硕士论文-鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌抑制作用及其机理的研究.doc

分类号 学校代码i c s 学 号 鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌抑制作用及其机理的研究study on bacteriostatic action and antimicrobial mechanism of pyrolin against staphylococcus aureus申 请 人： 学科门类： 工学 学科专业： 食品科学研究方向： 食品微生物的研究与利用指导教师： 论文提交日期：二七年五月摘 要本课题通过采用常规抑菌实验、电导率测定、扫描电镜观察及rt-pcr等实验方法，从菌体生长状态、生长曲线、细胞膜通透性、细胞外观形态、菌内转肽酶femb 基因的rna转录水平等方面，对鹿衔草中主要抗菌活性成分鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌抑制作用及其机理进行研究，结果表明:鹿蹄草素能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，其最小抑菌浓度mic为0.16mg/ml，鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌还具有较强的杀菌作用，最小杀菌浓度为0.2mg/ml；鹿蹄草素作用于金黄色葡萄球菌后，菌体的分裂增殖受到明显的抑制；膜通透性与空白对照组比较显著提高；扫描电镜观察，菌体细胞粘结呈团块状，细胞与细胞间的界限变模糊，细胞壁呈溶解状，菌体细胞结构被明显破坏，提示抑菌性与细胞膜和细胞壁结构变化直接相关；rt-pcr实验表明，该菌的femb基因的mrna水平随药物作用时间的延长而逐渐降低；到作用8h时，femb基因的mrna水平已仅为正常菌的1/4，提示femb 基因转录为mrna过程受到抑制，femb酶的翻译表达量降低，干扰肽聚糖的合成，最终导致菌体细胞的细胞壁的正常合成受到抑制。关键词：鹿蹄草素；金黄色葡萄球菌；抑菌机理study on bacteriostatic action and antimicrobial mechanism of pyrolin against staphylococcus aureusabstractfor studying on bacteriostatic action and antimicrobial mechanism of pyrolin against staphylococcus aureus, by using the common experimental way in microbiology, mensuration of conductivity meter, scanning electron microscope, rt-pcr and so on, staphylococcus aureus were studied in the growth curves, the membrance patency, the structure under scanning electron microscope and mrna level of femb gene and so on, who is normal and effected by different pyrolin who is main actival composition in pyrolaceae. the results show that pyrolin could inhibit the growth of staphylococcus aureus, and the minimum inhibitory concentration was 0.16mg/ml. pyrolin had strong bactericidal action against staphylococcus aureus, and the minimum bactericidal concentration was 0.2mg/ml. the membrance patency of the cells affected by pyrolin sharply