真核生物基因组DNA的提取、电泳.ppt

分子生物学实验分子生物学实验 1、 欢迎大家参加分生实验的学习！ 2、 分生实验的重要性； 3、 每组2人，做一份实验； 4、 守纪律，听老师安排，穿白衣； 5、 同学们在听课时要作好记录; 6、 上课时间、课间休息。 考试形式考试形式 实验成绩考核占总成绩40%，满分为40分。缺实验实验 课课成 绩绩者，本课课程不予通过过。 随堂考试试（10分）(主要考察理论课与实验课结 合内容 ) 闭闭卷考试试（15分)(实验方法及原理、实验结 果及注意 事项、仪器设备操作及注意事项和对失败结果的原因的分 析 ) 实验设计实验设计 （15分）(实验名称、实验目的、方法和步骤 预期实验结 果、关键问题讨论 及参考文献) 实验课安排实验课安排 实验一 基因组DNA的提取 实验二 PCR及琼脂糖凝胶电泳检测 实验三 PCR产物的限制性酶切片段分析 实验四 总RNA的提取及逆转录 实验五 PCR产物的TA连接 实验六 转化 实验七 质粒的提取、酶切鉴定 实验八 讨论及实验课考试 实验课安排实验课安排 1. 提取基 因组DNA 重组质粒 6.连接产物转化 无质粒的E.Coli 死亡 有质粒的E.Coli 存活 2. PCR获取目的基因 7. 重组质粒 提取及酶切 鉴定 质粒 5. TA 连接 4. RNA提取 与逆转录 T载体 平板筛选 一、加样器的使用及注意事项 1、 用途 2、 使用 2.1 根据取样量，选择合适的加样器。 5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器? 顶部标有加样器的最大量程， 分别为： 20ul: 0.5 20 l 100/200ul: 20 100/200 l 1000ul: 200ul 1000 l 实验仪器的使用及注意事项 练习：加样器读数为练习：加样器读数为 10100 0，实际体积各为多少，实际体积各为多少? ? 2.2 如何调节？ (1)首先观察目前读数,假设为050: 1000 l: 500 l 100 l: 50 l 20 l： 5 l (2)顺时针调节- 读数变小 逆时针调节- 读数变大 (3)注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小 量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将 会损害加样器的精度。 2.3 加样器使用步骤(示教及学生练习)： 6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒 流损坏加样器！) 贴容器内壁，将液体匀速打出，加样器推到 第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内. 5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回 去 4）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上 冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒 钟, 急于离开液面，容易吸入空气。 3）将吸头插入液面下适当深度，过深可能会腐 蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。 2）吸取液体前，先打到第一挡。 1）选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安 装要紧密。不要用手直接拿吸头，安上吸头后一 定要再固定一下 1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。 二、离心机的使用注意事项 1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。 3、样品配平, 对称放入 离心机(管的连接处朝外). 4、设定离心时间(如设定 2分钟，可定时多点时间， 再用手表记时)。 5、统一离心，逐渐升到 要求转速。 实验一、真核生物基因组 DNA的提取和电泳 一、 实验背景 高等生物的基因组相当宠大。 真核细胞基因组约含万个结构基因，其它大量存在的是 调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包 含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部 信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达 调控的研究是至关重要的 研究的起点就是要获得纯度高不含蛋白质、糖类、酚、 氯仿等污染；得率好以便有足够量用于分析；基因组相 对完整不断裂的基因组以便用于以后PCR分析，RFLP分 析，基因文库的构建，基因探测等的研究。 掌握小鼠肝脏组织模板DNA的提取技术。 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。 第一部分 ：肝组织制备、蛋白酶k消化 第二部分: 酚氯仿抽提、乙醇沉淀 第三部分： DNA琼脂糖凝胶电泳 三、实验材料 小鼠肝脏组织 四、主要试剂（稍后讲解） 二、 实验目的 五、实验步骤（马上讲解） 1. 取新鲜小鼠肝组织（约300-500mg），小米粒大小， 组织块不宜过大, 放在毛玻璃片上立即研磨,研磨要 彻底。 2. 将研磨后的肝组织转移至加有460 l NE溶液的EP管 中，混匀。 实验第一部分 小鼠肝组织的制备、蛋白酶K消化 注意事项 组织磨得越细越好。 细胞中含有大量的DNA酶，因此，第一步的操作（EDTA：抑 制酶活性）应迅速，以免细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA 降解。 注意事项： 离心时离心机内样品平衡后对称放置 加样器加样准确。 加样器使用提示： （1）吸头的安装要紧密。 （2）打到第一挡，将吸头插入液面下适 当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在 液面下停留一下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容 器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀 速打到目的容器内，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全 打出。 3. 1000 r/m,离心5min (统一离心)，将上层细胞悬液转移 至另一EP管中，用NE溶液补足至500 l，弃掉下层大块 的组织沉淀。 加30 l 10%SDS, 迅速混匀。 3. 加50 l 蛋白酶K(20mg/ml),混匀，置50水浴50min。 一、核酸提取的主要步骤 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步: 1) 破碎细胞 2) 去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞 基因组较大，在纯化出的DNA的操作中应注意动作轻柔 ，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作 用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA 3) 沉淀核酸 乙醇沉淀 SDS裂解 蛋白酶K消化 琼脂糖电泳 PCR DNA提取步骤图解 酚氯仿抽提 作用：a.阴离子型去污剂阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性 c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用 成分：N: NaCl 50mM E: EDTA.Na2 25mM (PH:8.0) 作用：金属离子螯合剂，抑制DNase的活性 (螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子)。 