菊属植物SCoT分子标记技术在遗传多样性分析中的应用.pdf

园 艺 学 报 2013，40（10） ：20152025 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: 收稿日期：收稿日期：20130407；修回日期：修回日期：20130906 基金项目：基金项目：国家自然科学基金项目（31272196） ； 948计划项目（2003-s13） ；江苏省科技支撑计划项目（be2011325，be2012350） ； 江苏省农业科技自主创新资金项目cx（11）1034，cx（12）2020；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（ncet-10-0492） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：） 菊属植物 scot 分子标记技术在遗传多样性分 析中的应用 李丕睿，蒋甲福，陈素梅，管志勇，廖 园，房伟民，陈发棣* （南京农业大学园艺学院，南京 210095） 摘 要：摘 要：采用正交设计方法，对 mg2+、dntps 和引物浓度、taqdna 聚合酶及模板 dna 用量等 5 个因素进行筛选， 得到适于菊属植物的 scot 标记 pcr 反应体系， 25 l 体系中含有： mg2+ 1.2 mmol l-1、 dntps 0.15 mmol l-1、引物 0.8 mol l-1、taqdna 聚合酶 1 u、模板 dna 50 ng。优化的最适退火温度 为 49.4 。改进电泳方法，采用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染法染色。运用不同倍性菊属材料基 因组 dna 对优化的 scot-pcr 反应体系进行验证，获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱，表明确立 的菊属植物 scot 分子标记技术体系稳定可靠。利用该体系及筛选出的 12 个 scot 引物，对 18 份菊花近 缘种属材料的遗传多样性及亲缘关系进行分析，共检测到 209 个位点，其中多态性位点数 189 个，多态 性比率为 90.43%。应用 ntsys-pc2.1 软件，计算菊花近缘种属材料之间的相似性系数并采用不加权成对 算术平均法（upgma）进行聚类分析，结果 18 份菊花近缘种属材料的遗传相似性系数范围为 0.4516 0.7035，平均遗传相似性系数为 0.58。聚类分析显示在相似系数 0.530 处可以将 18 份材料分成、两 个大组，组包括芙蓉菊和绢毛蒿，其余 16 份材料属于组。组在相似系数 0.615 水平又分为 6 个亚 组。结果表明 scot 分子标记体系适用于菊属及其近缘属种遗传多样性及亲缘关系的研究。 关键词：关键词：菊属；目标起始密码子多态性（scot） ；遗传多样性；体系优化 中图分类号：中图分类号：s 682.1+1 文献标志码： 文献标志码：a 文章编号： 文章编号：0513-353x（2013）10-2015-11 establishment and optimization of scot molecular marker system in chrysanthemum and its application of analysis on genetic diversity li pi-rui，jiang jia-fu，chen su-mei，guan zhi-yong，liao yuan，fang wei-min，and chen fa-di* （college of horticulture，nanjing agricultural university，nanjing 210095，china） abstract：orthogonal design was applied to optimize scot-pcr amplification system of chrysanthemum in five factors such as mg2+，dntps，primer，taq dna polymerase and template dna. an optimal reaction system of species from chrysanthemum was completed； 25 l pcr reaction mixtures contained mg2+ 1.2 mmol l-1，dntps 0.15 mmol l-1，primers 0.8 mol l-1，taq polymerase 1 u， template dna 50 ng. the most suitable annealing temperature of primers was 49.4 . the improved 2016 园 艺 学 报 40 卷 method for separating pcr products was 8% polyacrylamide gel electrophoresis followed by silver staining. three