increased compared with that of the normal cells. observation under scanning electron microscope revealed that structure of the cells of staphylococcus aureus had been significantly destroyed by pyrolin, and the cells wall were melted. the cells were stick by the melt together, and the bounds among cells got blur. they indicated that the antimicrobial activity and the bactericidal function of pyrolin against staphylococcus aureus were directly relevant to the structure destruction of cells membrance and wall. rt-pcr of femb gene show that the mrna level of staphylococcus aureus femb gene gradually reduced with the extending of the affected time by pyrolin. when staphylococcus aureus were affected by pyrolin for 8 hours, femb gene translation level of staphylococcus aureus already had decreased to the 1/4 than that of normal cells. it revealed that the transcription from femb gene to mrna was inhibited, and the quantities of translation and expression of femb enzyme decreased. in summary, the normal synthetic process of the bacterial cells walls was inhibited.key words：pyrolin；staphylococcus aureus；antimicrobial mechanismdirected by：prof.yin wenzhengapplicant for master degree：yu qinghua (food science)（college of food science and food science and engineering department，inner mongolia agriculture university， huhhot 010018，china）目 录1引言 .11.1鹿衔草的概述11.1.1鹿衔草的分类及生物学性状11.1.2鹿衔草的采制11.1.3鹿衔草的化学成分21.1.4鹿衔草的性味、功效及药理作用31.1.5鹿蹄草的应用31.2鹿蹄草素的概述41.2.1鹿蹄草素的来源及其名称.41.2.2鹿蹄草素的理化性质.41.2.3鹿蹄草素的功能41.2.4鹿蹄草素的毒理学研究51.2.5鹿蹄草素的分离提取和合成.61.2.6应用前景.61.3金黄色葡萄球菌的研究现状与食品安全71.3.1金黄色葡萄球菌的研究现状71.3.2金黄色葡萄球菌的流行病学特征81.3.3金黄色葡萄球菌与食品安全91.4天然食品防腐剂作用机理概述91.4.1天然食品防腐剂的种类91.4.2天然食品防腐剂的抗菌机理91.5立题依据与研究技术路线.111.5.1研究目的及意义.111.5.2技术路线.112材料与方法.122.1实验材料.122.1.1抗菌药物.122.1.2 实验菌株.122.1.3 培养基 122.1.4药品与试剂.122.2主要仪器及器材.132.2.1主要仪器.132.2.2器材142.3实验方法142.3.1菌种的活化培养142.3.2鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(mic)测定 