c i e n t l yu s e dt ot e s tt h ea c t i v i t yo f n k i ti n t r o d u c e st h a tt h ew a yo fa g a r - f i b r i np l a t e si se a s i e rw i mi t sr e s u l t s o b v i o u s l ya n dt h ew a y i t s e l fi sm u c hc h e a p e rt h a no t h e r s s ow ec a nu s et h ew a y o fa g a r - f i b r i np l a t e so nt h es t u d i e so fs t r a i n ss c r e e n e da n dt h e i rf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o no p t i m i z e t h et e s t i n g - o p e r a t i o ni s ：o t h e a g a r - f i b - p l a t e sm e t h o di ： t om i xs a l t l eq u a n t i t yo ff i b c o n f i g u r a t i o na n d a g a r - c o n f u g u r a t i o n ，k e e p i n gt h e m i x x i n gi n t h ew a t e ro f5 5 f o r15 m i nb e f o r eu s ea n de v e r y p l a t eo f 15 m l t h ca g a r - f i b - p l a t e sm e t h o di i ：t om i xt h e f i b c o n f i g u r a t i o n a n d a g a r - c o n f u g u r a t i o no f t h es a m eq u a n t i t y ，t h e nh e a tt h em i x x i n g t i l li tb o i l i n g w e t a k e1 0 t t lo f t h en k c o n f i g u r a t i o ni nt h ep l a t ea n dk c 印f o r1 6 hu n d e r2 5 1 1 1 e t c s t - l i m i ti s3 2 6 6 2 2 0 0 ( h ，m i ，) a n dt h el o w e s tt om i xt h e a c t i v i t yc o u l db e t e s t e do u ti s5 5 n7 m i ， i nt h ee x p e r i m e n t ，w es t u d yt h eb e s tl i q u i d - f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nf o r y s b n 4 6 7 w ef i r s tt e s tt h ei n f l o u n c eo ft h es i m p l ea c t o r so n eb yo n e 。