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电子显微镜技术发展综述 摘要：本文论述了电子显微镜的发展现状及历史，介绍了目前较为先进的数种电子显微镜的结构、原理以及其在生物学领域的应用情况，并对其在组织学研究中的应用进行探讨。关键词：电子显微镜；组织学研究引言：显微技术是一门对于物质微小区域进行化学成分分析、显微形貌观察、微观结构测定的一门专门的显微分析技术。20世纪30年代，透射电子显微镜（tem）的发明标志着电子显微技术的诞生，人们可以进一步地研究物质的超微结构。电子显微技术在普通光学显微技术基础上进一步拓宽了人们的观测视野，在各个领域发挥了重要的作用，被广泛应用于科学领域。在生物学研究领域，电子显微技术推进了组织学，细胞生物学，分子生物学等学科的发展，因而具有不可替代的崇高地位。一、电子显微镜技术1.1电子显微镜的定义与组成电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器1电子显微镜由镜筒、真空装置和电源柜三部分组成。镜筒主要有电子源、电子透镜、样品架、荧光屏和探测器等部件，这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体。电子透镜：用来聚焦电子，是电子显微镜镜筒中最重要的部件。一般使用的是磁透镜，有时也有使用静电透镜的。它用一个对称于镜筒轴线的空间电场或磁场使电子轨迹向轴线弯曲形成聚焦，其作用与光学显微镜中的光学透镜（凸透镜）使光束聚焦的作用是一样的，所以称为电子透镜。光学透镜的焦点是固定的，而电子透镜的焦点可以被调节，因此电子显微镜不象光学显微镜那样有可以移动的透镜系统。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，由很稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。电子源：是一个释放自由电子的阴极，栅极，一个环状加速电子的阳极构成的。阴极和阳极之间的电压差必须非常高，一般在数千伏到3百万伏之间。它能发射并形成速度均匀的电子束，所以加速电压的稳定度要求不低于万分之一。样品架：样品可以稳定地放在样品架上。此外往往还有可以用来改变样品（如移动、转动、加热、降温、拉长等）的装置。探测器：用来收集电子的信号或次级信号。1.2基本原理不同类型的电子显微镜成像原理各有差异，但均是利用电磁场来偏转、聚焦电子束，再依据电子与物质作用的原理来研究物质的构造。其中透射式电子显微镜产生的电子束经聚光镜会聚后均匀照射到试样上的待观察区域，入射电子与试样物质相互作用，由于试样很薄，绝大部分电子穿透试样，其强度分布与所观察试样区的形貌、组织、结构一一对应。投射出试样的电子经三级磁透镜放大投射在观察图形的荧光屏上，荧光屏将电子强度分布转化为人眼可见的光强分布，于是在荧光屏上显出与试样形貌、组织、结构相应的图像。扫描电子显微镜（sem）是聚焦电子束在线圈驱动下对试样表面逐点栅网式扫描成像，成像信号为二次电子、背散射电子或吸收电子。二次电子信号被探测器收集转换成电讯号，经处理后得到反应试样表面形貌的二次电子像。背散射电子成像反映样品的元素分布，及不同相成分区域的轮廓。此外由于电子的德布罗意波长较短，分辨率比光学显微镜高的很多，可以达到0.10.2nm，放大倍数从几万到百万倍。1.3技术发展史世界上第一台电子显微镜（透射式电子显微镜（tem）由德国科学家ruska和knoll于1931年研制成功。二战后，ruska继续对tem进行研究改进，并制造出了放大倍数在10万倍以上的显微镜，并因此获得了诺贝尔物理学奖。在tem的基础上，英国工程师charles于1952年发明了世界上第一台扫描电子显微镜（sem）。