152.3.3 鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌最小杀菌浓度(mbc)的测定152.3.4鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌抑制特性测试 152.3.5 鹿蹄草素作用下金黄色葡萄球菌细胞膜渗透性测152.3.6 金黄色葡萄球菌扫描电镜样品的制备与观察162.3.7鹿蹄草素抑制金黄色葡萄球菌的分子机理研究162.3.7.1试剂的配置162.3.7.2菌种的活化培养172.3.7.3样品的处理及集取172.3.7.4提取金黄色葡萄球菌总rna 172.3.7.5rt-pcr扩增基因183结果与分析.183.1鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic)测定结果 183.2 鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(mbc)的测定结果 193.3细菌生长曲线绘制及鹿蹄草素抑菌特性的测试结果193.4鹿蹄草素作用下金黄色葡萄球菌细胞膜渗透性测定结果213.5鹿蹄草素作用下金黄色葡萄球菌扫描电镜观察结果233.6鹿蹄草素抑制金黄色葡萄球菌的分子机理研究结果233.6.1提取金黄色葡萄球菌总rna233.6.2rt-pcr扩增femb基因.234讨论245结论27致谢29参考文献30附录34作者简介.38缩 略 词mic minimal inhibitory concentrations 最小抑菌浓度mbc minimal bactericidal concentrations 最小杀菌浓度nb nutrient broth medium 牛肉膏蛋白胨培养基pbs phosphate buffered saline， 磷酸缓冲液spa staphylococcal protein a 葡萄球菌a 蛋白depc diethy pyro carbonate 焦碳酸二乙酯femb 原核生物核糖体外的转肽酶bp base pair 碱基对bpb bromothymol blue 溴酚蓝dntp deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸eb ethidiumbromide 溴化乙锭 te tris edta tris edta 缓冲液tris (hydroxymethyl)aminoethane 三羟甲基氨基甲烷 pcr pplymerase chain reaction 聚合酶链反应s.a staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌rna ribonucleic acid 核糖核酸 mrna message ribonucleic acid 信使核糖核酸edta ethylene diamine tetracetic 乙二铵四乙酸sds sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠ctab hexadecyl trimethyl ammonium chloride 十六烷基三乙基溴化铵tnase tap polymerse 耐热核酸酶who world health orange 世界卫生组织g十 gram positive bacteria 革兰氏阳性细菌g gram negative bacteria 革兰氏阴性细菌rt reverse transcription 反转录-聚合酶链反应ld50 median lethal dose 半数致死量内蒙古农业大学硕士学位论文 39 1 前言和文献综述1.1鹿衔草的概述1.1.1鹿衔草的分类及生物学性状鹿衔草，为常用中药，商品主要为鹿蹄草和普通鹿蹄草的干燥全草。中国药典一九九0年版规定鹿衔草“为鹿蹄草科（pyrolaceae）植物鹿蹄草pyrola rotundifolia l. subsp. chinensis h. andres或普通鹿蹄草pyrola decvrata h.andre的干燥全草”。鹿蹄草，p. calliantha h. andres 又名鹿衔草、鹿含草、破血丹；鹿蹄草科普通鹿蹄草pyrola decorata h.andres 又名鹿衔草、紫背鹿衔草、龟背鹿衔草、红鹿衔、小鹿衔、鹿含草；1 2鹿蹄草pr l h.a为多年生常绿草本，高1226cm，全体无毛。