黑莓叶水溶性多糖部分性质研究.doc

毕业设计（论文）开题报告题 目: 黑莓叶水溶性多糖部分性质研究 学 院： 海洋学院 专业班级： 食品科学与工程 食品082 学生姓名： 缪丽丽 学 号： 040811219 指导教师： 周鸣谦（副教授） 2012 年 6月 6 日淮海工学院毕业设计（论文）开题报告1.课题研究的意义，国内外研究现状、水平和发展趋势1.1课题研究的意义国际化妆品技术者联盟 （IFSCCInternational Federation of Societies of Cosmetic Chemists） 发布一项最新研究表示，黑莓叶提取物可能成为抗皮肤衰老领域一种全新的原料。据称由于该原料中含有胶原质和弹性蛋白等成分，有助于防止皮肤皱纹的出现，从而具有较大的抗衰老功效通过研究，科学家发现，黑莓叶萃取物可起到抑制金属蛋白酶（MMP），特别是MMP1酶的作用。具体研究的许多数据都证明了这一新原料成分的抗衰老功效。另外，该研究小组人员还研究了其抗氧化性能，发现它基本能达到与绿茶相似的抗氧化功效。他们还表示，黑莓叶萃取物是由许多功能型原料组成的，如多酚物质和黄酮类化合物等，因此这种新型原料成分将受到产品生产商的欢迎是不无原因的。1.2国内外研究现状、水平和发展趋势近年来己风靡日本、欧州、美国及中东等国家市场，我国沿海发达地区也开始使用，据预测，随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，以及工业发展、环境污染严重，黑莓叶必将会成为保健治疗又一常规主导消费品，市场消费量大，前景看好。日本对黑莓叶也进行深入研究，证明黑莓叶含有天然止咳痰物质，富含抑制环氧酶、透明质酸酶活性物质及抑制过敏物质组胺游离的物质，能抑制血管透过性亢进，达到缓和鼻、眼、脸过敏，其功效明显优于木瓜、桔梗等植物；对花粉症等鼻炎过敏反应有明显疗效，日本是花粉过敏症流行的国家，特别是每到樱花盛开的季节，那些因花粉过敏而致鼻炎、咳喘的人，纷纷喝黑莓叶以祛痰保安康，近年来黑莓叶己被日本推祟为第二代保健饮料而钟爱有加，黑莓叶作为防治花粉过敏的原料，其保健食品在日本也颇为畅销。另外，研究人员发现采用黑莓叶提取物的制成的化妆品可改善皮肤的瘙痒，并抑制皮肤及血管壁内透明质酸的下降，间接地湿润皮肤，达到美容效果。资生堂制成欧珀莱-“柔和洁面膏”,主要成份是黑莓叶提取液，可抑制透明质酸的分解，防止皮肤保湿功能的下降，使肌肤保持嫩滑富有弹性。香港天鑫集团公司开发成功“黑莓叶靓白面膜”，主要成分是黑莓叶中富含具有抑制黑色素的天然还原物质，能分解沉积在生长层的黑色素，有效阻碍酪氨酸酶的活性，防止色斑形成，淡化色素，阻止皮肤衰老，使皮肤更自然更美白更有弹性。这一研究的结果将于今年年底公开，届时有望为社会各行业带来更多更有效的关于这一新原料的利好消息。他还表示，这一提取物适用于一系列的抗衰老产品配方中，包括脸部和身体用的各种霜、露和乳状物质等。目前市场上尚未出现含有该成分的产品，但已经进入了消费者产品实验阶段。也有专家表示对这一研究结果非常满意，相信在不久的将来，黑莓叶萃取成分将不仅出现在传统的医药领域，业绩成分很多抗衰老型化妆品及护理品中广受欢迎的成分。淮海工学院毕业设计（论文）开题报告2.课题的基本内容，可能遇到的困难，提出解决问题的方法和措施2.1课题的基本内容2.1.1 黑莓叶水溶液多糖的提取工艺流程：前处理浸提取上清夜重复提取三次，合并上清液减压浓缩乙醇沉淀离心分离提取物初步鉴定粗多糖2.1.2 黑莓叶水溶性多糖的纯化工艺流程：多糖粗品去蛋白、脱色透析上DEAE纤维素柱层析进行梯度洗脱蒽酮硫酸法进行跟踪检测合并主峰真空浓缩、透析上Sephadex-100凝胶柱层析洗脱蒽酮硫酸法进行跟踪检测分子量测定(1)提取液中蛋白质的去除。(2)小分子化合物的去除。2.1.3 黑莓叶水溶性多糖糖基组成的分析(1)不同展层系统对分离效率的影响(2)不同体积比对分离效率的影响(3)不同展层时间对分离效率的影响2.1.4 溶解度实验2.2可能遇到的困难在做实验的过程中，我们会遇到一些实验仪器不会用，测量方法不正确等问题，我们是一群未经过专业培训的学生，实验测量的数据肯定会偏离实际，停留在理论上。2.3提出解决的方法和措施当遇到设计技术难题时，老师必定是解决问题的首选，我们要多与我们的导师交流沟通，把我们在实验过程中遇到的问题向老师反馈，并麻烦导师时时检查我们的实验结果和进程，做到有错误立马纠正，不要等到事后返工。实验过程中我们还要与身边的同学多交流，我们时刻相信集体的智慧是无穷的。3.课题拟采用的研究手段（途径）和可行性分析3.1研究手段做实验的前提必须要掌握许多实验原理，在大学前三年，我们有生物化学、食品分析等专业课的铺垫，在实验过程中我们得学以致用。在做实验之前我们得阅读大量关于植物提取多糖方面的论文，从中总结一些分离、纯化方法。