扫描电镜主要是针对具有高低差较大、粗糙不平的厚块试样进行观察，因而在设计上突出了景深效果，一般用来分析断口以及未经人工处理的自然表面；而透射电镜则突出的是高分辨率，使用透射电镜观察样品能获得高分辨率的超微结构图像，在材料科学和生物学上应用较多，同时也是病理学上的诊断工具，该技术的关键是超薄切片的制备。在这以后场发射扫描电子显微镜（fe-sem）、场离子显微镜（fim）、低能电子衍射（leed）、俄歇谱仪（aes）、光电子能谱（esca）等相继诞生，在各科学领域的研究中起重要作用。1981年gbinnig和hrohrer成功研制了世界上第一台扫描隧道显微镜（stm），并因此获得诺贝尔物理奖它的出现，使人类第一次能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学性质，被国际科学界公认为80年代世界十大科技成就之一。扫描隧道显微镜(stm)是利用导体针尖与样品之间的隧道电流，并用精密压电晶体控制导体针尖沿样品表面扫描，从而能以原子尺度记录样品表面形貌的新型仪器其分辨率已达到1nm2nm，用它可研究各种金属、半导体和生物样品的表面形貌，也可研究表面沉积、表面原子扩散、表面粒子的成核和生长，吸附和脱附等。在stm出现以后，又陆续发展了一系列工作原理相似的新型显微技术，包括原子力显微镜（afm）、横向力显微镜（lfm）等，这类基于探针对被测样品进行扫描成像的显微镜统称为扫描探针显微镜（spm）。扫描探针显微镜是纳米测量学、纳米表征与测量方法中最重要最基本的手段。它能以原子级的探针和被测样品表面作为工作的主要元件，在x和y两个方向上完成探针与样品之间的扫描，同时在z方向的升降来模拟样品表面的起伏。用探针与样品间的相互作用所产生的物理量的数值随样品表面起伏的变化来达到观察样品表面形貌的目的。这种仪器分辨率高，横向分辨率可达01nm，纵向分辨率可达001nm，可以直接观察测定样品的三维图像，可以在大气、真空甚至液体中，在高温或低温下进行观测。检测时可以不与样品接触，故不会损伤样品，也不需要电子束照射，因而不会对样品造成辐射损伤。1二、我国电子显微镜技术的发展1958年，我国成功地研制了第一台电子显微镜，1988年中国科学院白春礼和姚俊恩研制出了我国的第一台stm。22000年,中国电子显微镜学会统计中国大陆保有量不到2000台,中国加入wto后,经济大发展,科研教育以及产业构都在升级目前，我国电子显微镜市场每年以近百套的数量在增长，可以预期，在未来数年内中国电子显微镜市场容量将居世界首位。中国市场的电子显微镜，日本电子的市场占有率超过50%，排在首位。紧随其后的是fei（原飞利浦电镜部）、日本日立（天美代理）、德国carl zeiss（原德国leo）和日本岛津。而在国产厂家方面，主要是中科科仪、南京江南光电和上海电子光学技术研究所，产品主要集中在低端的扫描电子显微镜市场。就市场总体情况而言，国产电镜国内市场占有率不足10%。由此可见我国国产电子显微镜还有较大幅度的提升空间。从种类上看扫描电镜占目前中国电子显微镜总保有量的63.61%，透射电镜则为36.39%，可见扫描电镜在我国有着更为广泛的用户基础。3三、电子显微镜技术的未来发展趋势3.1远程电子显微镜技术自上世纪九十年代以来，随着计算机技术和网络技术的发展，远程电子显微镜逐渐出现，它可以将实验室现场获得的实时信息展现给远端用户，使其可以通过互联网实时观看样品图像，并远程操作仪器来完成实验。4远程电子显微镜技术的关键在于图像的采集、压缩和传输。在图像采集方面，现在的电子显微镜已经有了长足的进步。老式的电子显微镜多采用数码相机和视频采集卡来采集图像，新式电子显微镜多采用vga采集卡进行图像采集并已成为未来发展趋势。此外运用软件来采集图像的新方式也逐渐出现。早期，图像的压缩使用的是jpeg图像压缩法，即远端用户所见的是一系列独立的静态样品图像。