《口蹄疫背景知识》word版.doc

中农威特生物科技有限公司 专业知识 正文 口蹄疫病-OIE 2006年5月版 话题作者：OIE 话题来源：OIE 添加时间：2007.1.4 摘 要 口蹄疫Foot and mouth disease (FMD)是哺乳动物的烈性传染病，特别容易引起易感偶蹄动物发病并造成巨大经济损失。口蹄疫病毒有七个血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1，型与型之间没有免疫保护。临床症状不易与猪水泡病、猪口膜炎、泡疹等其它水泡性疾病区分。紧急签定只能依靠实验室诊断。 明显的临床症状是蹄部、口腔粘膜和母畜乳腺出现水泡。临床症状分中度和重度，有时会造成幼畜死亡。有些动物会出现亚临床感染，如非洲水牛(Syncerus caffer)。诊断用组织是未破裂或刚破裂的水泡皮、水泡液，如果采集不到上述材料也可采集血液和/或用探杯（probang cup）收集反刍动物的OP（oesophagealpharyngeal fluid）液，用试子收集猪的咽喉液。如果动物死亡可收集心肌或血液，如果有水泡，水泡更易诊断。 按照国际标准把采集的可疑病料的包装完好，病料只能送到权威机构。 只有在组织样品或者水泡液中分离到病毒或者口蹄疫病毒抗原或者核酸口蹄疫的才能确诊。检测病毒特异性抗体也可以确诊。不管是免疫还是没有免疫的动物，根据非结构蛋白抗体水平可以检测病毒感染情况。 诊断机构: 口蹄疫病毒性抗原或者核酸阳性就能确诊。由于口蹄疫病毒具有高致病性和经济影响特性，诊断实验室和血清型检测应该在符合OIE 4级病原微生物实验室标准。 由于酶联免疫吸附试验敏感、不受补体激活物和抑制物的影响，补体结合试验 (CF)在许多实验室已经被酶联免疫吸附试验取代。如果病料不足或者诊断不清楚，可用病料接种易感细胞或者27天吮乳小鼠扩增病毒。较适宜的细胞是初代牛甲状腺细胞，猪、羊、或者犊牛肾细胞，或者其它敏感的传代细胞也可以使用。水泡液可以直接用于补体结合试验、ELISA或者反向聚合酶链反应。也可以用死亡小鼠的胴体研磨悬液做上述试验。 由于RTPCR快速、敏感，现在逐渐用于核酸诊断试验。电镜检查病料有时也用于签别诊断。 血清学试验：没有免疫的动物有水泡并检测到非结构蛋白的话，可以做出阳性诊断。此种情况主要适用于温和型病症或者收集不到水泡皮的时候。与免疫没有关系，口蹄疫病毒非结构蛋白的检测可以诊断出宿主的病毒繁殖前期或者病毒繁殖期。非结构蛋白不同于结构蛋白，它是高度保守的，没有血清特异性。 病毒中和试验 (VN)：结构蛋白ELISA可以进行血清签别试验。因为病毒中和试验依靠的是组织培养，所以比ELISA更能说明病毒的活性，但是速度慢，易污染。ELISAs 检测抗体速度快，不依赖细胞培养。ELISA可以用没有活性的抗原做，所以对于实验室生物安全要求低。 疫苗和生物诊断的要求：市场上有不同类型的灭活疫苗，通常是用病毒感染悬浮细胞或者单层细胞，然后澄清再用二乙烯亚胺灭活后加佐剂。由于不同地区流行不同的病毒型，所以许多口蹄疫疫苗是多价的。 疫苗最终产品中不得含有活病毒。通常是在浓缩灭活病毒还没有配苗前用活体试验检测，而对疫苗中活病毒的检测则用体内和/或体外试验检测。尽管疫苗中抗原含量与保护率、抗体反应的相关关系已经建立起来了，但仍对免疫牛进行攻毒试验检测PD50(50% protective dose)或者蹄部感染的总体保护（generalised foot infection PGP)确定疫苗的效价。 