materials from chrysanthemum with different ploidy levels（2x，4x，6x）were used to test the optimized reaction system. ideal results with clear polymorphic bands showed that the stable and reliable reaction system was obtained. scot markers were applied to study the genetic diversity and relationship of 18 species of chrysanthemum and its related genera. using 12 selected scot primers 209 bands were generate， of which 189 （90.43%） were polymorphic. the jaccard genetic similarity coefficients among the species were calculated with ntsys-pc2.10e software and the values were between 0.4516 and 0.7035 with an average of 0.58. these coeffi cients were utilized to construct a dendrogram using the unweight pair-group method with arithmetic averages（upgma）. the results showed that 18 species of chrysanthemum and its related genera could be grouped into two distinct clusters based on similarity of 0.530. the others except crossostephium chinense and artemisia sericea were in one cluster，which was further divided into six groups when the similarity coefficient value was 0.615. the results demonstrate that the scot marker system is useful for studying genetic diversity and relationships among species of chrysanthemum and its related genera. key words： chrysanthemum； sart codon targeted polymorphism （scot） ； genetic diversity； system optimization 目标起始密码子多态性分子标记 （start codon targeted polymorphism， scot） 是 collard 和 mackill （2009）在水稻上开发的基于 spar（单引物扩增反应）的新的目的基因分子标记方法。其原理是 根据植物基因中 atg 翻译起始位点侧翼序列的保守性设计单引物， 对基因组进行扩增， 产生偏向候 选功能基因区的显性多态性标记。scot 标记结合了 issr 标记和 rapd 标记的优点，操作简单，成 本低，引物设计简单且可以通用，多态性丰富，能产生与性状联系的标记，可用于分子辅助育种 （andersen & lbberstedt，2003） 。 目前 scot 已被成功应用于龙眼（陈虎 等，2009，2010） 、枇杷（韩国辉 等，2011b） 、柑橘（韩 国辉 等，2011a；蒋巧巧 等，2011） 、葡萄（张君玉 等，2011） 、杧果（luo et al.，2010，2011） 、 菠萝（陈香玲 等，2012） 、草莓（秦国新 等，2012）和花生（熊发前 等，2010；xiong et al.，2011） 等作物，在种属间、品种间的遗传多样性分析及杂交后代的遗传分析等研究中取得较多进展，但尚 未见有关其在菊属植物中应用的研究报道。 吴国盛等（2008）运用 pcr-rflp 技术对 12 份菊属与 2 种亚菊属植物进行了亲缘关系研究， 但得到的多态性信息较少。周春玲和戴思兰（2002）利用 aflp 技术对菊属植物 12 个分类群进行了 亲缘关系分析。此外，issr（刘蕤和杨际双，2009；张鲜艳 等，2011） 、srap（张鲜艳 等，2011） 及 rapd（刘蕤和杨际双，2010）等分子标记在菊属植物亲缘关系研究中的应用也有一些报道。但 菊属植物遗传背景复杂，种间的基因渗入频繁（周春玲和戴思兰，2002） ，目前研究主要还集中在菊 花种内和品种间分析，而对于菊花近缘种属种质资源的遗传背景研究不足，制约了菊属优异种质资 源的开发与利用。