再结合实验确定具体的方法，查阅大量书籍，争取做到把每个知识点都能掌握。3.2可行性分析随着人们生活水平不断提高，人们有条件去追求高品质的物质生活，这就给保健品市场创造了极大的利润空间，也保证了保健品企业的生存空间。而且在大学课程中已学习了生物化学、食品化学、食品分析等专业课程，加上对提取多糖步骤也有一定的了解，并且本设计的指导老师在多糖方面进行了深度研究并取得一定成果，所以本设计是可行的。淮海工学院毕业设计（论文）开题报告指导教师意见（对课题的深度、广度及工作量的意见和对设计结果的预测）指导教师（签名） 年 月 日系审查意见：系主任(签名)： 年 月 日毕业设计(论文)外文资料翻译学 院： 海洋学院 专业班级： 食品科学与工程 食品082 学生姓名： 缪丽丽 学 号： 040811219 指导教师： 周鸣谦(副教授) 外文出处：Carbohydrate Polymers 83(2011)：19471951 附 件：1.外文资料翻译译文； 2.外文原文 指导教师评语：签名： 年 月 日干枸杞水溶性多糖的分离、结构特点和抗氧化活性摘要本实验的目的是研究纯化枸杞多糖（PLBP）的保护效应。枸杞多糖能抵抗组织氧化损伤，它是从枸杞干果中通过沸水提取而来。粗多糖通过离子交换柱分成七个小成分和一个主要成分。其主要成分即为枸杞多糖。将枸杞多糖进行了分析，结果表明平均相对分子质量是1.21105.糖类主要的吸光率主要出现在3400.38、2930.49、1629.66、1411.40、1151.44、1078.24、1032.50、920.72、864.33、817.08、777.04cm-1 PLBP中的清除自由基检测出来。此外，给动物服用PLBP30天后会发现丙二醇和抗氧化酶活性水平明显下降。结果清除地表明PLBP能抗氧化和保护皮肤不受氧化损伤。1.简介皮肤是一种保护层，使有机体免受外界环境的感染。生物体内抗氧化剂保护组织不被氧化。然而组织内部抗氧化剂的水平随着寿命慢慢下降。因而导致对组织氧化的保护减少。随着时代的发展，氧化应激开始抑制组织的反应能力，导致微妙变化的累积，从而加快老化的过程和慢性炎症的产生。罗斯参加过许多皮肤紊乱的研究例如：皮肤癌、着色性干皮病、皮肤老化。近些年来，人们更多的关注于天然抗氧化剂，特别是植物多糖，对于由于年龄引起的氧化损伤具有很好的保护作用。枸杞是常年生的具有地方性种植的植物。在韩国、日本、中国广泛应用于医药中，作为功能性食品已经有25年的历史。现代研究表明，从枸杞中分离的多糖具有生物活性，包括抗氧化活性。然而许多报告表明随着年龄的增长，人的皮肤不断受到氧化损伤，为了阐述这些变化如何产生，我们研究年龄相关的变化和PLBP的抗氧化活性。2.材料和方法2.1材料枸杞干果，一般生长在中国宁夏，原料风干在室温下，其他分析纯是商业上可用。2.2多糖的提取 把枸杞干果（200g）放在装有石油醚（沸点60-90）索氏抽提器中进行脱脂，已经处理过的用80%乙醇回流两次去除有色物质、单糖、多聚糖、小分子物质。用蒸馏水浸泡2小时，用水提取4小时，浓缩后提取物进行冻干，粗多糖在-20保藏，残渣风干。2.3多糖的纯化多糖的纯化采用DEAE-纤维素柱层析，50毫克粗多糖溶解在10毫升水中，加入到已经用蒸馏水平衡的DEAE-纤维素柱中（3厘米45厘米），用NaCl（0-3M）洗脱，直到糖不能检出。利用硫酸-蒽酮法测出每种成分中的糖的含量，把洗脱后收集的糖合并起来在水中透析（截留量14000）24小时并且低压冻干，其中一共检测出七种小成分和一个主要成分，主要成分是纯化的枸杞多糖。2.4分子量的测定PLBP的分子量采用凝胶液相色谱法.凝胶填料柱（30cm0.32cm）保持在35,泵（沃特世590号）。流动相是0.7%Na2SO4缓冲溶液，流速是0.5ml/min.在分析前样本采用0.45m的过滤膜进行过滤，再把过滤好的样品注入到注射器中，注射器的容量是25毫升，在35下通过示差折光检测器进行检测，用标准右旋糖苷键将柱进行校正，通过软件进行分子量推算。2.5红外光谱 光谱通过重法探测器收集在750福利叶变换红外光谱仪中，样品溶于溴化钾中（每200mg溴化钾中有2mg个样品），溴化钾圆盘作为底色。2.6 DPPH自由基清除活性 提取物的自由基活性，以稳定的1,1-二苯基苯肼（DPPH）作为抗氧化剂评价标准。将提取物（0.1ml）添加到3ml0.004%甲醇DPPH溶液中。30min后在517nm处进行吸收测定，抑制活性的百分比通过(A0-A1) 100/A0估算而来，其中A0是吸光度，A1是吸收精华液、标准2.7动物实验 将来自中国沈阳小动物繁殖中心的雄性的鼠36020g(超过24月)或14523g(2个月)放在一个能被控制的环境下一个星期，此环境可以自由使用食物和水。根据中国医科大学机构动物伦理委员会的规则和法规处理动物。 