生产口蹄疫疫苗的场所要符合OIE4级病原生物安全要求。 OIE口蹄疫参考实验室和FAO口蹄疫参考实验室提供诊断试剂。Pirbright动物健康实验室肩负着OIE和FAO世界口蹄疫实验室的双重职责。 A. 介绍 口蹄疫病是由细小病毒属的口蹄疫病毒引起。共有七个血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1，所有七个血清型都能引起偶蹄疫动物发病。不同的血清型之间没有免疫保护，大多数毒株可以用生化或免疫试验鉴别。 在非洲，口蹄疫病毒主要由黄牛和非洲水牛携带，它们是主要的宿主。有证据显示如果没有非洲水牛，家畜和其它野生动物持续感染期只有几个月。尽管也有家养猪、绵羊、山羊携带病毒的实例，但是世界上其它地方黄牛通常是病毒存贮者。这可能是在一定条件下病毒改变了其对其它动物的适应性。但是在实验室和田间，猪源Cathay毒株都不能感染大的反刍动物，此株毒只能用猪肾初代细胞分离。非洲以外的大型野生动迄今为止还没有发现带毒现象。以前报道鹿感染口蹄疫的情况是因为直接或间接接触了染病的家畜。 黄牛、猪、绵羊、山羊等家畜和水牛是口蹄疫的敏感动物。另外，还有许多野生偶蹄动物，如鹿、羚羊、野猪在接触非洲水牛的条件下也可以感染，并在疫病的传播中起非常重要的作用。从野猪和鹿中分离的口蹄疫病毒株可以感染黄牛。野生动物口蹄疫诊断与家畜口蹄疫诊断方式类似。易感动物感染病毒后，会在蹄部、口腔和母性乳腺出现水泡。并且根据蹄冠水泡可以判断发病时间。病症严重者蹄匣会脱落。奶牛会继发乳腺炎。在其它部位有时也会出现水泡，如鼻内腔、和跗关节处（特别是猪）。毒株、动物接触的病毒量、动物的年龄、动物的品种、病源宿主、免疫状况不同，临床症状的严重程度也不一样，可以表现为温和型或者隐性一直到重度发病。幼畜可以引发心肌炎而致死，在其它部位可发生肌炎。 如果是口蹄疫导致的偶蹄幼畜死亡，仔细检查成年动物会发现水泡，但是致死动物身上的水泡有的明显，有的不明显。 患有水泡性疾病的动物，可以采集水泡液、水泡皮、OP液、奶、血液做口蹄疫诊断。也可从血液、死亡动物的心脏或者其它组织器官中分离病毒。可以电镜检查心肌炎（俗称“虎斑心”）。 患病动物的呼吸道可以复制和排泄病毒。急性发病期的动物可以造成气源性排毒。所有的排泄物中都含有口蹄疫病毒，急性发病期动物呼出的气体中也有病毒。疾病通常通过患病动物直接接触感染易感动物，即将易感动物显露在有急性发病期动物排泄物的环境中。急性发病后的动物排泄除在一些反刍动物OP液中病毒能够继续繁殖外，其它排泄物中不再含有感染性病毒。如果康复动物OP液中病毒携带期超过28天，则通常看作是病毒携带者。猪不是病毒携带者。长期观察得知非洲水牛偶尔可以通过亲密接触引起其它易感动物发病，此机理现在还不清楚。牛的病毒携带期一般不超过6个月，个别可以长达3年。非洲个体带毒可以达到5年，一般不会终身带毒。而群体带毒可以达到24年或更长。而其它品种的水牛带毒时间还没有报道。中东湿地水牛、家养水牛、羊的带毒时间一般不会超过几个月。 鉴于口蹄疫的高度传染性和经济影响力，实验室诊断和血清定型应该在符合在1.1.6章节中要求的设施中进行。没有相应实验室的国家和地区应当把样品送到OIE参考实验室。口蹄疫疫苗厂同样要符合生物4安全标准。 OIE参考实验室可以提供口蹄疫成套或者单一的诊断试剂。