本研究中采用正交设计方法，建立适于菊属植物的 scot 标记 pcr 反应体系，并 运用不同倍性的菊属材料基因组 dna 对建立的体系进行验证。 同时利用该体系对 18 份菊花近缘种 属材料的遗传多样性进行分析，以期为今后利用远缘杂交进行菊花等重要观赏植物的遗传育种提供 参考。 10 期 李丕睿等：菊属植物 scot 分子标记技术在遗传多样性分析中的应用 2017 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验材料为保存于中国菊花种质资源保存中心的切花菊 （chrysanthemum morifolium ramat.）神 马 （ jinba ）及 18 份菊花近缘种属材料（表 1） ，其中切花菊神马用于 scot-pcr 体系的建 立和优化，菊花脑（c. nankingense） 、南京野菊（c. indicum）和切花菊神马用于 scot-pcr 体 系验证、引物筛选及电泳检测方法改进试验。36 个 scot 引物序列参照 collard 和 mackill（2009） ， 由上海捷瑞生物工程有限公司合成。marker，dntps，taq dna 聚合酶，10 buffer 等均购自宝生 物（大连）工程有限公司。 表表 1 供试的供试的 18 份菊花近缘种属材料份菊花近缘种属材料 table 1 list of the 18 species of chrysanthemum and its related genera used in this study 编号 code 材料 material 采集地 source 1 菊蒿 tanacetum vulgare 中国北京 beijing，china 2 菊花脑 chrysanthemum nankingense 中国南京 nanjing，china 3 南京野菊 chrysanthemum indicum 中国南京 nanjing，china 4 芙蓉菊 crossostephium chinense 中国福建 fujian，china 5 大岛野路菊 chrysanthemum crassum 日本九州 kyushu，japan 6 甘菊 chrysanthemum lavandulifolium 中国北京 beijing，china 7 毛华菊 chrysanthemum vestitum 中国安徽 anhui，china 8 泡黄金菊 chrysanthemum boreale 日本本州 honshu，japan 9 龙脑菊 chrysanthemum japonicum 日本本州 honshu，japan 10 阴岐油菊 chrysanthemum okiense 日本本州 honshu，japan 11 异色菊 chrysanthemum dichrum 中国河北 hebei，china 12 那贺川野菊 chrysanthemum yoshinaganthum 日本四国 shikoku，japan 13 萨摩野菊 chrysanthemum ornatum 日本九州 kyushu，japan 14 绢毛蒿 artemisia sericea 中国南京 nanjing，china 15 牡蒿 artemisia japonica 中国南京 nanjing，china 16 多花亚菊 ajania myriantha 中国四川 sichuan，china 17 细裂亚菊 ajania przewalskii 中国四川 sichuan，china 18 矶菊 ajania pacifica 中国南京 nanjing，china 1.2 基因组 dna 提取与检测 选取健康无病害的嫩叶，置于冰盒中带回实验室，采用改进的 ctab 法提取基因组 dna（马月 萍和戴思兰，2009） 。用核酸仪检测 dna 浓度和纯度，用 0.8%琼脂糖凝胶电泳法检测其质量，将 dna 浓度稀释至 50 ng l-1 后置于20 保存备用。 1.3 scot-pcr 反应体系的正交试验设计和退火温度筛选 选用 l16(45)正交试验设计（表 2） ，对 mg2+和 dntps 浓度、taqdna 聚合酶、引物和 dna 用量 进行 5 因素 4 水平的正交试验。以切花菊神马dna 为模板，28 号引物为扩增引物（引物序列 见表 3） ，反应总体积 25 l，含有 10 pcr buffer 2.5 l。每个处理重复 3 次。 根据正交试验结果选择最佳反应体系对退火温度进行梯度试验，设定了 12 个温度梯度：45.0、 45.3、46.0、47.0、48.2、49.4、50.6、51.8、53.0、54.0、54.7 和 55.0 。除退火温度不同外，反应 程序与正交试验设计相同。 2018 园 艺 学 报 40 卷 1.4 scot-pcr 扩增与检测 pcr 扩增反应在 biometra tgradient pcr 仪上进行，扩增程序为：94 预变性 4 min；94 变 性 50 s， 49.4 退火 35 s， 72 延伸 45 s， 35 个循环； 72 延伸 7 min。 扩增反应结束后， 加入 2 l 6 loading buffer，取 8 10 l 扩增产物在 1.0%琼脂糖凝胶中电泳，电极缓冲液为 1 tae，染色后 在紫外灯下拍照。 