t h e nw e d e s i g na no r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n d a tl a s tw ec o n f i r mt h eb e s tc o n d i t i o ni s ：2 o f b e a n - p e p t o n ，1 o f m a l t o s e ，c a c l 2 、k 2 h p 0 4 、k h 2 p 0 4e a c ho f o 0 2 a n d t h ei n o c u l a t i o nq u a n t i t yi so f4 ，t h ef e r m e n t i o n t e m p r e a t u r eo f3 0 ，t h e s h a k e s p e e do f1 2 0 r m i n ，t h ei n i t i a n l yp ho f 6 5 ，t h em y c e l i u mq u a n t i t yo f 4 a n d t h em i d i u mq u a n t i t yo f2 0 m l ( l o o m lt r i a n g l e - b o r l e ) f e r m e n t a e di nt h i s c o n d i t i o n ，t h ea c t i v i t yo f n k sp r o d u c i n go f y s b n 4 6 7i s1 2 3 2 i u t i l l k e yw o r d s ：n a t t o k i n a s e ，b a c i l l u s n a t t o ，b r e e d i n g b ym u t a n t ， m i l k - a g a r - p l a t em e t h o df o rs t r a i ns c r e e n i n g ，l i q u i d - f e r m e n t a t i o n ， a g a r - f i b - p l a t em e t h o df o rn k sa c t i v i t yt e s t i n g i v 纳豆激酶高产菌株的选育及液体发酵工艺优化研究 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行 研究所取得的成果。除稳重已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任 由本人承担。 论文作者签名：_ 二率耻 日期：三垫罩l 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：_ = 阻导师签名：拯日期：立：牡 纳豆激酶高产菌株的选育及液体发酵工艺优化研究 1 文献综述 以微生物为来源的药物统称微生物药物，包括抗生素和具有其他药理作用的微生物 次级代谢产物，以及以微生物次级代谢为先导化合物、通过生物或化学方法制得的衍生 物。2 0 世纪4 0 年代青霉素的问世，开创了微生物药物的新时代。随着微生物药物的发 展，它们在肿瘤化疗、器官移植以及高胆固醇血症治疗等方面也发挥了重要作用，成为 不可缺少的药物。据不完全统计，现在全世界已公开发表的微生物来源的生物活性物质 已超过1 5 0 0 0 种，其中得到临床实际应用的约为1 5 0 种( 包括一些衍生物) o 嘧i 目前全球微生物药物的总产值约占医药工业总产值的1 5 左右，在我国，微生物制 药也是医药工业的支柱行业之一。 随着微生物制药工业的发展，微生物药物的研究出现了一些特点，其中不仅包括 重视新的筛选模型和方法的设计，即机遇式和经验式的筛选方法已经被理性筛选或定耙 筛选模型所替代：而且也重视菌种开源工作和新技术的应用，最近十几年来，在微生物 药物研制中，新技术得到了广泛的应用，各种分离分析技术的进步和光谱技术的发展， 高通量筛选系统和计算机检索系统的建立，大大加速了微生物药物研发的速度，现代生 物技术已成为菌种选育的重要手段。更值得注意的是扩大了微生物代谢产物研究的范围， 微生物代谢产物来源的酶抑制剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、降血脂药物，抗寄生虫药 物等多种生理活性物质的发现，大大开拓了微生物药物的研究范围。纳豆激酶是微生物 代谢的具有溶栓作用蛋白药物。 1 1 溶栓药物的发展及研究现状 根据w h o 公布的统计数字，全世界现在患有各种血栓性疾病的患者在1 5 0 0 万之多。 