动物体重约14523g(2个月)作为正常年轻控制组（1组）。动物体重大约36020g(超过24个月)作为老龄动物组（2组），第二组被分为三个小组，每组有六种动物，三个组分别为：未处理的、服用低剂量的多糖组（200和400mg/kg）、服用高剂量的多糖组（3组和4组）。在老龄动物组中的两组中服用多糖，每日一次，连续30天。同样，动物在年轻组合老龄组两组对照组中加入蒸馏水进行控制。在最后加入剂量的24小时后，动物死亡。从腹主动脉中取血干管，在1000g、4下离心机分离15分钟。分离血清，确定血清抗氧化剂酶活性。 组织MDA含量测定以TBA反应为基础，TBA是2-硫代巴比妥酸。丙二醛在高温及酸性环境下可与（TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。根据其532nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。超氧化物歧化酶（SOD）活性测定以试剂盒测定。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质，它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害。过氧化氢酶（CAT）将双氧水分解成氧气和水，上清液的过氧化氢酶活性测定通过分光光度计在240nm处计算酶底物的降解率。GSH-PX活性用谷胱甘肽（GSH-PX）的检测试剂盒AOO5测定。在过氧化氢存在下，催化谷胱甘肽转变为氧化型的一种金属酶，为生物体中清除过氧化氢和其他有机过氧化物的脱毒酶。2.8统计分析 结果以平均值和标准差进行分析，使用方差分析将不同组进行比较，认为差异在p0.05时具有统计学意义。3.结论3.1PLBP的化学分析PLBP分子大的平均重量为1.21105cm.用FI-IR光谱进行PLBP的特征吸收峰测定（图1）.吸光度出现在3400.38、2930.49、1629.66、1411.40、1151.44、1078.24、1032.50、920.72、864.33、817.08、777.04cm-1。3400.38、2930.49 cm-1的信号可能对应C-H、C=C键的弯曲振动。1629.66 cm-1可能对应CH3-、CH2-。920cm-1的大幅波段是-糖苷键的特征显示，表明-糖苷链接多糖。3.2DPPH自由基常用于抗氧化成分的体外抗氧化评价。DPPH自由基是一种稳定的自由基，在517nm处有一强吸收，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有基自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。从图2，我们观察到DPPH自由基清除活性，剂量反应关系。PLBP浓度增加，反应也增加。人类大多疾病包括心血管疾病和癌症，由于自由基的存在，随着水平的增高其副作用也不断积累。已经发现半胱氨酸，谷胱甘肽，抗坏血酸，维生素E，黄酮类，鞣质，芳香胺（P -苯二胺，对氨基苯酚等），通过提供氢自由基来使DPPH减少和褪色。我们认为PLBP的酚类化合物可能是其抗氧化自由基。3.3在体内的抗氧化活性 PLBP对于动物中MDA和GSH上的影响见图3.当与健康的动物相比较时，丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）的水平明显地增加，未经处理年老的动物减少。经过PLBP的30天连续治疗，有明显地下降，在PLBP治疗的动物中，MDA水平也下降。 当未经处理的年老的动物与正常的的动物相比较时发现其SOD，CAT和GSH - Px活性显着降低，PLBP的服用对于由于年老而产生的氧化损伤提供了一个显著的抑制.PLBP的高剂量使用对于抗氧化剂酶活力具有显著的作用如图4.4.讨论DPPH-是一种自由基，并已被广泛用于测试各种样品的自由基清除能力。它是一种稳定的自由基，在517 nm处具有特征性吸收，被用来研究提取物的自由基清除作用。其醇溶液呈紫色的特性。当有基自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。为了评估PLBP的 DPPH自由基的清除能力。结果表明，PLBP能明显地清除DPPH自由基。自由基是含有一个不成对电子的原子团。由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对出现，因此自由基就到处夺取其它物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。这些自由基可以累积，造成氧化损伤。这种氧化损伤，导致生物体老年化。