1.5 scot-pcr 反应体系的验证与多态性引物筛选 以菊花脑、南京野菊和切花菊神马的基因组 dna 为模板，引物序列参照 collard 和 mackill （2009） ，按照上述优化的 scot-pcr 体系进行菊属植物 scot 分子标记，分别采用 1.0%琼脂糖凝 胶电泳和 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法检测 pcr 扩增产物。聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲 液为 1 tbe，电泳结束后银染显色。比较和评价两种检测方法的效果，同时筛选出多态性好、条 带清晰的引物。 1.6 数据分析 根据 pcr 扩增产物的电泳结果，对清晰且易于辨认的条带采用“0-1”系统记录其位置，在凝 胶的某个相同迁移率位置上有条带的记为“1” ，无条带的记为“0” ，建立 scot 标记的 0、1 矩阵。 用 ntsys-pc2.1 软件中的 dice 法计算样品间的相似系数，并用不加权成对算术平均法（unweight pair-group method using arithmetic averages，upgma）进行聚类分析。 2 结果与分析 2.1 菊属植物 scot-pcr 反应体系 2.1.1 正交试验结果分析 从正交试验扩增结果电泳图可以看出 16 个组合扩增出的条带数量及清晰度有所不同（图 1） ， 其中组合 10、14 和 15 扩增的条带数量较多，也较为清晰。 图图 1 正交设计试验正交设计试验 pcr 产物电泳结果产物电泳结果 m：dl5000 marker；1 16：处理编号同表 2。 fig. 1 electrophoresis of orthogonal design pcr products m：dl5000 marker；116：treatment no. same as table 2. 根据桂腾琴等（2009）的方法，对结果进行评分和直观分析，条带数量多且清晰的结果记 25 分，最差的记 1 分，根据各因素水平下的得分数据平均值 ki 可以确定各个因素的最适浓度（得分最 高） ，分析结果中极差（r 值）反映各个因素对反应体系的影响程度。因此，由分析结果（表 2）得 10 期 李丕睿等：菊属植物 scot 分子标记技术在遗传多样性分析中的应用 2019 出正交设计中的 5 个因素对 scot-pcr 反应体系的影响从大到小为：mg2+、dntps、模板 dna、taq dna 聚合酶、引物。从 k 值结果来看，初步确定 5 个因素的最适用量分别为：mg2+ 1.4 mmol l-1， dntps 0.15 mmol l-1，引物 0.8 mol l-1，taq dna 聚合酶 1 u，模板 dna 50 ng。这个体系与组 合 10 最为接近，只是 mg2+浓度有所不同。综合正交试验设计的直观分析与统计分析，考虑到 mg2+ 浓度 1.2 mmol l-1与 1.4 mmol l-1的 k 值差异较小， 所以最终确定菊属植物 scot-pcr 的最佳反应 体系为：1.20 mmol l-1 mg2+、dntps 0.15 mmol l-1，引物 0.8 mol l-1，taq dna 聚合酶 1 u， 模板 dna 50 ng，总体积 25 l。 表表 2 scot-pcr 反应体系反应体系 l16(45)正交设计及直观分析表正交设计及直观分析表 table 2 l16(45) orthogonal design for scot-pcr and intuitive analysis 处理组合 treatment no. mg2+/ (mmol l-1) dntps/ (mmol l-1) taq/u 引物浓度/ (mol l-1) primer concentration dna/ng 得分 score 1 0.8 0.05 0.50 0.2 20 8 2 0.8 0.15 0.75 0.4 30 1 3 0.8 0.20 1.00 0.6 40 1 4 0.8 0.25 1.25 0.8 50 1 5 1.0 0.05 1.00 0.4 50 20 6 1.0 0.15 1.25 0.2 40 12 7 1.0 0.20 0.50 0.8 30 14 8 1.0 0.25 0.75 0.6 20 4 9 1.2 0.05 1.25 0.6 30 10 10 1.2 0.15 1.00 0.8 20 25 11 1.2 0.20 0.75 0.2 50 18 12 1.2 0.25 0.50 0.4 40 7 13 1.4 0.05 0.75 0.8 40 11 14 1.4 0.15 0.50 0.6 50 23 15 1.4 0.20 1.25 0.4 20 19 16 1.4 0.25 1.00 0.2 30 8 k1 2.8 12.3 13.0 11.5 14.0 k2 12.5 15.3 8.5 11.8 8.3 k3 15.0 13.0 13.5 9.5 7.8 k4 15.3 5.0 10.5 12.8 15.5 r 12.5 10.3 5.0 3.3 7.8 注：k1 k4：各因素水平下的得分数据平均值；r：极差。 