其中每年约有3 0 0 万患者死亡，同时还发现这种状况向低年龄化发展【3 】。研究表明，血栓多 指血液在流交状态下，止血机制过度激活的一种病理现象和结果。血栓和血栓栓塞性血管 阻塞，在冠心病、中风、肺栓塞等临床重病的发病机制中起着十分重要的作用。由此可见， 研究和开发有效的溶栓制品具有极大社会效益和经济效益。 近年来，溶栓药物的发展很快，在此根据溶栓药物的疗效及副作用的大小，将溶栓 药物分为三代【4 l 。第一代溶栓药物以链激酶( s k ) 和尿激酶( u k ，或称u - p a ) 为代表， 此类药物溶栓力强，但缺乏溶栓特异性，在溶解纤维蛋白时又将血中的纤维蛋白原降解， 从而导致出血等严重不良反应。由于第一代溶栓药物具有出血、副作用大等自身难以克 服的缺陷，因此在临床上的应用逐年下降；第二代溶栓药物较第一代虽有改进，但也不 理想，这类药物以组织型纤溶酶原激活剂( t - p a ) 为代表，包括重组人组织型纤溶酶激 活剂、甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物( 简称a p s a c ) 以及尿激酶原( p r o u k , 又称单链纤溶酶原激活剂s c u - p a ) 。此类药物具有一定程度的溶栓特异性，但溶栓效率低、 陕西科技大学硕士学位论文 半衰期短，且产品来源不广泛，因此具有用量大，价格昂贵等缺点。目前它们与抗凝剂、 抗血小板药物等联合应用治疗血栓成为临床研究的主要方向，而如何减少它们的副作用 又成为今后研究的重点。第三代溶栓药物是应用现代分子生物学对第一代和第二代溶栓 药物进行改造，在特异性、半衰期、溶栓效率等方面进行改进和提高。 资料表明，近年来溶栓药物的开发呈现出两种趋势：一种是运用分子生物学理论和 基因工程技术对现有的溶栓剂分子进行重组和修饰，研制新型溶栓剂即第三代溶性药物； 另一种则是寻找一些安全性好、疗效好、副作用小的天然来源的溶栓药物，并将其转化 为基因工程产品。目前已知的天然溶栓药物有1 8 l 葡激酶、溶纤酶、蚓激酶、吸血蝙蝠 唾液纤溶酶原激活剂及纳豆激酶。葡激酶【5 l 【6 】( s a k ) 是金黄色葡萄球菌分泌的一种胞 外蛋白质，作用机理与链激酶相似，但在临床试验中未见过敏反应。但由于天然s a k 来 源少且制剂纯度不高，因此人们克隆了s a k 基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。s a k 作为溶栓药物有如下优点：( 1 ) 重组s a 觏寸纤维蛋白特异性高，溶栓效果好，特别是对 富含血小板的动脉血栓，是治疗急性心肌梗塞的潜在药物；( 2 ) 有一定免疫原性，但不 引起变态反应，也无其它副作用，其突变体免疫原性降低，而它的溶栓效力不变；( 3 ) 重组s a k 易于大量制备，由于其不含二硫键，所以容易复性；( 4 ) 不激活系统性纤溶， 无出血危险。溶纤酶是从铜头腹蛇毒液中纯化得到的溶栓药物，由2 0 3 个氨基酸组成，分 子量2 2 9 8 1 d ，能直接降解纤维蛋白和纤维蛋白原，人们将它与单克隆抗体相连接，在狗 颈动脉栓塞模型中，这种药物有快速而持久的溶纤效果。蚓激酶是由中国科学院生物物 理所研制，是从人工养殖的特种蚯蚓中提取的一种蛋白水解酶，含有纤维蛋白溶酶和纤 维蛋白溶酶原激活剂。动物实验表明其具有溶解兔肺动脉血栓的作用，可明显缩短家兔 优球蛋白溶解时间，适用于缺血性脑血管疾病的预防和治疗纤维蛋白原增高及血小板凝 集率增高的患者。吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂是从吸血蝙蝠唾液中分离得到的两种蛋 白质d s p a a l ( 4 3 k d ) 和d s p a a 2 ( 3 9 k d ) ，不含k r i n g l e 2 功能域和p m j n t 位点，与人( t - p a ) 约有8 5 同源性，显示出极低的免疫原性。