换句话说，自由基改变我们的皮肤的油脂腐臭其反过来损害皮肤胶原蛋白。胶原蛋白是蛋白质纤维，是我们的皮肤控制中心。事实上，自由基被认为与皮肤癌和皮肤过早老化有关系（这将加快这种自由基损伤）。科学家们现在侧重于了解自由基对身体产生什么影响，。对于那些自由基如何影响皮肤感兴趣，自由基对皮肤肯定有害。自由基使皮肤的支撑结构的恶化，减少皮肤弹性，韧性，柔软性。他们往往是皱纹的元凶，使皮肤失去弹性和柔软性。人体的皮肤，这是直接暴露在环境事件下，可能引起活性氧簇ROS形成，配有酶和非酶的防御机制来调节ROS水平。已经有许多报告表明在衰老过程中的氧化损伤增加。在这项研究中，我们观察到，在动物的老化过程中MDA的含量线性增加。抗氧化剂有助于去除这些细胞的自由基的伤害。也就是说，他们放慢，甚至有可能阻止由于皮肤衰老而成的氧化损伤。我们的研究结果表明，PLBP治疗减少皮肤MDA水平。虽然没有关于在动物皮肤中的抗氧化酶活性与年龄有关的变化的数据报道，有许多关于其他器官的变化的报告。例如，它已被观察到的超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）在雄性动物中随着年龄的老化在脑、肝脏、肾脏中的减少。至于年龄对抗氧化酶活性在皮肤的作用，已发现谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）活性，在小鼠实验中随着年龄减少。在这项研究中，超氧化物歧化酶（SOD）的活动，过氧化氢酶和GSH - Px的皮肤老化过程中具有太大的变化。由于抗氧化酶活性的显着下跌，老年动物保护修复系统逐渐薄弱。中国草药在许多世纪以来已经使用在临床应用中。鉴于消费者的兴趣和对天然产品的需求上升的带动下，中草药在保健化妆品上的应用已经受到极大的关注和人们的兴趣。目前，各种中草药用于组织护理化妆品，并声称，他们能够改善外貌岁组织。枸杞（枸杞多糖）从多糖中孤立出来具有不同的效果，包括抗氧化活性。 L.枸杞果实中的活性成分，主要是多糖蛋白复合物（LBP），其中包含几个成分由离子交换色谱和体积排阻色谱分离出来。枸杞多糖已另据报道，增加自由基的破坏。其他研究结果表明，枸杞多糖保护小鼠生精上皮的结构。睾丸在体外变性的研究表明，虽然氧自由基大大破坏了小鼠的生精上皮的形状，枸杞多糖防止这种损害。因此，LBP的作用机制之一可能是对氧自由基损伤细胞膜的直接保护。本研究结果表明，首先，动物的PLBP的治疗防止年龄诱导的氧化损伤。此外，PLBP治疗显著降低了皮肤抗氧化酶活性。总之，老化产生活性氧，包括H2O2和O2 - ，在老年动物的皮肤中，通过增加脂质过氧化水平和使抗氧化酶活性下降。由于自由基与许多疾病与年龄有关条件的相连，枸杞的抗氧化活性可能具有广泛的有利影响。 PLBP使机体不易衰老是通过增加内源性因素，减少MDA含量和保护皮肤氧自由基介导的损伤。本 科 毕 业 设 计 (论 文)黑莓叶水溶性多糖部分性质研究Study on Several Characters of water-soluble Polysaccharides from Blackberry Leaves学 院： 海洋学院 专业班级： 食品科学与工程 食品082 学生姓名： 缪丽丽 学 号： 040811219 指导教师： 周鸣谦（副教授） 2012 年 6 月毕业设计（论文）中文摘要黑莓叶水溶性多糖部分性质的研究摘 要：本实验用热水提取，乙醇沉淀，Sevag 法去蛋白，乙醇分级分离，DEAE cellulose-52柱层析纯化植物多糖，SephadaxG-100凝胶柱层析测得其分子量，用薄层层析分析其单糖组分，并对其溶解度进行分析。实验结果表明：经DEAE cellulose-52柱层析纯化多糖表明存在两种多糖组分，分别为中性多糖和酸性多糖。用SephadaxG-100凝胶柱层析测得分子量分约为27401、51099。黑莓叶多糖的糖基有木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖或半乳糖，至于其他组分有待分析。植物多糖在水中全部溶解，在乙醇、乙醚、丙酮中全部不溶解。