note：k1k4：mean of scores in five factors；r：range. 2.1.2 最适退火温度的确定 利用正交设计得到的 scot-pcr 优化体系进行最适退火温度的筛选，由图 2 可以看出退火温度 图图 2 退火温度对菊属植物退火温度对菊属植物 scot-pcr 反应的影响反应的影响 m：dl5000 marker；1 12：45.0、45.3、46.0、47.0、48.2、49.4、50.6、51.8、53.0、54.0、54.7 和 55.0 。 fig. 2 the effect of annealing temperature on scot amplification m：dl5000 marker；112：45.0，45.3，46.0，47.0，48.2，49.4，50.6，51.8，53.0，54.0，54.7 and 55.0 . 2020 园 艺 学 报 40 卷 在 45.0 55.0 时，均可获得条带，但退火温度低于 45.3 时，扩增条带弱且模糊，在 49.4 时 条带多且清晰，扩增结果最为理想。此后随着退火温度的升高，特异性增强，条带减少。因此确定 最适退火温度为 49.4 。 2.2 菊属植物 scot-pcr 反应体系验证及多态性引物筛选 利用优化的反应体系和最适退火温度，对菊花脑、南京野菊和切花菊神马的基因组 dna 进行 scot-pcr 扩增，引物序列参照 collard 和 mackill（2009） 。1.0%琼脂糖凝胶电泳（图 3，a） 和 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 pcr 扩增产物的结果显示（图 3，b） ，多数引物能扩增出清 晰的条带，且分散良好、重复性高，说明建立的 scot-pcr 反应体系稳定可靠，适用于菊属材料基 因组 dna 的 scot 标记分析。比较两种电泳方法的结果可以看出：聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的条 带更加丰富，多为 7 20 条，条带片段大小主要集中在 150 2 000 bp，且条带分散良好，多态性比 率及分辨率较琼脂糖凝胶电泳的结果更高， 更适合于大量菊花及其近缘种属材料的遗传多样性分析。 以菊花脑、南京野菊和切花菊神马的基因组 dna 为模板，应用建立并优化好的菊属植物 scot-pcr 反应体系及 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法， 筛选 scot 引物， 从 36 条 scot 引物 中共获得扩增结果稳定、条带清晰、多态性丰富的引物 12 条（表 3） ，引物扩增产物的电泳检测结 果如图 3，b 所示。 图图 3 菊花脑（菊花脑（2x） 、南京野菊（） 、南京野菊（4x）和切花菊神马 （）和切花菊神马 （6x）基因组）基因组 dna 的的 scot-pcr 扩增结果扩增结果 a：1.0%琼脂糖凝胶电泳；b：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 a、b、c 分别为菊花脑、南京野菊和切花菊神马的 scot-pcr 扩增结果；数字为所用引物编号（同表 3） ； m1：dl2000；m2：100 bp dna 分子质量标准。 fig. 3 amplifi cation products generated by scot primers with chrysanthemum nankingense（2x） ，） ，chrysanthemum indicum（4x）and chrysanthemum morifoliumjinba （ （6x）dna templates a：1.0% agarose gel electrophoresis；b：8% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. a， b and c show the amplifi cation results with chrysanthemum nankingense， chrysanthemum indicum and chrysanthemum morifolium jinba dna templates respectively. the primers id are shown above the short transverse lines as the same as those in table 3. m1：dl2000；m2：100 bp dna ladder. 10 期 李丕睿等：菊属植物 scot 分子标记技术在遗传多样性分析中的应用 2021 2.3 菊花近缘种属材料 scot 遗传多样性分析 2.3.1 scot 条带多态性分析 利用筛选出的 12 条引物对 18 份菊花近缘种属材料进行扩增，共扩增出 209 条带，其中 189 个 条带具有多态性，占总条带数的 90.4%，说明供试样品的遗传多样性比较丰富（表 3） 。每个引物可 扩增出多态性条带 10 25 条，平均 15.75 条，产物条带多介于 250 2 000 bp（图 4） 。 