在动物溶性模型上，d s 队a l 较t - 队活力高2 5 倍，半衰期长3 倍，清除率减少到1 ，4 1 ，8 ，并有更高的纤维蛋白特异性，与t - p a 相比， 用药量显著减少，适合静脉推注，目前正在临床试验中。纳豆激酶( n k ) u i 9 是纳豆中 存在的一种具有强烈纤溶活性的酶。该酶能显著地溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白 的溶解时间，并能激活静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂( t - p a ) ，从而也间接地表现其 溶纤活性。获得n k 的传统方法是从纳豆中提取，也可采用控制调节基因，通过利用转基 因技术组建基因工程菌的方法也可大幅度提高产量。黑龙江应用微生物所从分泌n k 的枯 草杆菌基因组的d n a 中克隆到了n k 基因，并在大肠杆菌中进行了表达，表达量占菌体 总蛋白的1 5 2 。n k 作为溶血栓药物具有以下几个优点：( 1 ) 来源于食品，安全性能好； ( 2 ) 分子量小，是一个单链蛋白质，更易被人体消化吸收；( 3 ) 可由消化道吸收；( 4 ) 2 纳豆激酶高产菌株的选育及液体发酵工艺优化研究 n k 可直接作用于纤维蛋白，同时还可激活体内的t p a ；( 5 ) 可用细菌进行液体发酵生 产，造价低廉。 1 2 纳豆激酶的生化特性及生物活性 1 2 1 纳豆激酶的生化特性 乱纳豆激酶的稳定性 纳豆激酶在p h 6 0 - , 1 2 o 情况下，比较稳定，p h 低于5 0 时，则很不稳定。4 0 “ c 保温3 0 m i n , 酶活无损失，温度超过5 0 “ c 时，活力逐渐丧失，超过6 0 时，则因蛋白变性而迅速失活。反复 冻融对n k 的活性影响不大，当n k 与煮沸过的小麦或大米提取液、肉汤以及血清蛋白和 胃粘液蛋白混合后, n k 的稳定性显著提高，甚至在酸性条件下，仍保持有酶活性，说明n k 在胃环境中能保持一定的活性，因此可口服来达到溶栓目的。此外，n k 的活性不受 5 m m o l l 的c y s 抑制，而l m m o l l 的d f p 、5 m m o l l 的n e g u v o n 和1 0 0 l m o l l 的p m s f 均完全 抑制n k 的活性。 b 纳豆激酶的分子质量 纳豆激酶是一种单链多肽酶，测定分子质量的技术方法不同，所测的分子质量也有明 显不同。须见洋行用s e p h a d e x g - 1 0 0 柱凝胶过滤法。得到的结果为2 0 0 0 0 u 。最近又有人用 圆二色法测定为2 7 3 0 0 u 。目前认为这一结果很接近于纳豆激酶的真实分子质量。由已分 离出的纳豆激酶的基因d n a 序列，推出氨基酸序列是由2 7 5 个氨基酸组成的一条单链多肽， 根据氨基酸顺序计算出该酶的准确分子质量为2 7 2 2 8 u 3 3 1 。 己纳豆激酶的等电点 用s v u n s s o n 柱型电泳法，等电聚焦测定纳豆激酶具有对称的单一的纤溶酶峰，其p i 值 为p 1 8 6 士o 3 。等电点可以提供在分离提纯纳豆激酶时，考虑p h 值在p i 附近，以有利于酶的纯 化。 d 纳豆激酶的底物特异性 通过对几种人工合成的小分子短肽作为反应底物，研究该酶的酰胺水解活性，发现对 纳豆激酶最敏感的底物是血浆纤溶酶的底物，i i p h 2 d - v a l - l e u - l y s - p n a 。结果表明，纳豆激 酶有其特异的水解蛋白的氨基酸作用和识别位点。 己纳豆激酶的结构 、 纳豆激酶的核苷酸序列 n a k a m u r a 首次报道了包括调控顺序在内共1 4 7 3 b p 的n k 的d n a 序列。n k 的基因以 g t g 为起始密码子。随后是1 1 4 3 b p 组成的阅读框架，编码信号肽、前肽、成熟肽在内的共3 8 1 个氨基酸。结构基因的3 c 末端为联系的3 个密码子，i ：a 凡t a g , t a a 。终止密码子之后一段 序列可形成茎环结构，i l p q 因子非依赖性终止序列。