根状茎细长，匍匐或斜生，节上具三角形鳞叶1，不定根纤细，由节部长出，略分枝。叶于基部丛生，48；叶柄长2.54cm，叶互生，节间极短，薄革质，圆形至卵圆形，长25cm，宽24cm，先端钝圆，基部圆或近平截，全缘或具不明显的疏锯齿，边缘略向叶背反卷，下面常呈灰蓝绿色，幼时尤显，脉网状，显著。花葶由叶丛中抽出，高1725cm，具三棱，中部有鳞叶12，披针形，长610mm。总状花序具花913朵，每花具小苞片1，披针形，长69mm，与花梗近等长。花期46月。果期69月。鹿蹄草pr l h.a生于山谷林下或阴湿处。多分布于河北、河南、江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、陕西、甘肃、青海、云南、贵州、四川、西藏等地。1 3 4 普通鹿蹄草 pdh.a为多年生常绿草本，高1435cm，全体无毛，根状茎细长横走，斜上，具细根及鳞叶；地上茎短，基生叶片36，革质，较厚。叶互生，具长叶柄，长25cm，具棱，长卵形、椭圆形或长椭圆形，长3.57cm，宽2.34cm，先端钝尖，有小突尖头，叶基广楔形，下延至叶柄，叶缘有稀疏小齿；叶表面深绿色，但叶脉附近常呈淡绿白色，叶背与叶柄均呈紫红色。花葶高1530cm，近中部有12鳞片状叶或无；总状花序具花58朵；蒴果扁圆球形，直径810mm。花期47月。果期79月。普通鹿蹄草 pdh.a为生于山谷溪沟旁或林下荫湿处。本种分布于安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、陕西、贵州、四川、云南、西藏等省区。1 3 41.1.2鹿衔草的采制鹿衔草可全年可采，一般在46月，挖取全株，除去杂质，晒至叶片半干时堆积，使叶片变成紫红色或紫褐色，再晒干。也有直接晒干者，但质硬易碎。主产于浙江、安徽、贵州、陕西等地，以浙江产量大，浙江、安徽产者质量佳。此外，黑龙江、四川、云南及广东海南岛等地亦有生产。1 鹿蹄草 普通鹿蹄草pyrola calliantha h. andres pyrola decorata h.andres图1 鹿蹄草和普通鹿蹄草的图片fig.1 the photo of pyrola calliantha h. andres and pyrola decorata h.andres1.1.3鹿衔草的化学成分 国内外已对鹿蹄草属植物的化学成分作了大量的研究，主要以日本鹿蹄草、红花鹿蹄草、肾叶鹿蹄草为主, 而对中国鹿蹄草属植物特有种研究甚少。对该属植物化学成分研究的报道最早的是1988年王西发对鹿蹄草亚种化学成分进行了初步研究5 。经过王军宪，罗文谦,刘存海等人研究6 7 8 9，迄今认为鹿蹄草属植物含有羟基肾叶鹿蹄草苷、高熊果甙(homoarbutin)、鹿蹄草甙(pirolatin)、2-o-没食子酰基金丝桃苷、鼠李素-3-o-阿拉伯糖-4-o-葡萄糖苷、金丝桃苷、梅笠草素(chimaphilin)、-谷甾醇、胡萝卜苷、蒲公英赛醇(taraxerol)和熊果酸、槲皮素等。鹿蹄草叶中还富含mg,ca,fe,zn, p 5种化学元素, 这些化学元素在人体中起着非常重要的作用。另外还含有16种氨基酸, 其中7种为人体必须氨基酸。 熊果甙r=h.高熊果甙r=ch3.伞形梅笠草素 .鹿蹄草素 水晶兰甙图2 鹿衔草中主要化学成分的结构式fig.2 structural formula of main chemical composition in pyrolaceae鹿衔草叶含熊果甙(arbutin)4.87.93%、高熊果甙(homoarbutin)、异高熊果甙(isohomoarbutin)、伞形梅笠草灵(chimaphillin)、鹿蹄草素（甲基氨醌）、乌索酸、蔗糖、苦杏仁酶、挥发油、苦味质及鞣质等1。据上海医科大学分析普通鹿蹄草尚含水晶兰甙(monotropein)。 1.1.4鹿衔草的性味、功效及药理作用鹿衔草味甘、苦，性温。有补虚、益肾，祛风除湿的功能。用于肺虚咳嗽，劳伤出血，风湿关节痛，崩漏，白带，外伤出血，痈肿疮毒，蛇咬伤。用量915g。外用适量煎水洗、捣烂或研末敷患处。其具有如下药理功能：保健滋补的作用；活血、止血、降低血压的作用；抗菌、抑菌、抗病毒、抗炎作用；在心脑血管系统方面的作用；止咳、平喘、祛痰作用；保肝护肾与利尿作用；止痢、治疗感冒的作用；有抗氧化、消除脂质过氧化自由基和抑制脂质过氧化活性的作用；预防胃溃疡，健胃，助消化等的作用。 