关键词：黑莓叶；多糖 ；分子量；单糖毕业设计（论文）外文摘要Study on Several Character of Water-Soluble Polysaccharides in Blackberry LeavesAbstract: water-soluble polysaccharides from blackberry leaves were isolated by boiling and precipitated by ethanol. Sevag reagent was added to remove protein. Then polysaccharides were purified by DEAE cellulose-52 and SephadaxG-100 gel filtration .Thin-layer chromatography was performed to identificate monosaccharide of Polysaccharides form blackberry leaves . The solubility of polysaccharides was analysed . The experimental results show that ：Two purified polysaccharides,(acid polysaccharide and neutral polysaccharide)were gained by DEAE-52 anion-exchange chromatography. After SephadaxG-100 chromatography, the average molecular weight of polysaccharides was 27401、51099. Our experiments also demonstrated that rhamnose、xylose 、arabinose、glucose、galactose were components of polysaccharides of blackberry by thin-layer chromatography assay .The identification of other monosaccharide further study is needed. The solubility of the polysaccharide was dissolved in the water , but all were insoluble in alcohol, ether and acetone.Keywords: blackberry ; polysaccharide; molecular; monosaccharide目 录绪论1.1黑莓的简介11.2黑莓叶的主要营养成分特点11.3多糖生理意义31.4课题研究的内容和意义32材料和试剂 32.1实验材料42.2实验试剂42.3实验仪器53.实验方法 53.1黑莓叶多糖提取53.2黑莓叶可溶性多糖含量测定53.3黑莓叶多糖纯化 63.4黑莓叶的糖基组成分析 93.5溶解度分析 104.结果与分析 104.1多糖的提取 104.2 DEAE洗脱曲线 114.3 SephadexG-100多糖分子量测定124.4多糖TLC糖基组成成分分析174.5多糖溶解度的测定 205.结论 216.讨论 21致谢 22参考文献23淮海工学院二一二届本科毕业设计（论文） 第 23 页 共 23页 1 绪论1.1黑莓的简介黑莓blackberry蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)灌木，主要原产于新旧大陆北温带，北美东部和太平洋沿岸尤为丰富，在不列颠群岛和西欧为常见萌生林和绿篱植物。通常二年生，茎直立、半直立或攀缘，有刺，也有的栽培种无刺。叶为三出或掌状复叶，小叶宽，椭圆形，有柄，叶缘粗齿裂，多数叶宿存越冬。目前对黑莓的研究和开发利用主要都是集中在黑莓引种栽培和果实的加工利用上，对黑莓叶的功效成分和开发利用还没有被引起重视。我国利用黑莓叶片作为中药已有上千年的历史，据本草纲目记载：“其(黑莓)茎、根、叶、籽皆可人药，味甘性平，无毒；益肾固精，补肝明目，缩尿。根：浸酒食用，可养筋活血，消红退肿；茎叶：煎水，可外用止痒、治冻疮、治疱；叶捣烂，可敷恶疱。”1.2 黑莓叶的主要营养成分特点黑莓叶中富含黄酮类物质、糖、游离氨基酸、维生素及微量元素等多种对人体具有保健功能的物质。1.2.1 黄酮在黑莓叶中，起主要作用的是黄酮类物质。黑莓叶提取物粗黄酮具有抗氧化作用，并且随着添加量的升高，抗氧化性也会随之上升；黑莓叶提取物粗黄酮对DPPH具有较好的清除作用，并且随着添加量的升高，清除作用也会随之增加。黑莓叶中提取抗氧化物作为化妆品的原料之一，在现在社会也是十分常见的和普遍的。黑莓叶提取物能对脂质过氧化有抑制作用。黑莓叶中的黄酮还能促进人体的基础代谢，具有降低体内脂肪含量的重要作用，对抑制肥胖和治疗因肥胖而导致的疾病有巨大辅助作用。它将成为社会最多女性的福音，成为减肥瘦身产品的主角。1.2.2 糖类碳水化合物，亦称糖类，是人体的热能最主要的来源。它在人体内消化后，主要以各种葡萄糖的形式被吸收利用。葡萄糖能够迅速被氧化并提供（释放）能量。每克碳水化合物在人体内氧化燃烧可放出千卡热能。糖类对人体是十分重要的营养物质，黑莓叶中的药用成分是黑莓叶多糖可分为中性多糖和酸性多糖两类。