现在，随着技术的发展，mpeg4和h.264等视频压缩算法被逐渐运用到了样品图像的压缩。现在，样品图像的传输主要通过tcp协议和udp协议，但其占用带宽过大，传输效果并不理想。为了改善传输性能，专门的数据传输系统“金字塔”式网络传输模型以及专有传输网络正在研究之中，同时这也是现阶段远程电子显微镜的改进方向。1990年，carl zmola等人实现了对sem的样品图像网络传输，首次建立了远程电镜的样品图像实时传输系统。随后，美国各大学相继建立了各自的sem远程系统。样品传输的效能也有了长足进步，最初，在800mb的光纤网络中，样品图像的传输效能是每17秒传送1帧。到了2000年，在12mb的网络中，样品图像的传输可以达到每秒传送5帧。在技术上尚有很大程度的提升空间。在中国，尽管各大院校及研究机构中有数千台电子显微镜，但仍不能满足日益增长的应用需求，因此远程电子显微镜技术的研究对于中国是很有应用价值的。3.2低温电子显微镜技术低温电子显微镜技术是应用冷冻(物理)方法制备生物样品并进行观察的技术，因而在生物学组织学中的应用较为广泛。与常规电镜技术(化学方法)相比较，其可最大程度地维持样品在生活时的生理状态，可运用于生物大分子的动态过程研究以及细胞核组织的三维结构分析。3.3低温电镜下的三维重构技术电子显微镜的三维成像技术是电子显微和计算机完美结合的产物，它利用电子显微镜收集样品的二维投影图像，经过计算机处理重构出样品的三维空间结构。三维成像技术在生物学领域的应用十分广泛，尤其体现在对蛋白质的三维结构分析上。早期的三维成像技术主要使用重金属盐溶液对样品进行染色，其分辨率较低，且无法维持样品的含水环境，且辐照对样品的损伤会导致高分辨率结构的丢失。51974年，taylor和glaeser利用低温电镜技术完美的解决了早期三维成像的缺陷，低温冷冻既能维持样品的含水条件又能维持电镜工作所需的高真空环境同时还可以减少辐照损伤。从1990年起，低温电镜下的三维成像技术逐渐在全世界得到普及。我国在应用低温电子显微镜三维重构技术研究蛋白质等生物大分子的三维结构研究起步较晚，最早的工作是上世纪八十年代开始的。现在我国已经可以实现从纳米尺度到微米尺度的纳米分辨率水平的三维成像，同时实现数据的自动化收集和实时共享。3.4低温电镜下的电子断层成像技术电子断层成像术是通过获取同一区域多角度的投影图来得到原样品的结构，其优势在于可以研究不具备周期性或全同性的生物大分子复合体系或细胞器的结构。而在低温电镜下，人们可以看到整个细胞内的结构和动态变化，从而可以研究亚细胞量级的生物学过程。电子断层扫描技术可以对细胞体内以及分离出来的细胞器进行三维重构，并提供了在纳米尺度范围内对细胞器环境下蛋白质及分子机器的结构进行重构的方法，对研究自然环境下各种分子机器的结构与功能的关系、它们在细胞中的空间布局，以及精细的细胞结构等具有重要意义。6我国在电子断层成像技术受高性能冷冻电子显微设备的缺乏产生了很大的制约。近年来，国家对冷冻电子显微学重要前景的重视和对科研投入的增多，目前国内已经拥有了多台高端冷冻电子显微镜研究设备，其中一些单位也建成了一流的适合冷冻电子断层成像研究开展的设施。同时，更多的冷冻电镜设备也正在购置当中。四、总结与展望电子显微镜技术在短短数十年间取得巨大的进步，其在各个学科领域的应用也日益普及。尽管现在电子显微镜尚且存在许多问题，但可以肯定，电子显微镜技术还具有很大的发展潜力。尤其是近些年来，现代计算机技术与电子显微镜技术的结合的研究更是取得了相当大的进展。可以想见，未来电子显微镜将发挥越来越重要的作用。参考文献：1 王永礼，屠恒贤.电子显微镜的发展以及在出土纺织品检测上的应用j.物理与工程，2005,3,152 yao jun-en. development and production of electron m