起始密码子上游1 7 b p 处为核糖体结合 位点a a a g g a g ”s 2 d 序列上游是a b t 含量高达7 2 的转录调控区。但在此区尚未找到与 3 陕两科技大学硕士学位论文 已知枯草杆菌蛋白酶启动子相类似的保守序列。n k 是眭t 2 7 5 个氨基酸组成的单链多肽结 构，无二硫键纯化的斓过s d s p a g e ，在2 8 0 0 0 k 处有明显的条带。作为丝氨酸蛋白酶，其 活性中心为a s p 3 2 、h i s 6 4 、s e r 2 2 1 。 纳豆激酶的蛋白质结构 图1 - 1 纳豆激酶蛋白质空问结构图 f i g 1 1p r o t e i nc o n s t r u c t i o no f n k 1 9 9 3 年须见洋行等用反向h p l c 层析法分离出的纳豆激酶并测定了它的氨基酸序列。 由2 7 5 个氨基酸组成，呈单链结构，无二硫键纳豆激酶的空间结构见图1 1 。与根据n a d a m u r a 等测定的核苷酸序列推导出的氨基酸序列完全一致。其氨基酸序列如图l 所示。从n k 的 d n a 序列推导出n k 基因编码3 8 1 个氨基酸，其中n 端2 9 个氨基酸组成信号肽，随后的7 7 个 氨基酸组成前肽，成熟肽组成与氨基酸序列测定相符。n k 作为丝氨酸蛋白酶，其活性中心 为a s p 3 2 , h i s 6 4 和s e r 2 2 1 ，与底物结合部位在s e r l 2 5 ，l e u l 2 6 ，g l y l 2 7 。n k 的信号肽包含一个 带3 个正电荷的亲水n 端以及一段不带电的疏水残基序列。其切割位点位于a l a - g l n - a l a 保守序列之。另外 n k 基因编码序列中还有一个不同于多数原核基因的特点，即在信号肽 和成熟肽之间有一段2 3 1 个核苷酸编码的前肽序列。n k 在分泌到胞外以前。为无活性的酶 原，分泌到胞外后，切割前肽成为有活性的蛋白酶。这种现象在原核生物中较罕见。目前已 发现一些与夺滢因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。n k 与大多 数枯草杆菌素在核苷酸序列及氨基酸组成上具有高度同源性。此外，纳豆激酶的活性不受 5 m m o l l c y s 存在与否而改变，但是l m m o l l 的d f p 和5 m m o l 几n e g l 0 n 则完全抑制酶的 活性。从而表明纳豆激酶为一种丝氨酸蛋白酶m3 2 】。 1 2 2 纳豆激酶的生物活性 纳豆激酶( n k ) 的生物学功能表现为其具有酰胺水解活性【3 6 l 和纤溶活性。 4 纳豆激酶高产菌株的选育及液体发酵工艺优化研究 a n k 的酰胺水解活性 n k 作为丝氨酸蛋白酶，其酰胺水解活性可通过许多合成底物进行观察。s u m i 比较了 n k 对纤溶酶底物s 2 2 2 5 l 、尿激酶底物$ 2 2 4 4 4 、弹性蛋白酶底物$ 2 2 4 8 4 、凝血酶底物 $ 2 2 2 3 8 及激肽释放酶底物$ 2 2 3 0 2 等水解活性，发现n k 的最适底物是纤溶酶底物 s 2 2 5 1 饵d - v a l l y s - p n a ) 。以氧化型胰岛素b 链为作用底物，研究n k 的酶切特性发 现，n k 具有严格的限制性酶切位点，首选酶切位点在l e u l 5 - t y r l 6 ，其次在s e r 9 h i s l 0 。与 其他一些枯草杆菌素不同的是, n k 对氧化型胰岛素b 链c 端t y r l 0 0 - a l a 3 0 之间肽段却无 任何酶切特性。而m i t s u g u 等研究发现分离于纳豆中纳豆激酶对纤维蛋白原和合成的枯 草杆菌素底物s u c a l a - p r o - p h e - p n a 具有高度水解活性, p m s f 抑制了其酰胺水解活性和 纤溶活性。此外，也有研究发现n k 可与血浆砣巨球蛋白按2 ：l 结合，从而失去活性。 n k 最引人注目的功能是其强烈的纤溶活性。用纤维蛋白平板测定n k 活性。