10 11 121.1.5鹿衔草的应用鹿衔草应用最早、最主要的方面是在医疗方面，临床用于治疗虚弱痨病、咳嗽、白带、肾虚腰痛、淋浊、吐血、衄血、盗汗、遗精、腰膝无力、外伤出血、虫蛇咬伤、皮炎、疮痈肿毒、鼠漏、慢性风湿性关节炎、半身不遂、筋骨酸软、肠炎、痢疾、感冒等病症。10 11 12在食品工业方面，作为营养保健食品的基质原料，将其研制成营养型保健饮料或其他营养型保健食品。陕西中医学院制药厂在对鹿蹄草化学成分、药理、安全毒理学、临床观察等研究的基础上，依据国内外中老年人的饮用习惯、生理特点采用先进的科学手段，制出了具有中国传统饮品特色，又增强免疫力，强身健体，防病去病，延缓衰老的“鹿寿茶”、“长乐玉液”低度酒等系列高级保健饮品。另外由于鹿蹄草的抗菌抑菌作用，可以作为天然的食品防腐剂，刘存海，艾启俊等已将其应用于酱菜低盐保藏和苹果贮藏中，效果很好。13 14 在化妆品工业中，使用其提取液研制成美容化妆品，用于滋润皮肤，治疗和预防皮肤性疾病。gansloser,helmut geroflen等人就将鹿蹄草浸剂添加me2so4浓缩为糊状，并配以酒精，氨水，调制成美容化妆品，用于治疗粉刺，有明显的作用。开发利用鹿衔草这一天然资源，对于发展我国的食品工业、园林绿化、医疗保健事业将有良好的促进作用，同时体现出其应有的社会效益和经济效益。总之，鹿衔草的开发利用有广阔的前景。1.2鹿蹄草素的概述1.2.1鹿蹄草素的来源及其名称鹿蹄草素（pyrolin）化学名2-甲基-1，4-苯二酚（2-methy-1,4-benzenediol），又名邻甲基对苯二酚、甲基氢醌，别名为六茜素，鹿蹄草素，是从鹿蹄草和六茜草中分离出来的有效成分，是一种天然的防腐组分。鹿蹄草素是鹿蹄草科植物的抗菌有效成分之一，对呼吸道、尿道及消化道感染等有较好疗效，对真菌亦有杀灭作用15 16 。鹿蹄草素的化学式为c7h8o2，分子量为124.1317。1.2.2鹿蹄草素的理化性质 鹿蹄草素为白色晶体物质。它能溶于乙醇、乙醚、苯等有机溶剂；微溶于水，溶解度为8g/100g。但鹿蹄草素在水中极不稳定，能逐渐被氧化生成苯醌类物质，而颜色也从最初的无色变成淡红色，最后变成深红色。若溶于10的氯化钠水溶液中最终会呈现茶红色。鹿蹄草素含有酚羟基，故含有弱酸性，它能与naoh溶液作用，生成酚钠，但鹿蹄草素不溶于na2co3或nahco3溶液，原因是鹿蹄草素的酸性比碳酸弱。鹿蹄草素因能形成较多的氢键，相互缔合成较大的分子，所以它具有较高的熔点和沸点。鹿蹄草素的初熔点和熔点分别为125和170，沸点为286。鹿蹄草素含有两个酚羟基，故有酚类的特性。它能够与fecl3水溶液反应，生长蓝紫色的络离子。此外，它还能与cu、al、pb反应生成络合物。181.2.3鹿蹄草素的功能鹿蹄草素同其它氢醌类物质一样，亦具有杀菌、消炎等功能。在医学上，鹿蹄草素已应用于临床的治疗肺部、尿道和肠道感染，均有较好的疗效。此外，有文献报道鹿蹄草素能治疗人体的高血压、冠心病等，而且未出现不良反应20。1.2.3.1抑菌体外试验证明15 21，鹿蹄草素抗菌作用强，抗菌谱广，毒性较低，对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、宋内氏痢疾杆菌及大肠杆菌等均有抑制作用。最低抑菌浓度（g/ml）：金黄色葡萄球菌 125.0，肠球菌 125.0，伤寒杆菌 1000。鹿蹄草素对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑制作用与丁胺卡那霉素相当19。长期临床试验表明17 21 22，本品对呼吸道、尿道、消化道感染及创口感染等有较好疗效；鹿蹄草素对真菌亦有杀灭作用；鹿蹄草素还有杀虫作用，为强杀虫剂，对人和家畜无毒性，对米象鼻虫、蝗虫、家蝇和蟑螂都有效。1.2.3.2清除羟自由基据报道，中国农科院兽医研究所的薛明等采用电子自旋共振和自旋捕集技术，观察药用鼠尾草丹参二萜醌类化合物及其它中草药中有关单体化合物对fenten反应产生的羟自由基的清除效能。在随机选取的中草药己知单体化合物，有生物碱、醌类、萜类及酚类化合物23。1.2.3.3抑制脲酶（饲料）国内有些学者对鹿蹄草素等氢醌类物质作为瘤胃内脲酶抑制剂进行了系统的研究。