表表 3 筛选出的筛选出的 scot 引物序列及对引物序列及对 18 份菊花近缘种属材料的扩增结果份菊花近缘种属材料的扩增结果 table 3 the sequences of reliable scot primers and the amplified results for 18 species of chrysanthemum and its related genera 引物编号 primer id 序列(53) sequences 扩增条带数 number of amplified bands 多态性条带数 number of polymorphic bands 多态性比率/% polymorphic ratio 2 caacaatggctaccaccc 27 25 92.59 8 caacaatggctaccacgt 21 19 90.48 11 aagcaatggctaccacca 20 16 80.00 12 acgacatggcgaccaacg 13 12 92.31 15 acgacatggcgaccgcga 18 18 100.00 16 accatggctaccaccgac 16 15 93.75 18 accatggctaccaccgcc 14 12 85.71 21 acgacatggcgacccaca 10 10 100.00 24 caccatggctaccaccat 18 15 83.33 28 ccatggctaccaccgcca 14 12 85.71 29 ccatggctaccaccggcc 22 20 90.91 32 ccatggctaccaccgcac 16 15 93.75 平均 mean 17.42 15.75 90.43 总计 total 194 189 图图 4 引物引物 32（a） 、） 、2（b）和）和 15（c）对）对 18 份菊花近缘种属材料的份菊花近缘种属材料的 scot-pcr 扩增图谱扩增图谱 1 18 泳道编号代表的材料同表 1；m：100 bp dna 分子质量标准。 fig. 4 scot fi ngerprintings of 18 species of chrysanthemum and its related genera based on primers 32（a） ，） ，2（b）and 15（c） 118 lane codes represent the species as the same as those in table 1. lane m shows the 100 bp dna ladder. 2.3.2 相似性系数分析 用 ntsys-pc2.1 软件计算 12 条 scot 引物扩增结果在菊花近缘种属材料之间的相似性系数， 结果表明 18 份菊花近缘种属材料的遗传相似性系数范围为 0.4516 0.7035， 平均遗传相似性系数为 0.58。其中同属于菊属的甘菊（c. lavandulifolium）和异色菊（c. dichrum）的相似性系数最高，为 0.7035；菊蒿属菊蒿（tanacetum vulgare）和芙蓉菊属芙蓉菊（crossostephium chinense）的相似性 2022 园 艺 学 报 40 卷 系数最低，为 0.4516。 对得到的遗传相似性系数进行分析，菊属材料中甘菊与异色菊的相似性系数最大，为 0.7035； 龙脑菊与异色菊的相似性系数最小，为 0.5258。采集地同为日本九州的大岛野路菊与萨摩野菊的相 似性系数也较高，为 0.6842。亚菊属的 3 个材料多花亚菊、细裂亚菊和矶菊之间的相似性系数均大 于等于 0.6000，说明它们之间的遗传关系较近。芙蓉菊属芙蓉菊与其他材料的相似性系数平均值最 低，仅为 0.5260；其次是菊蒿属菊蒿，为 0.5301。由此推断菊属甘菊与异色菊的亲缘关系较近，而 龙脑菊与异色菊相对较远。多花亚菊、细裂亚菊和矶菊之间的遗传关系较近，芙蓉菊属芙蓉菊及菊 蒿属菊蒿与其他材料间遗传关系较远。 2.3.3 聚类分析 根据各材料间的相似性系数，采用不加权成对算术平均法（upgma）进行聚类分析（图 5） 。 结果表明，在相似系数 0.530 的水平，可以将 18 份菊花近缘种属材料分成、两个大组，组包 括芙蓉菊属芙蓉菊和蒿属绢毛蒿，其余 16 份材料均属于组。组在相似系数 0.615 水平又分为 6 个亚组，用字母 a f 标识，a 亚组为菊蒿属菊蒿；b 亚组为菊属菊花脑；c 亚组包含 9 份材料， 其中只有多花亚菊和矶菊属于亚菊属，其余 7 份材料均属于菊属，采集地同为日本的泡黄金菊、那 贺川野菊、萨摩野菊和阴岐油菊在相似系数 0.650 水平已聚在一起；d 亚组包含菊属的甘菊和异色 菊两份材料，它们之间的相似性系数最大，在 0.700 水平即聚在一起，位于整个聚类图的最基部；e 亚组包含蒿属牡蒿和亚菊属细裂亚菊；f 亚组只有菊属龙脑菊。 图图 5 18 份菊花近缘种属材料份菊花近缘种属材料 scot 聚类图聚类图 fig. 5 upgma dendrogram of 18 germplasms based on scot marker 3 讨论 采用 scot 分子标记技术对 18 份菊花近缘种属材料进行遗传多样性研究，选用的 12 条 scot 引物具有很高的条带多态性，平均多态率达到 90.4%，高于前人在杧果（luo et al.