结果显示每 克湿重纳豆约相当于1 6 0 0 i u 单位尿激酶或者4 0 c u 单位纤溶酶。利用偶联h r p 的负抗 n k 抗血清作包被抗体，鼠抗n k 单克隆抗体作检测抗体，测定n k 活性，灵敏度达 0 1 n g m l 。以前认为n k 是枯草杆菌中唯一具有纤溶活性的蛋白酶。但最近k i l n 等研究发 现，韩国发酵食品e h a n g k o o k - j a n g 的工程菌b a c i l l u s s p l s t r a i n c k l l 2 4 能分泌出种具有强 纤溶活性的蛋白酶c k , 其纤溶活性比枯草杆菌素c a r l s b e r g 的纤溶活性要高8 倍。其n 端的 1 4 个氨基酸组成与n k 不同，但与枯草杆菌素c a r l s b e r g 的纤溶酶相同。而且该酶( a p 表 现出耐热、亲水特性( 最适p h 为l o 5 ，最适温度为7 0 “ c ) ，其酶的分子质量为2 8 2 0 0 u 。李荣 萍等研究了一种具有纤溶活性的枯草杆菌产生的蛋白激酶。通过鉴定筛选出2 株高产酶菌 株，是否还有其他菌株也能分泌高纤溶活性的蛋白酶尚待进一步研究。 b n k 的纤溶活性 n k 在体内外都具有明显的溶栓活性 3 7 0 3 9 。 n k 的体外溶栓作用 n k 的体外溶栓作用十分明显。n k 最早就是因为其具有显著体外溶栓效果而被发现 的，n k 是一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白成小肽和氨基酸，当酶提取液滴加到纤维蛋 白平板上，短时间内( 1 弘1 8 h ) 即出现透明的溶解圈，酶活性越大，溶解圈越大。用纤维蛋白平 板法和溶解时间标准曲线法测定，n k 的比活力是纤溶酶的4 倍。 n g 的体内溶栓作用 通过动物血栓模型研究n k 的溶栓活性，发现n k 不仅抑制血栓的形成，同时还有很强 的溶栓作用并在一定范围内呈量效关系。在小鼠颈总动脉中注射醋酸引起血栓，分别静脉 注射纳豆激酶、纤溶酶和弹性蛋白酶，在同等摩尔浓度下，颈总动脉恢复率分别为 ( 6 2 a ：5 1 3 ) 、( 1 5 8 - 士- 0 7 ) 、o 。纳豆激酶的溶栓效果远远大于纤溶酶和弹性蛋白酶。纳 豆激酶具有抗胰酶水解的能力，因此纳豆激酶不仅可以静脉注射，而且口服效果也好。在给 5 陕西科技大学硕士学位论文 实验组狗服用4 粒n k 胶囊，给对照组服用熟大豆，测定狗血浆的纤溶活性。实验结果表明对 照组在服用熟大豆1 8 h 后没有出现血栓溶解，而实验组在服用n k 后的5 h 内血栓完全溶解， 血液循环完全恢复。另外，口服纳豆激酶后优球蛋白的纤溶活性( e f a ) 和纤维蛋白降解产 物( f d p ) 值迅速升高，表明纤维蛋白迅速降解。另外还发现组织血纤维蛋白溶解酶原激活 剂( t e a ) 的量不断增加。n k 是否通过诱导血管内皮细胞合成t p a 从而发挥溶栓作用，有待 进一步研究。大多数溶栓药物如链激酶( s k ) 、尿激酶( u k ) 、t p a 等都是纤溶酶原激活剂 型，均通过激活纤溶酶原转变为纤溶酶，而发挥溶栓作用，而n k 在发挥作用时，并不激活纤 溶酶原，它直接作用于交联纤维蛋白。比较n k 、纤溶酶和弹性蛋白酶发现无论体外或体 内实验, n k 的纤溶活性都为纤溶酶的4 倍以上。n k 对交联纤维蛋白有很强的水解活性，但 对纤维蛋白原却并不敏感。实验证明, n k 的纤维蛋白原水解活性远远低于纤溶酶和弹性 蛋白酶，甚至尿激酶，而与他a 基本相同。这揭示n k 在发挥纤溶作用的同时，不水解血浆纤 维蛋白质，不易引起出血倾向。最近研究发现，n k 可水解纤溶酶原激活剂的l 型抑制剂 ( p h i - 1 ) ，使其失活，从而提高纤溶作用。这是由于p a i 1 是纤溶作用的主要抑制剂，它与t - p a 的比例可调控纤溶活性, p a i - 1 的失活可直接使纤溶作用增强。 1 3 国内外纳豆激酶制品的开发现状 纳豆激酶产品最大生产国是日本，日本有多家企业推出含有纳豆激酶为主要成分的 产品，并已在世界各地设有销售服务机构。