研究结果表明24 25 26 27 28：在体外实验中证明，鹿蹄草素等是瘤胃脲酶非常有效的抑制剂，在很低的浓度范围内（1-10 mgkg-1）就可以显著地抑制瘤胃脲酶的活性，减缓尿素的分解速度；鹿蹄草素等可以提高纤维素酶的活性，促进纤维素的分解为体内需要的营养成分；20-80 mgkg-1 dm的鹿蹄草素等可使绵羊瘤胃内氨的浓度在产氨高峰时降低41.1-44.0，能显著地延缓尿素的分解速度，降低瘤胃内的氨浓度，为瘤胃内的微生物能够有效地利用尿素氮合成菌体蛋白提供厂条件；绵羊日粮中添加30和60 mgkg-1 dm的鹿蹄草素等物质可以显著提高日粮中干物质、ndf和adf的有效降解率（p 0.05），而且对日粮营养物质的消化率、氮代谢没有显著影响，也不影响日粮的外流速度。1.2.3.4治疗椎动脉型颈椎病 采用鹿蹄草注射液2ml（含1克，内有鹿蹄草素），每日肌肉注射4ml，分12次，1疗程10日。治疗椎动脉型颈椎病65例，在4个疗程内，显效55例，占84.6，好转8例，占12.3，无效2例，占3，总有效率96.9。291.2.3.5其它鹿蹄草素除了以上的功能以外，还具有抗风湿、止血、平喘止咳、治疗肾虚和冠心病等功能。1.2.4鹿蹄草素的毒理学研究试验动物资料表明6 7 30 31 32，鹿蹄草素等氢醌类物质经不同的途径吸收进入血循环后，广泛分布于全身各脏器和组织，其中以肝和肾组织浓度最高。氢醌类物质对骨髓和淋巴器官的毒性作用与其在这些组织中的蓄积有关。宋思等试验发现33，给小鼠静脉注射鹿蹄草素后，小鼠的吸收非常迅速，5分钟血清中含量就达到最高值，半衰期约15分钟。组织中的分布与血清中非常相似，其中肝、肾含量最高，肺次之，心、脾、脑较低。药物消除也很迅速，主要由肾排出，给药后3小时尿中的排出量约为总注入量的74。吴向东等的急性毒性试验表明32，氢醌类物质对大鼠的经口ld50为200-550mg/kg，鹿蹄草素的ld50为230.73mg/kg。此外，上海中医学院附属曙光医院中草药试验小组21每日对犬静注5或15mg/kg，连续14日，结果发现，除大剂量组可见轻度呕吐外，其余一切正常。1.2.5鹿蹄草素的分离提取和合成1.2.5.1鹿蹄草素的分离提取现已有成熟的鹿蹄草素的分离提取和合成方法。王西发、罗文谦和王军宪等5 7 9分别对从天然植物中分离提取鹿蹄草素进行了研究。王军宪等9采用了有机溶剂萃取法分离提取鹿蹄草素。1.2.5.2鹿蹄草素的人工合成早在20世纪70年代，上海中医学院附属曙光医院和上海化工学院制药系就已经人工合成了鹿蹄草素，其工艺采取2-甲基苯胺为原料，通过so2还原和乙醚提取、回收等步骤制成34。但由于so2对人体有毒害作用，并可造成环境污染；乙醚为一级易燃易爆品。显然，此法不适宜鹿蹄草素的工业化生产。在前人工作的基础上，解放军农牧大学和北方制药厂经多次实验35，设计一条简便实用的鹿蹄草素合成路线，即以2-甲基苯胺为原料，以mno2氧化，分离出氧化产物2-甲基苯醌，再用乙醇为溶剂，经铁酸还原法制得，总收率达40.6。1994年，黑龙江大学化学系的孙志忠等36又对此法进行了改进，采用重铬酸钠和浓硫酸来氧化2-甲基苯胺，再采取fe/hcl还原方法，使还原反应收率达到了96.1，二步总收率提高到了48.1 %。此工艺具有反应时间短、工艺简单、收率高的特点。目前在工业上，鹿蹄草素的生产基本上都是采取此种方法。1.2.6.应用前景1.2.6.1防腐剂由于鹿蹄草素具有广谱抗菌性，因此可以作为防腐剂应用在果蔬和肉制品中。艾启俊等将鹿蹄草的浸提液（内主要含鹿蹄草素）用于低盐酱菜的保藏，可使低盐酱菜在室温下的保质期延长2d左右，而且抑菌效果明显好于同浓度的山梨酸钾和丙酸钙13。此外，艾启俊等14又将上述溶液用于苹果贮藏保鲜中，发现其对根霉、黑曲霉和青霉有明显的抑制作用，而且其0.02的酒精浸提物的抑菌效果优于0.50苯甲酸钠、山梨酸钾。 1.2.6.2保健食品鹿蹄草素具有很多营养保健功能。一些学者在食品中添加鹿蹄草素的研究比较深入，开发研制了富含鹿蹄草素的保健食品等。此外，它还可以作为营养型食品添加剂，应用到饮料、饼干等食品中。1.2.6.3医药由于鹿蹄草素具有许多对人体有益的生理活性功能，所以鹿蹄草素应用于医药领域前景广阔。目前，鹿蹄草素制成的胶囊、霜剂、口服液等用来消炎抑菌、治疗肺部、肠道、尿道的感染、抗癌抗病毒等方面，均取得满意的临床效果，均带来良好的社会效益和经济利益。此外，鹿蹄草素在化妆品中的应用也有相当大的市场潜力，它能够抗氧化，清除羟自由基，促进细胞的分裂增殖，延缓细胞老化，甚至能够治疗皮肤性疾病。