基因工程工具酶教学PPT.ppt

限制性核酸内切酶 dna聚合酶 连接酶 核酸酶 基因工程的工具酶 1 核酸酶（nucleases） 1. 核酸外切酶 2. 核酸内切酶 2 dna分子糖-磷酸主键的破坏称为切口（nick） dna分子中核苷酸缺失称为缺口（gap） 连接修复3端羟基和5端磷酸基团，形成3-5磷酸二酯键 连接酶 dna ligase t4噬菌体dna连接酶 3 t4-dna连接酶（t4-dna ligase） 来源于t4噬菌体感染的大肠杆菌 连接双链dna上的单链口（nick），亦可连接限 制内切酶所产生的粘性末端。 连接平头双链dna速度很慢，在高浓度的底物和 酶的作用下方可进行，分子之间的连接。 反应条件： ph为7.57.6， 平端连接用20-25，粘端连接用12左右。 use 4 animation of the ligation process. when the sticky ends of two dna fragments come together and hydrogen bond through the a-t and g-c pairing, the enzyme ligase will form covalent bonds between the two fragments. 5 the specific cutting and ligation of dna gaattc cttaag gaattc cttaag g cttaa aattc g aattc g g cttaa g cttaa aattc g g cttaa aattc g g cttaa aattc g ecori dna ligase ecori sticky endecori sticky end 6 dna聚合酶（以dna为模板合成dna） rna聚合酶（以dna为模板合成rna） 逆转录酶（以rna为模板合成dna） 聚合酶（polymerase） 7 大肠杆菌dna聚合酶i (大肠杆菌dna聚合酶i )klenow片段 t4 dna聚合酶 t7 dna聚合酶 taq dna聚合酶 反转录酶 dna聚合酶 8 一、大肠杆菌一、大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 i i 1 1 三三种酶种酶活性活性 1 ）dna聚合活性 dttp 3 3 a t g c a a t t g c 5 | | | | 5 t a c g ppi t 1、聚合反应具有方向性: 5 3 2、dna 聚合酶不能催化两个游离的脱氧 核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的 3- oh 逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸 链不断延长。 9 3 3 3 3 引物引物 10 2 2）核酸外切酶活性）核酸外切酶活性 5 a g c t t c a g g a t a 3 | | | | | | | | | | | 3 t c g a a g t c c t a g 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性 能切除突变的 dna片段 能辨认错配的碱基对，并将其水解 11 5 3 2 应用 1)切口移位法标记dna 在dnase的作用基础上产生链内切口，应用此酶的53聚合酶活性 和53外切核酸酶活性的同步联合反应，使切口沿dna链从5-端向3- 端移动。若用于聚合反应的原料dntp带有放射性核素32p，就能使生成 的双链带有标记物。 12 13 53 5 3 2) 3-粘端的末端标记 先利用此酶的35外切核酸酶活性，切除凸出的3-粘端， 形成5-凸出粘端；再以其53聚合酶活性使其补平，在高浓度 的dntp条件下，使3-端的外切反应与dntp的搀入反应达到平衡 。若dntp中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3-末端带 标记的dna。 14 裂解裂解 变性变性 显影显影 15 3 3 合成合成cdnacdna的第二链的第二链 cdnacdna 5 3 5 3 16 53聚合酶活性：催化单核苷酸到 dna 3-oh端 35外切酶活性：从游离的3端降解单核苷酸 53外切酶活性：从游离的5端降解双链dna成为 单核苷酸 大肠杆菌dna聚合酶i（e.coli dna pol i） 1. 随机引物标记核酸探针 2. 5-粘端补平或3端标记 3. 合成cdna的第二链 4. dna序列分析 5. 3-端的末端标记 应用 17 小片段小片段 n n 端端c c 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 i i 5 核酸外切酶活性 大片段大片段 （ klenowklenow 片段片段 ） dna聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 18 蛋白酶降解dna聚合酶 i 获得其大片段称为 klenow片段， 只有 53聚合酶活性, 35外切酶活性。 use 催化dna切口平移反应，制备探针 对dna分子进行末端标记 19 催化以 rna 为模板的 dna 聚合反应 催化合成出互补dna（cdna） 可构建cdna文库 use complementary dna 二、反(逆)转录酶 ( rna依赖/指导的dna聚合酶 ) 20 催化dntp dna分子中3-oh端 给载体或cdna加上互补的多聚体尾巴; dna片断3末端标记 在mg2+ 条件下，选择3oh端单链dna为引物加成核苷酸，在co2+ 存在的条 件下，选择3oh端双链dna为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。 末端转移酶（tdt） 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtmg2+ datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 不需要模板的dna聚合酶，随机掺入dntps 21 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtco2+ , datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa oh 3 p 5 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtco2+ datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 aaaaaaaaaaa 22 催化切除dna、rna和dntp上的5磷酸基团 切除5磷酸防止自身连接 标记前去除5磷酸 use 5p-dna 5oh-dna+pi 5p-rna 5oh-rna+pi 碱性磷酸酶(去除5p ) 常用的碱性磷酸酶 细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，bap） 小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，cip） 23 use 标记dna链的5端 连接反应中磷酸化 将ntp的-磷酸转移到ds/ss dna/rna的5-oh 来源于t4噬菌体感染的大肠杆菌 t4-多核苷酸(磷酸)激酶（t4-polynucleotide kinase） 24 dnase rnase 核酸酶s1 水解dna 水解rna 降解单链dna和rna 用量增大可降解双链核酸，用于切去双链-cdna 合成中产生的发夹环。 核酸酶 25 重组dna技术中常用的工具酶 工 具 酶功 能 限制性核酸内切酶识别识别 特异序列，切割dna dna连连接酶催化dna中相邻邻的5磷酸基和3羟羟基末端之间间形成磷酸二酯酯 键键，使dna切口封合或使两个dna分子或片段连连接 dna聚合酶合成双链链cdna分子或片段连连接 缺口平移制作高比活探针针 dna序列分析 填补补3末端 klenow片段又名dna聚合酶i大片段，具有完整dna聚合酶i的53聚合 、35外