二、各种试剂的作用 1、NE 溶液： 2、SDS ：十二烷基硫酸钠 终浓度0.5% 3、蛋白酶K(或链霉蛋白酶) 作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活 性，降解蛋白质，将降解蛋白质，将DNADNA游离。游离。 重蒸酚: 酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。 无色 酚的氧化产物(如醌等,粉红色) 破坏磷酸二脂键。 重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。 TE溶液: Tris-HCl 10mM (pH:8.0) EDTA.Na2 1mM (pH:8.0) 作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。 在酸性条件下，DNA分配于有机相。 8-羟基喹啉：0.1% 黄色酚相指示剂 抗氧化剂 作用： 去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，可 使样品中的蛋白质变性，通过离心去除。为防止其对后续实 验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。 4、TE饱和重蒸苯酚： 成分： 氯仿作用： a. a. 氯仿的变性作用不如酚好， 但与酚共同但与酚共同/ /交替使用可交替使用可增强去蛋白效果增强去蛋白效果； b. 氯仿有加速有机相和水相的分离、氯仿有加速有机相和水相的分离、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性； 5、酚/氯仿 6、氯仿/异戊醇 ( 24 : 1) 氯仿的作用： 去除DNA水溶液中残留的微量酚。 异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。 在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNADNA发生沉淀发生沉淀。 8、无水乙醇 ： 作用：提供单价阳离子。 7、醋酸钠：3M NaAc pH: 5.2 v核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子 形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会 被变性。 v最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋 酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等 v常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等 1、加入580ul(等体积)TE饱和酚, 混匀1min. 10000rpm,2min。 (注意抽取下层酚相; 轻柔混匀，避免DNA链断裂;) 实验第二部分、酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀 5、加入2-2.5倍体积无水乙醇（1ml） 混匀后置-70 沉淀10min。 4、 取300ul上清至一新管中，加入1/10体 积（约30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。 3、 将400ul上层水相移至一新管中。加入400ul(等体积)氯 仿-异戊醇，同上条件混匀后离心。 2、将500ul上层水相移至一新管中，加入500ul(等体积)酚/氯 仿，同上条件混匀、离心。(注意要尽量抽尽，又不可吸起 酚相)。 注意事项： 1） 本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇 是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我 们总是取上清。 ； 2） 在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，不能将加样器 平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立 即弃掉加样器头。 。 3） 基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断 裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多 次进行物理性操作。 一定要充分充分 溶解沉淀 7、加入15 l双蒸水，溶解沉淀，-20保存。 6、10,000 r/min离心5min， 吸弃上清、滤纸条吸干内壁液体(勿触及勿触及DNADNA沉淀沉淀)， 37孵箱干燥至沉淀变透明。 9 l：进行电泳 6 l：PCR 模板（用于下次课实验） 弃上清黄头滤纸条 (吸干内壁液体) 观察DNA沉淀的颜色。 离心 实验第三部分、DNA质量检测-琼脂糖电泳 一、琼脂糖凝胶电泳原理 DNA分子在 pH 8.0 的电泳环境中，带负电荷 ，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁 移。 电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物， 煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作 用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于 受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量 较小的DNA片段跑在前面。 2. 2. 上样：上样： 在样品中加在样品中加 1ul 101ul 10上样上样 液，混匀，加入上样内液，混匀，加入上样内 各组按顺序上样 二、 琼脂糖凝胶电泳实验操作 1.1. 制备琼脂糖凝胶电泳（制备琼脂糖凝胶电泳（1%1%） 实验老师准备实验老师准备 3.3.电泳：电泳： 110110120V120V，3030分钟分钟 三、琼脂糖凝胶电泳常用试剂 上样液成份： 10.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯青（样品指示剂） 240%蔗糖 或 30% 甘油（增加样品比重利于加样） 电泳缓冲液： TAE 为例 T: Tris碱 A: 冰醋酸 E: EDTA 提供有一定缓冲能力的pH值(8.0), EDTA可抑制DNase 溴化乙锭（EB）：染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA 的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。 致癌剂致癌剂 线性DNA片断大小（kb） 琼脂糖浓度（%） 5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0 思考： 凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？ 四、 琼脂糖凝胶的浓度 五、 电泳仪的使用方法 稳压: 电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。 如箭头所示。 六、预期结果 如果是Smear带，说明所提基因组DNA的断裂现象严重。 1 2 3 4 5 marker理想结果 思考题：思考题： 1. 1. 本实验中所