因此，大力开发鹿蹄草素在医药品、化妆品方面的应用，将有着很大的市场前景。1.2.6.4其它鹿蹄草素在土壤肥料学研究与应用中屡见报道，其是长效尿素产品的一种成分，用来抑制土壤中微生物产生的脲酶，减少尿素以氨的形式损失27 28。此外，还有报道说在动物饲养中用其来处理动物舍内的粪尿，而直接饲喂给反刍动物作为脲酶抑制剂等2526。1.3金黄色葡萄球菌的研究现状与食品安全1.3.1金黄色葡萄球菌的研究现状1.3.1.1金黄色葡萄球菌的生物学性状金黄色葡萄球菌直径约0.81.0m，呈葡萄串排列。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，不能运动，一般不形成荚膜，需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，最适生长温度37，最适生长ph 7.4；可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气；甲基红反应阳性，vp反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。371.3.1.2金黄色葡萄球菌的抵抗力金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，在不形成芽孢的细菌中金黄色葡萄球菌抵抗力最强，于干燥的脓汁或痰液中可存活23个月；加热601h或8030min才能将其杀死。在2%石炭酸中15min或在0.1%升汞中1015min死亡。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，在含有1015%nacl肉汤中仍能繁殖。对某些染料较敏感，如1:1020万倍稀释的龙胆紫溶液能抑制其生长。对青霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素高度敏感，对链霉素中度敏感，但对黄胺、氯霉素敏感性差38。近年来由于抗生素的选择使用，耐药菌株逐渐增多。但金黄色葡萄球菌对万古霉素仍敏感。金黄色葡萄球菌具有多种抗原构造，如细胞壁表面的葡萄球菌a 蛋白（staphylococcal protein a ,spa）、与肽聚糖相连的磷壁酸、细胞壁上的结合凝固酶及少数菌株的荚膜都具有抗原性38。1.3.1.3 金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus，可以产生多种致病因子，包括溶血毒素（staphylolysin）、杀白细胞素（panton-valentine p-v,leukocidin）、血浆凝固酶（coagulase）、脱氧核糖核酸酶（heat-stable nuclease）、肠毒素（enterotoxin）及溶表皮素（epidermolytic toxin）、蛋白酶、脂肪酶（lipases）、过氧化氢酶（catalase）、透明质酸酶（hyaluronidase）、纤溶酶（fibrinolysin）、及青霉素酶(penicillinase) 等。它们通过溶血作用、破坏细胞膜磷脂，损伤血小板，破坏溶酶体，破坏人的白细胞，裂解表皮的棘状颗粒和破坏巨噬细胞，沉积或凝固血液或血浆中的纤维蛋白，阻碍吞噬细胞的吞噬或防止吞噬后被消化等方式，引起肌体局部缺血和坏死或急性胃肠炎等多种机体病变，主要有: 引起皮肤、各种器官的化脓性感染，全身感染，甚至形成脓毒血症；食物中毒、烫伤样皮肤综合症（staphylococcal scalded skin syndrome ssss）、毒素性休克综合症（toxic shock syndrome tss）等毒素性疾病。引起金黄色葡萄球菌食物中毒的致病物质主要是肠毒素（enterotoxin）。肠毒素根据抗原性分为a、b、c1、c2、c3、d、e和f等8个血清型。肠毒素是蛋白质，溶于水，相对分子质量约为30000，耐热，食品中的毒素不因加工而灭活；对蛋白酶也有耐性，故在消化道中不被破坏。含有蛋白、淀粉和奶油类食物被产生肠毒素的金黄色葡萄球菌污染后，在20以上经8-10h即可产生大量肠毒素。食入含该肠毒素的食品后，经16h潜伏期，出现恶心、呕吐、腹泻的急性肠胃炎症状。严重者可虚脱或休克。一般1-2d恢复。此毒素还可引起猴、猫呕吐，可能是毒素作用于肠道神经受体后，刺激呕吐中枢所致。