多糖的主要作用有：的免疫调节作用，抗衰老作用，糖抗突变作用，糖体外抗氧化活性作用。1.2.3 氨基酸黑莓叶中含有丰富的氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、等氨基酸单独作用治疗一些疾病，主要用于治疗肝病疾病、消化道疾病、脑病、心血管病、呼吸道疾病以及用于提高肌肉活力、儿科营养和解毒等。此外氨基酸衍生物在癌症治疗上出现了希望。而黑莓叶中几种主要的氨基酸都有许多功效，例如：（1） 丙氨酸 （Ala） 它能够促进血液中的酒精代谢，增强肝脏功能，有保护肝脏的作用。 它能增加甜度，它的甜味是砂糖的1.2倍 。（2） 精氨酸 （Arg） 它能够降低血氨，促进人体内尿素的产生，有助于治疗肝昏迷等症状。 它有利于增加人体肌肉活力，保持性功能，对于精子减少症有很好的治疗作用。（3）丝氨酸 （Ser） 它能够降低血液中的胆固醇的浓度，防治高血压等疾病。 它对于结核细菌病有良好的治疗效果，可以治疗肺病。 它是脑等组织中的丝氨酸磷脂的重要组成部分。（4）谷氨酸（Glu） 它有降低血氨，有解氨毒的作用 。 它能够参与脑蛋白和糖的代谢，促进氧化，有维持和促进脑细胞功能的作用，能够改善中枢神经系统，提高智力。 它对于胃溃疡、胃液缺乏有治疗作用，促进食欲，利于消化。 它对治疗严重的肝功能不全、肝昏迷、酸中毒、癫痫精神分裂症、神经衰弱等都有治疗效果。 它能够保护保湿，防治皮肤干裂。（5）异亮氨酸 （ILE） 它能维持机体的平衡，且对精神障碍有很好的治疗作用 。 它能够增加食欲，同时还有抗贫血的作用。 当缺乏异亮氨酸时，人体就会出现衰竭，昏迷等症状。1.2.4 微量元素黑莓叶中富有多种微量元素，如锰、锌、铁等。Mn离子是我们公认的抑癌元素，Mn是硫酸软骨素合成酶的必需的辅助因子，能促进多糖聚合酶和半乳糖转移酶的活性，与蛋白质结合可以维持结缔组织的韧性及强度，这与中药无名异的主要成分是Mn02用于治疗痈肿、跌打损伤的功能一致。Mn对信息的传递、自由基的生成和灭活、生长、发育、繁殖、内分泌活动、造血、骨骼结构等方面均发挥重要作用。Fe、Zn能促进血液循环，有利于新陈代谢，其中zn对生物体内的免疫功能起调节的作用，并能通过酶系统发挥对机体代谢的调节和控制，达到抗菌、抗病的作用。若锌有缺乏将会导致骨、关节、皮肤的异常现象，致使免疫力下降。而铁离子也具有广泛的生理功能和生理学作用3。1.3 多糖的生理意义多糖在自然界中以不同形式存在于植物、动物和微生物中。 它们除作为结构支持物质外, 还具有许多生物活性和药效。药物类的多糖主要有动物多糖、植物和真菌多糖、海洋生物多糖等。 多糖具有高分子的聚阴离子, 能调节体内的阴离子浓度； 能与一些物质结合, 调节机体免疫功能, 防御细菌或病毒的感染; 具有抗凝血活性, 对抗血栓的形成; 能激活脂蛋白酶, 调节机体脂类代谢。 血管壁上的多糖具有大的粘滞性, 可保持或维持管壁坚韧性和通透性。 甜茶性味甘、平、无毒，常饮有滋肝补肾、清热解毒、消炎，生津润肺、止咳利咽的功效，能防治热咳、咽喉炎、口腔炎、声音嘶哑等症。具有防治胃酸过多、健胃祛滞、开胃助消化作用；饮酒过量者饮用，可提神醒酒；肥胖者和患有高血压者饮用，有减肥降脂、降压、降低血胆固醇、 抑制和廷缓血管硬化、防治冠心病及关节炎效果；它虽甜，但不合蔗糠和葡萄糖，最适宜忌食含糖食物的糖尿病患者饮用；另外有抗衰老、美容的作用能使人更健康美丽；同时具有提高人体免疫力、防癌抗癌、抗过敏等众多的保健功能。近年来己风靡日本、欧州、美国及中东等国家市场，我国沿海发达地区也开始使用，据预测，随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，以及工业发展、环境污染严重，甜茶必将会成为保健治疗又一常规主导消费品，市场消费量大，前景看好41.4 课题研究内容和意义本实验主要从黑莓叶中提取多糖，并进行物理和化学性质的研究，最后进行糖基组成的分析。植物多糖由于它们独特的功能和低毒性，作为新药发展的方向具有广阔的应用前景，越来越多的研究人员将目光投向植物多糖。黑莓叶多糖因其具有一些生理意义，所以将黑莓叶加工成茶制品，可以“变废为宝”， 创造更多的经济效益。黑莓叶多糖还可以应用于化妆品行业，具有抗氧化、抗皱、美白等特点。但是目前对黑莓的研究和开发主要集中在黑莓的引种栽培和果实的加工利用上，对黑莓叶的功效成分和开发利用未被重视，所以从长远的发展来看，大力研究和发展我国自己的黑莓叶加工产业不但势在必行，而且潜力巨大，前景广阔。2. 