浙江大学生物化学实验甲质粒DNA的小批量提取与鉴定.ppt

质粒DNA的提取与电泳鉴定 1、质粒简介 质粒是一种寄生性的自主复制子，存在于细菌等细 胞中，为双链闭环的DNA分子，大小为1kb200kb 之间，具有自主复制和转录的能力，但其复制和转 录要利用宿主细胞（细菌）编码的一些酶和蛋白质 。 2、分离纯化质粒的原理 分离纯化质粒DNA主要是利用宿主染色质DNA与质 粒DNA之间的差异来进行的。 质粒DNA的提取与电泳鉴定 细菌DNA与质粒DNA形状上均为双链环形，但二 者的分子量相差较大，细菌DNA的分子量在109D 左右，而质粒DNA的分子量仅为106 107D， 提取纯化质粒的过程中，细菌DNA大多断裂成线 状分子，而质粒DNA则多数仍为双链环状，从而 即可将二者分开。 本试验采用微量碱变性法来分离纯化质粒DNA， 具体的分离纯化原理如下： 0 细菌 （含质粒 ） 溶菌酶 破细胞壁 SDS NaO H （细菌DNA和质粒 DNA均通过碱变性成 为线状分子） 破细胞膜 冰醋酸 细菌DNA与变性蛋白和细胞碎片缠 绕在一起（不能复性） 质粒DNA经复性后变为共价闭合环状 离心 沉淀：细菌DNA、细胞碎片等 上清：质粒DNA、RNA、可溶性蛋白等 酚：氯仿 离心 下层：酚，氯仿 中层：变性蛋白 上清（水层）：质粒DNA、RNA等 无水乙醇 离心 上清：可溶性杂质等 沉淀：质粒DNA、RNA等 RNase 质粒DNA 质粒DNA的提取与电泳鉴定 质粒DNA的天然结构为共价闭环（超螺旋）结构 ，但在制备过程中，由于各种因素的影响，同一 质粒DNA的分子可能呈现出如下几种构型： 超螺旋型（共价闭环）质粒DNA：（cccDNA ）超螺旋状。 开环质粒DNA：（ocDNA）质粒DNA的两条链 中有一条链发生一处或多处断裂，从而形成松弛 的环状分子。 线状质粒DNA：（linearDNA）质粒DNA的两 条链在同一处断裂，从而变为线状分子。 质粒DNA的提取与电泳鉴定 电泳时，由于分子形状的不同，三种质粒DNA的 泳动行为不同，根据电泳迁移率从小到大的顺序 分别为开环质粒DNA、线状质粒DNA和超螺旋 质粒DNA。 3、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定原理 核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在 pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动， 根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构 型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴 定。 质粒DNA的提取与电泳鉴定 电泳中所使用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶和琼 脂糖凝胶，核酸中常用琼脂糖凝胶。 不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离200bp50kb的 DNA片断，通过在琼脂糖溶液中加入低浓度的莹 光染料溴乙锭（EB），在紫外光下即可检测出 10ng的DNA条带。 当用琼脂糖凝胶电泳法检测质粒DNA样品时，根 据条带的位置即可知道质粒分子的三种构型及其 比例， 质粒DNA的提取与电泳鉴定 此外，还可了解质粒样品中的杂质，如RNA、染 色体DNA、蛋白质等的污染程度。电泳时如用已 知分子量的核酸作对照，还可测定样品核酸的分 子量。 4、材料与试剂 、试验材料 含有pUC系列、PSK等高拷贝质粒的菌株。 、试验试剂 试验试剂及使用时的注意事项解说详见P144及 P147。 质粒DNA的提取与电泳鉴定 5、操作步骤 、质粒的提取 质粒提取的操作方法及注意事项解说详见P145。 、电泳鉴定 胶浓度：0.7% 各步操作方法及注意事项解说详见P148。 6、实验结果及处理 仔细观察纯化过程中各步试验现象。 仔细观察电泳后荧光带的显示情况，据此绘制电 泳图谱并对图谱进行简要说明。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 1、限制性内切酶简介 限制性内切酶或限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme or Restriction Endonuclease）是指能辨 认双螺旋DNA分子中的特异碱基序列，并在此特 异位点处以内切方式将双链DNA切断的一类酶。 根据它们的作用特点，可将其分为三类：类和 类酶，在同一种酶分子中兼有切割和修饰（甲 基化）作用，类酶由于切割位点随机，类酶 则由于切割位点不对称，因此这两类酶的作用都 不大。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 类酶由两种酶组成，一种为限制性核酸内切酶 ，另一种为独立的甲基化酶。其中，对我们最为 有用的是类酶中的限制性核酸内切酶。 限制性核酸内切酶广泛存在于原核生物中，1968 年由Meselen和Yuan从大肠杆菌中第一次分离得 到，现已发现近几百种(498种)。 该类酶能识别DNA分子中的特异序列，并在此序 列处切断DNA双链。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 绝大多数限制性内切酶的识别序列为4个6个碱基 对，该序列具回文对称结构，且富含GC。（即旋 转1800后与原来结构相同），少数酶可识别更长 的序列或兼并序列。 限制性内切酶切割后的DNA片断，有的产生粘性 末端，有的产生平末端。如： 、产生粘末端的酶 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 BamH：G G A T T C C Hind：A A G C T T C C T A A G G T T C G A A 两条链的断裂位置是交错地担又对称地围绕着一 个对称轴排列。 、产生平末端的酶： Hae：G G C C C C G G 两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心。常 用限制性内切酶的酶切位点可参见有关书藉。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 限制性内切酶由于能识别特异顺序并进行切割， 因而在基因重组、序列分析、基因组甲基化分析 及基因物理图谱的绘制等技术中被广泛应用。 2、质粒pUC19的酶切图谱 质粒pUC19的酶切图谱见图1.2。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 由图可见，实验所用的BamH和Hind在质粒 pUC19上均为单切点的限制性内切酶， pUC19经 这两种酶切割后可产生大小二片段，大片段为 2.656bp，小片段为30bp。如为完全酶切，电泳后 应产生这两个片段的电泳图谱，由此即可对提取 的质粒进行鉴定。 3、影响限制性酶切反应的因素 DNA纯度、缓冲液、温度及限制酶本身都会影响 酶的活性。 （二）、质粒DNA的酶切鉴定 为避免污染，每次吸取限制酶时都需用新的吸管 头。 应注意，如采用两种限制酶进行切割，则必须分 别提供各自的最适盐浓度。 若两者可用同种缓冲液，则可同时水解，否则低 盐浓度的限制酶必须先用，待调节盐浓度后，再 用高盐浓度的限制酶水解。 也可