跟活病毒相比，酶联免疫吸附试验中使用的灭活抗原、抗原检测试验中的对照试剂、液相竞争或者固相阻断ELISA中使用的试剂可以在生物安全级别较低的环境中使用。试剂可以分别冻干、有干油或者没有干油在+1到+8、30到5、90到50保存多年。国际原子能机构有推荐的试验和质量控制标准。 B. 诊断技术 实验室诊断可选择上皮和水泡液。理想的情况是采集未破裂的或者刚破裂的舌面上的水泡皮、口腔膝膜上的水泡皮、或者蹄部水泡皮至少采集1g。为了避免人员伤害，减少动物疼痛，建议采集样品时对动物进行镇静处理。 上皮样品应该放在干油和pH7.2-7.4，最好含有抗生素（青霉素1000IU）的0.04M磷酸盐缓冲液等量混合液中运输。如果没有0.04M磷酸盐缓冲液，组织培养液或者磷酸缓冲液（PBS）也可以使用，但是应该注意干油缓冲液的最终pH控制在7.2-7.4。口蹄疫病毒在酸性环境很脆弱，缓冲液对于保证样品的采集致关重要。样品在送到实验室之前应该保持冷冻或者放到冰中。 如果反刍动物在发病前期、恢复期、无临床症状的可疑情况下，可以用探杯（probang cup，如果是猪，就用咽喉拭子）采集OP液送到实验室做病毒分离试验或者反转录聚合酶联反应(RT-PCR)。病毒血症也可以通过RPPCR或病毒分离试验检测血清。如果使用拭子采集咽喉液，应当用有颈部固定的支架从背部把猪保定。用一适当的器械如血管钳把拭子送到口腔后部或者到达咽部。 在采集牛或者大型反刍动物（如水牛）的OP液前，2ml运输液(含有0.01%牛血清蛋白、0.002%酚红和抗生素1000单位/ml的青霉素，100单位/ml的制霉菌素，5单位/ml的多粘菌素的0.08M 磷酸盐缓冲液，pH调节到7.2)加到适宜于干冰或者液氨的5ml容器中。 把探杯伸到O/P部位（食管开始部和咽喉背部）用力来回拉510次。主要是收集食管开始部、咽喉壁、隐窝以及软颚表面的上皮细胞。如果收集量不足，可以现将采集。 用控杯收集的OP液后，把OP液倒到20ml容积的透明广口瓶中。检查确认OP液中应该有可见的细胞性物质，之后把2ml倒入2ml的运输液中，并保证细胞性物质也一齐倒入，轻轻摇动混匀，此时的pH应该是7.6。样品中有瘤胃反刍物则不适宜于培养。用清水或者PBS涮洗口腔和喉部后再采样。如果同时有几头动物需要采样，则必须把探杯清理干净，以防混淆样品。可以先用自来水清洗，再浸入适当的消毒液(如0.5% w/v柠檬酸，自来水配制)，然后用水清洗干净消毒液后采样。 小反刍动物OP液的采集是把2ml运输液倒入20ml容积广口瓶中，然后把采了样的探杯在运输液中涮洗出OP样。再转移到5ml瓶中运输。运输瓶要适宜于干冰或者液氮冷冻。 收集好的OP液要立即冷冻。如果运输时间有几个小时，应当把样品放到干冰或者液氮中。冷冻前瓶口用不能漏气的盖子或者硅胶密封。特别是干冰保存条件下，二氧化碳进入瓶内会降低pH值，进而使可能存在的口蹄疫病毒失活。不宜用玻璃容器装样品，否则当液氮进入容器内，样品解冻时有爆炸的危险。样品应该在冷冻至少是有冷却条件下送到实验室。 不管是国内还是国际间运输样品，易腐败的可疑口蹄疫样品需特别注意。国际联合航运协会(IATA)的危险物品条例对诊断样品的包装和运输有商业运输要求。 1. 鉴别方法 a) 病毒分离 甘油对细胞培养有毒性，所以上皮组织从PBS甘油液中取出后，用吸附纸把液体吸干，称重。在洁净的研钵中放入少量的上皮组织、培养液和抗生素研磨。