a型肠毒素是最常见的与疾病有关的毒素，b型次之，c型较少，d主要存在于污染的乳制品中。b能引起金黄色葡萄球菌伪膜性肠炎。381.3.2 金黄色葡萄球菌的流行病学特征金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：1、季节分布，多见于夏秋季；2、中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。3、人畜化脓性感染部位常成为污染源，上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83.3%。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。肠毒素形成条件：1、存放温度，在37内，温度越高，产毒时间越短；2、存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；3、食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。3940 41421.3.3金黄色葡萄球菌与食品安全食品安全是一个重大的世界性问题。其中，食物中毒是影响食品安全性的一个重要因素。据国内外统计，在各种食物中毒中，细菌性食物中毒最多。研究表明，金黄色葡萄球菌污染食品后可引起毒素型食物中毒。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌；由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒居第一位，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则高达45%，由此造成的经济损失也相当惨重。我国每年发生的此类中毒事件也非常多。我国是一个食品生产和消费大国，随着市场经济的快速发展和生活水平的提高，特别是加入wto后，消费者对食品安全更加关注，食品安全与食品贸易的关系更为密切，提高我国食品安全水平的要求越来越迫切，为确保食品安全与食品贸易，需要加大食品防腐剂研究的力度，筛选出适应食品工业发展的优质防腐剂，以保证食品产品的质量。1.4天然食品防腐剂作用机理概述1.4.1天然食品防腐剂的种类目前对天然食品防腐剂的研究己经相当广泛。己经发现相当多作用效果不同的防腐剂制品，如来自植物种子、果实、茎叶、树皮、花蕾等的提取物（如银杏叶提取物、肉桂提取物、丁香提取物、迷迭香提取物和红曲提取物等）和香辛料制品（如甘椒提取物.辣椒提取物等）、来自微生物的抗菌物质（如乳酸菌细胞及其代谢物、乳酸链球菌素、酵母的代谢产物等）、来自动物的蛋白、肽类（如柞蚕抗菌肽等）、来自水产品中的肽类物质（如鱼精蛋白和壳聚糖及其衍生物等）等和溶菌酶（又称胞壁质酶或n-乙酞胞壁质聚糖水解酶）等。此外，还有聚赖氨酸、果胶分解物、蜂胶多酚类化合物、琼脂低聚糖、茶多酚、香精油等。4445 431.4.2 天然食品防腐剂的抗菌机理抗菌物质的抑菌机理可根据其干扰代谢过程的不同，分为以下5大类型46 47： (1)抑制细胞壁合成；(2)影响细胞膜功能；(3)抑制细胞蛋白质合成；(4)作用于能量代谢系统；(5)干扰核酸合成。食品防腐败剂的作用机理也主要表现在以上五方面，根据作用方式的不同，可以把天然食品防腐剂分为以下几类。 1.4.2.1 源于植物的小分子有机化合物除弱的有机酸和部分鳌合剂外，一些天然的具有抗菌活性的化合物在许多国家己用作食品防腐剂。其中有些天然存在于调味品中，如牛至、麝香草、莳萝, 丁香及其提炼油中。而许多的中草药都具有不同程度的抗菌活性。这些化合物大多数是疏水的，而且对膜组织具有干扰作用甚至使其溶破 48 ，但要使细胞溶破死亡，需要添加高浓度的上述物质以至于其味道很大，故在实际中只是适量添加，使其抑制微生物的生长。罗勒、孜然芹、香菜、胡妥等植物提取油能抵抗气单胞菌、荧光假单胞菌和金黄色葡萄球菌等微生物 49。其作用机制不同，如异硫氰酸盐通过形成活性硫氰酸盐自由基，氧化断裂胞外酶的二硫键使其失活，从而发挥抗菌活性50。香芹酚和麝香草酚降低大肠杆菌胞内atp的含量并同时提高胞外atp的含量，暗示该类化合物对细菌质膜具有破坏作用。在一个研究苯甲酸、桂皮酸和苯甲醛作用的量化结构活性关系的实验中发现。反相hplc测试得到的其亲脂参数在说明这些化合物的抗乳酸菌模式外面很有意义51。1.4.2.2 膜干扰蛋白和肽