日本本国也是消耗纳豆量最多的国家，据文献报 道，日本每年消费纳豆2 2 万吨，约1 6 0 0 亿日元。拥有4 0 0 多家工厂生产纳豆及纳豆激酶产品。 供应国内外【l 们。近年纳豆激酶作为功能性食品、食品添加剂和普通食品发展的十分迅速， 仅美国和欧洲的营养品和功能性食品的市场销售额就达5 0 0 0 亿美圆。而且以1 7 2 0 的增 长率逐年增加。日本共有十几家公司从事纳都激酶制品的生产，其中具代表性的公司有： 日本大和制药有限公司( d a i w a p h a r m a c e u t i c a l c 0 1 l t d ) 、温翠普圣特公司 ( v e n t r e p s a n t e i h a t ) 、过敏症研究集团公司( a l l e r g y - r e s e a r c h g m u p ) 、真保健公司 ( t h e r e a l l y h e a l t h y c o m p a n y ) 、生物技术研发公司0 3 i o r & d s 株) 。其中日本大和 1 1 - 1 4 药 有限公司为最大纳豆激酶生产和销售企业。日本大和制药有限公司生产的n k c p 产品，其 生产条件符合g m p 要求，也具有严格的质量控制标准，它的国外销售网络辐射到亚洲及太 平洋地区的韩国、泰国、印度尼西亚、马来西亚、新加坡和澳大利亚。北美的美国和加拿 大；南美的巴西；欧洲的英国、德国、意大利、西班牙和葡萄牙等。由此可看出纳豆激酶 作为保健食品、普通食品和食品添加剂在日本引起的全民重视程度及在国际市场上的受 欢迎程度。 此外，朝鲜人民民主共和国也有几家公司生产纳豆激酶制品，朝鲜人民民主共和国医 学科学院推出的新产品“血宫不老精, 1 5 - 1 7 ) ( r o y a l b l o o d f r e s h ) ，为纳豆激酶制品。批准文号 为0 3 7 6 2 2 0 0 2 。它是使用高科技方法从朝鲜有名的食品埃里谢( e l i x i r ) 中提取。经过精心地 6 纳豆激酶高产菌株的选育及液体发酵工艺优化研究 加工制成的有效化合物( n a t t o k - n a s e ) 。“血宫不老精”在1 9 9 6 年5 月的朝鲜国家技术创新博 览会上曾获得国家最高荣誉奖，并得到外国专家的一致好评。另外还有韩国的维寿酶公 司( v a s o z y m e c o m p a n y ) ，生产的以纳豆激酶为主要成分的维寿酶( v a s o z y m e ) ，每克干粉含 2 0 ，0 0 0 f u ，每日服量为2 ，0 0 0 f u , 为肠溶胶囊。此外加拿大、美国【1 8 1 和一些欧洲国家也在加 紧进行纳豆激酶相关药品和保健品的研究。 资料表明，国外虽然尚未见有纳豆激酶作为治疗制剂的生产和应用的国家正式批准 为药品的文件，但是诸多国家将其开发成食品、食品添加剂、食品补充剂、功能性食品和 ”普通食品，用于补充营养、保健和防病，产品有多种形式：粉剂，软硬胶囊、片剂、液体剂、 浓缩剂等。 在我国，目前尚无纳豆激酶相关药品的应用，不过近年来已有越来越多关于纳豆激 酶功能食品的报道。但是，我国出售的纳豆激酶功能食品价格昂贵，造成这种状况的原 因既有我国对纳豆激酶的研究相对较晚，也有我国人民对纳豆的认知度低、重视度不够， 从而使得我国还未进入纳豆激酶的工业化大生产阶段。由此可见，在国内加强纳豆文化的 传播、大力进行适用于大生产的开发和研究势在必行。 1 4 纳豆激酶的研究进展 1 4 1 菌种及菌种选育 研究表明，纳豆激酶产生菌( 俗称纳豆菌) 为枯草芽孢杆菌的亚种，在合适的固、+ 液体培养基中均可发酵产生纳豆激酶。不同的菌株发酵产酶的活性差异很大，天然菌生 产的湿重纳豆其酶活范围为4 0 0 1 6 0 0 i u g ( i u 为尿激酶活力单位) 。因此，优良菌株的获 得是高产纳豆激酶的关键。通常人们通过两种途径获得优良菌株，既常规育种和基因工 程育种。 扎常规育种 常规育种，包括自发突变与