，2010，2011） 、 10 期 李丕睿等：菊属植物 scot 分子标记技术在遗传多样性分析中的应用 2023 柑橘（韩国辉 等，2011a；蒋巧巧 等，2011） 、菠萝（陈香玲 等，2012） 、龙眼（陈虎 等，2009， 2010）及罗汉松（韦泳丽 等，2012）等种间、品种间的多态性条带百分率。在菊属植物中，周春玲 和戴思兰（2002）利用 aflp 技术对 12 个分类群进行分析，得到的条带多态率为 85.7%；张鲜艳等 （2011）分别利用 issr 和 srap 分子标记对 11 份不同地理居群野生菊的遗传多样性进行分析，两 种标记得到的条带多态率分别为 91.9%和 97.5%。 菊科 （asteraceae） 是被子植物四个最大的科之一， 包含大约 1 000 个属 25 000 30 000 多个种。 篙亚族 artemisiinae 是东亚地区最主要的亚族，包含菊属 chrysanthemum、亚菊属 ajania、芙蓉菊属 crossostephium 和蒿属 artemisia 等 19 个属（bremer & humphries，1993） 。其中研究较多的菊属由 于其新种及变种的不断发现、天然或人工杂交种的不断产生，使它的组成及其与近缘属种的亲缘关 系一直存在很大分歧（陈发棣 等，2008） 。ohashi 和 yonekura（2004）把矶菊（c. pacificum） 、盐 菊（c. shiwogiku）归在菊属里，而 bremer 和 humphries（1993）则把它们归到亚菊属。在广义菊属 里，亚菊属被认为与菊属的亲缘关系最近，两个属间有很多杂种，目前日本已将亚菊属归到菊属里， 作为菊属中的一个组（ohashi & yonekura，2004） 。kitamura（1990）把中国的多花亚菊（ajania myriantha）和栎叶亚菊（a. quercifolia）也归到了菊属。在本研究中，基于 scot 标记的 upgma 聚类结果显示， 多花亚菊和矶菊与多数菊属材料在相似性系数 0.615 水平已聚为一类 （组 c 亚组） ， 表明它们之间的亲缘关系较近； 但同时值得注意的是， 另一亚菊属材料细裂亚菊与菊属材料在 0.591 水平才聚为一类，表明它与菊属材料的关系相对远一些。本研究涉及的 11 份菊属材料中，甘菊和异 色菊的相似性系数最大，为 0.7035，聚类图上的关系最近，可能与两份材料均为二倍体，采集地分 别为北京和河北，采集地的地理位置也较近有关。在组 c 亚组中，采集地同为日本的泡黄金菊、 那贺川野菊、萨摩野菊及阴岐油菊在相似性系数 0.656 处即聚为一类，位于树状聚类图的基部，说 明它们之间的亲缘关系较近，与之相应的是 bremer 和 humphries（1993）研究认为二倍体泡黄金菊 和龙脑菊是四倍体野菊和那贺川野菊的亲本。本研究中，菊属龙脑菊比较特殊，在组中自成 f 亚 组，在相似性系数 0.569 水平才与其余菊属材料聚成一类。khaung 等（1995）曾通过染色体分带技 术，根据着丝粒 dapi 带型差异，认为泡黄金菊和龙脑菊曾经发生过染色体重组，本研究结果与之 有一定的一致性。 狭义菊属与菊蒿属之间的关系一直是争议的焦点，菊蒿属的羽状复叶和二回羽状复叶明显地区 别于菊属，gish 研究结果（kondo et al.，1999）和基于叶绿体 rpl16 rpl14 基因间区序列、gs 基 因序列的研究结果（陈素梅 等，2007）都表明菊属和菊蒿属的亲缘关系较远，支持将菊蒿属单列出 狭义菊属。在本研究结果中，菊蒿位于组 a 亚组，自成一亚组，与菊属材料间的相似性系数均较 小，这与前人的研究结果一致。聚类图中可看出菊属材料中菊花脑是与菊蒿关系相对最近的，赵宏 波等（2008）在菊属与春黄菊族部分属间杂交亲和性的研究中发现菊蒿的花粉可在菊花脑柱头上附 着并萌发，且菊属与亚菊属、菊蒿属的亲和性最好，而芙蓉菊属与菊属植物杂交不亲和，这些结果 从生殖学角度说明了属种之间亲缘关系的远近。根据 its 区序列和 its 区、igs 间区序列拼接得到 的系统树表明蒿属与芙蓉菊属在一个亚分支里，关系较近，同属于蒿属群（赵宏波，2007） 。本研究 得到的聚类图中，芙蓉菊与绢毛蒿在相似性系数 0.612 处聚在一起，并组成组，同时它们与菊属、 亚菊属材料的关系较远。 references andersen j r，lbberstedt t. 2003. functional markers in plants. trends in plant science，8 (11)：554560. bremer k，humphries c j. 1993. generic monograph of the asteraceae-anthemideae. bulletin of the natural history museum. botany series，23： 71177. 