材料与试剂2.1实验材料黑莓的叶片洗净、烘干，并用粉碎机粉碎成黑莓叶粉末备用2.2实验试剂试剂名称 性质 生产厂家盐酸 分析纯 南京化学试剂有限公司浓硫酸 分析纯 南京化学试剂有限公司葡萄糖 分析纯 国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司氯化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司蒽酮 分析纯 国药集团化学试剂有限公司无水乙醇 分析纯 国药集团上海化学试剂公司丙酮 分析纯 国药集团上海化学试剂公司无水乙醚 分析纯 国药集团上海化学试剂公司乙酸乙酯 分析纯 国药集团上海化学试剂公司吡啶 分析纯 国药集团上海化学试剂公司G100 色谱纯 广州市齐云生物技术有限公司DEAE纤维素 色谱纯 广州市齐云生物技术有限公司蓝色葡聚糖2000 色谱纯 广州市齐云生物技术有限公司标准分子量葡聚糖 色谱纯 广州齐云生物技术有限公司各种单糖标样 色谱纯 广州齐云生物技术有限公司2.3 实验仪器仪器 型号 生产厂家数量恒温水浴锅 HH4 金坛市荣华仪器制造有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DHG9240A 上海精宏试验设备有限公司旋转蒸发仪 R502B 南京金正教学仪器有限公司低速冷冻离心机 DDL-5M 上海卢湘仪离心机仪器有限公司循环水式真空泵 SHBIII巩义市英峪予华仪器厂冰箱 BCD206T 青岛海尔股份有限公司电子天平 JA2003N 上海精密科学仪器有限公司磁力加热搅拌器 HJ-3 国华电器有限公司紫外可见分光光度计 754N 海精密科学仪器有限公司电脑全自动部分收集器 MODEL DBS-100 上海精密科学仪器有限公司恒流泵 BF-200 上海青浦沪西仪器厂层析柱（1.670cm、1.649cm ） 上海煊盛生化有限公司薄层层析硅胶板 H 安徽良臣硅源材料有限公司层析缸 200200 上海信谊仪器厂制造喉头喷雾器 L56-03 上海市嘉定区医疗设备厂3.实验方法3.1 黑莓叶水溶性多糖的提取工艺流程：前处理浸提取上清夜重复提取三次，合并上清液减压浓缩乙醇沉淀离心分离提取物初步鉴定粗多糖3.1.1 前处理：用粉碎机将黑莓叶进行粉碎，用索氏抽提装置2倍体积石油醚、2倍体积的乙醇将黑莓叶脱脂3.1.2 水提取：水浴锅提取温度为70、提取时间为210分钟，料液比为1:50残渣重复提取二次，合并上清液3.1.3 减压浓缩：将提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，水浴温度为60，转速为40r/min,真空度控制在0.075-0.085Mpa3.1.4 乙醇沉淀：在强烈搅拌的状态下向浓缩后的提取物中缓慢加入3倍体积乙醇（95%），期间有絮状物沉淀，静置1h3.1.5 离心分离： 将沉淀的提取物进行离心（4000r/min、10min）,离心后的沉淀物用无水乙醇、丙酮、无水乙醚交替搅拌洗涤2次3.2 黑莓叶可溶性多糖含量的测定3.2.1配制溶剂(1) 蒽酮试剂：取0.2g蒽酮溶于l00ml体积分数为80的硫酸中，当日配制使用。(2)标准葡萄糖溶液(0.1mgm1)：称取10mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至100ml。3.2.2实验步骤(1) 葡萄糖标准曲线的绘制取干净试管11支，按下表进行操作。以吸光度为纵坐标，各标准液糖含量(ug)为横坐标做图。表1 标准曲线的制作及样品测定参考表Table 1 Standard curve production and sample determination reference table管号步骤1(空白)23456标准葡萄糖溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20葡萄糖含量/mg00.020.040.060.081.00置冰水浴中冷却蒽酮试剂/ml4.04.04.04.04.04.0沸水浴中准确加热10min，取出，用自来水冷却，测吸光度A620nm(2)稀释：吸取提取液0.25m1，置于另一50 m1容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀。(3)测定：吸取1 ml已稀释的提取液于试管中，加入4.O ml蒽酮试剂，平行二份；空白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（ug）56。3.3黑莓叶水溶性多糖的纯化3.3.1 工艺流程：多糖粗品去蛋白、脱色透析上DEAE纤维素柱层析进行梯度洗脱蒽酮硫酸法进行跟踪检测合并主峰真空浓缩、透析上Sephadex-100凝胶柱层析洗脱蒽酮硫酸法进行跟踪检测分子量测定73.3.2 蛋白质的去除根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿：戊醇（或正丁醇）5:1或1:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿-戊醇（或正丁醇）生产凝胶物质分离，离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法在避免降解上有较好效果。3.3.3 脱色对于植物多糖来说，含有酚类物质存在。常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、技术络合物、吸附法（纤维素、硅胶土、活性炭等）。本实验采用活性炭吸附法。将烘干的多糖粉末进行溶解后，加入活性碳进行脱色。脱色条件为：脱色温度50，脱色计量0.15g/ml、脱色时间4h3.3.4 小分子物质的去除(1) 透析袋使用前处理方法 把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段。 在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。 用蒸馏水彻底清洗透析袋。 放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。 冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。 用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。(2)多糖透析把多糖样品加入透析袋中，用密封夹密封，放入蒸馏水中，每隔12个小时换一次蒸馏水，透析12-48h。3.2.5 Cellulose DEAE-52柱层析(1)原理离子交换纤维素的基质是由带电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷称之阴离子交换树脂，而带有负电荷的称之为阳离子树脂。阴离子交换基质结合带有负电荷的物质，这类糖被截留在柱子上，然后通过提高洗脱液的盐浓度等措施，将吸附在柱上的糖洗脱下来，结合较弱的多糖首先被洗脱下来。本文选取DEAE-Cellulose 52 阴离子交换纯化多糖。(2)配制试剂DEAE-Cellulose 52阴离子交换树脂柱的制备DEAE-Cellulose 52是弱碱型阴离子交换纤维素，二乙氨基乙基型（DEAE-52），交换基团-O-(CH)2-N(C2H5)，交换当量( 0.1-l.lmmol/g)。取75gDEAE-52加入500ml水，浸泡24小时，使纤维素颗粒充分膨胀，去除悬浮的细颗粒。其后再加4倍量的0.5mol/LHCL浸泡搅拌4h。滤去酸液，水洗至中性。再加4倍量的0.5mol/LNaOH浸泡搅拌4h，滤去碱液，水洗至中性。如此酸碱反复轮洗，直至洗出液无色澄清为止。最后再用0.5mol/L HCl洗涤，即制成Cl-型柱，脱气，备用。（抽干备用）。0.5mol/LHCL：取42ml浓盐酸，定容至1000ml。0.5mol/LNaOH：称取20gNaOH，定容至1000ml。2mol/LNaCl：称取58.5gNaCl,定容至500ml。0.1mol/LNaCl:称取称取2.925gNaCl，定容至500ml。(3)实验步骤 DEAE-Cellulose 52阴离子交换树脂柱的制备先将 1.6 X 70cm的层析柱垂直架好，用适量的水溶液排走其中的空气。在处理好的DEAE-52树脂中加蒸馏水超声脱气半个小时，搅匀，随即将此悬浊液沿玻璃棒缓慢、连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。（在装柱时可敲击柱壁，使填料均匀、紧密）吸附剂表面要平整应使其一直浸没在溶剂，严防气泡产生。用蒸馏水平衡（48小时），控制其流速，让200ml(约2倍柱体积)的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，使固定相高度恒定为45cm812 。 上样柱层析的上样量取决于分离组分的浓度及其对交换剂的亲和力。在一般情况下，分析柱的上样体积不应超过柱床体积的10%，制备柱的上样体积不超过柱床体积的40%。本论文使用1.6 X 70cm的层析柱，有效柱长为45cm，床体积为90.43mL，黑莓叶多糖的饱和溶液上样体积为40mL。旋开层析柱上端旋扭，待柱床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶（即缓冲液液面与胶床平面相切）时，立即将糖液小心地注入层析柱胶床面中央，注意切勿冲动胶床。慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有lmm液层时，用乳头滴管加入少量缓冲液，使剩余样品进入胶床，然后小心加满的洗脱缓冲液。