2024 园 艺 学 报 40 卷 chen fa-di，zhao hong-bo，li chang，chen su-mei，fang wei-min. 2008. advances in cytology and molecular cytogenetics of the genus dendranthema. journal of nanjing agricultural university，31 (1)：118126. (in chinese) 陈发棣，赵宏波，李 畅，陈素梅，房伟民. 2008. 菊属植物细胞学与分子细胞遗传学研究进展. 南京农业大学学报，31 (1)：118126. chen hu，he xin-hua，luo cong，gao mei-ping，zhu jian-hua. 2009. the optimization of scot-pcr system of longan（dimocarpus longan）. genomics and applied biology，28 (5)：970974. (in chinese) 陈 虎，何新华，罗 聪，高美萍，朱建华. 2009. 龙眼 scot-pcr 反应体系的优化. 基因组学与应用生物学，28 (5)：970974. chen hu，he xin-hua，luo cong，zhu jian-hua，li feng. 2010. analysis on the genetic diversity of 24 longan（dimocarpus longan）accessions by scot markers. acta horticulturae sinica，37 (10)：16511654. (in chinese) 陈 虎，何新华，罗 聪，朱建华，李 峰. 2010. 龙眼 24 个品种的 scot 遗传多样性分析. 园艺学报，37 (10)：16511654. chen su-mei，chen fa-di，zhao hong-bo，fang wei-min. 2007. phylogenetic analysis of several taxa of chrysanthemum based on rpl16-rpl14 sequence and gs sequence. jiangsu agricultural sciences，(6)：111115. (in chinese) 陈素梅，陈发棣，赵宏波，房伟民. 2007. 基于 rpl16-rpl14、gs 序列的广义菊属若干分类群亲缘关系研究. 江苏农业科学，(6)：111 115. chen xiang-ling，su wei-qiang，liu ye-qiang，ren hui，lu yu-ying. 2012. analysis on genetic diversity of 36 pineapple collections by scot markers. southwest china journal of agricultural sciences，25 (2)：625629. (in chinese) 陈香玲，苏伟强，刘业强，任 惠，陆玉英. 2012. 36 份菠萝种质的遗传多样性 scot 分析. 西南农业学报，25 (2)：625629. collard b，mackill d. 2009. start codon targeted（scot）polymorphism：a simple，novel dna marker technique for generating gene-targeted markers in plants. plant molecular biology reporter，27 (1)：8693. gui teng-qin， sun min， qiao ai-min，wang xin-yan. 2009. optimization of an issr reaction system of japanese apricot（prunus mume） based on orthogonal design. journal of fruit science，26 (1)：108112. (in chinese) 桂腾琴，孙 敏，乔爱民，王心燕. 2009. 正交设计优化果梅 issr 反应体系. 果树学报，26 (1)：108112. han guo-hui， xiang su-qiong， wang wei-xing， jia zhi-gang， hong qi-bin， liang guo-lu. 2011a. establishment and application of scot molecular marker system for citrus. acta horticulturae sinica，38 (7)：12431250. (in chinese) 韩国辉，向素琼，汪卫星，贾志刚，洪棋斌，梁国鲁. 2011a. 柑橘 scot 分子标记技术体系的建立及其在遗传分析中的应用. 园艺学报， 38 (7)：12431250. han guo-hui， wang wei-xing， xiang su-xiong， bian yu， guo qi-gao， he qiao， li xiao-lin， li