之后逐渐加上皮组织9倍重量的培养液，制成10%的悬液。2000g离心10分钟，上清液接种细胞或者未断奶的小鼠。敏感细胞培养系统包括初代牛甲状腺细胞、初人代的猪、牛或者小羊肾细胞。建立起来的细胞系如BHK-21和IB-RS-2也可以使用，但是检测感染力低的少量样品时敏感性比牛初代甲状腺细胞差。所有细胞的敏感性都应该用标准的口蹄疫病毒测定。IB-RS-2细胞用于猪水泡病(只能在此细胞上生长)和口蹄疫的鉴别诊断，而在分离牛源性毒株如O Cathay时显得犹为重要。细胞培养时在48小时内检查细胞病变效果 (CPE)。如果没有出现CPE，把细胞冷冻后再融化，再接种新鲜细胞培养，48小时内检查细胞病变情况。可用未断奶的小鼠替代细胞，小鼠选用27日龄的自然品系。有些田间病毒需要经过几代培育才能适应小鼠。如果使用OP液，用等量的chloro- fluoro- carbons预处理，把病毒从免疫复合物中解离出来，以提高检测效果。 b) 免疫学方法 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验可以较好地检测口蹄疫致病性抗原和血清型定型。这是间接夹心试验，先用七种型的口蹄疫病毒的兔抗血清包被多孔板，一个型包被一排。然后包括对照，每排加样品。加完兔抗豚鼠血清的酶结合物后，再加每个血清型的豚鼠抗血清。第一步必须彻底清洗以除去未结合的试剂。加入酶底物和色原后，阳性样品显色。明显的阳性反应，肉眼可以观察到颜色反应，但是结果也可以用一定波长的分光光度仪读取。吸光大于背景0.1以上为阳性，血清定型同步进行。接近0.1的应当重做或者用组织传代扩增抗原后检测上清液的CPE。下面是详细的规程。其它规程在配方和判定标准上有细微差别。 由于感染动物和采集地域的差别，应当同时检测水泡病病毒或者口膜炎病毒。最好是对所有的水泡性病原全部检测。 口蹄疫病毒（必要时加上水泡病或者口膜炎病毒）七个血清型146s抗原的兔抗血清是pH7.6碳酸/重碳酸缓冲液中最适浓度的捕获抗体。 从七个口蹄疫病毒型（如果有条件允许可以加上水泡病和口膜炎病）的单层细胞（用IB-RS-2细胞繁殖水泡病病毒或者口膜炎病毒）上繁殖病毒中选择合适的毒株当对照抗原。不用纯化，上清液即可加到ELISA板上，最适稀释度取吸光曲线顶部的稀释度（最适大约是2.0）。5倍稀释的对照抗原比滴定曲线上的推导值增加了2个低浓度的最佳浓度。含有0.05%吐温20和酚红的PBS做稀释液。 用146s口蹄疫病毒抗原接种豚鼠（猪水泡病也可以）制备豚鼠抗血清，七个血清型都可以制备，豚鼠抗血清用正常牛血清（NBS）阻断后就成了检测抗体。用含0.05%吐温20、5%脱脂奶粉测定最佳浓度。 兔（或者绵羊）抗豚鼠免疫球蛋白与辣根过氧化物酶结合，然后用正常牛血清阻断，再检测最佳浓度。也可用适当的单克隆抗体替代豚鼠和兔抗血清包被ELISA板来捕获抗体。 试验步骤 i) ELISA板的A到H排分别加用pH9.6、0.05M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的、最佳浓度的O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1、SVD或者VS兔抗病毒血清50 l/孔。 ii) 4静止过夜或者37、100-200转/分钟振荡1小时。 iii) 制备检测样品的悬液（10%样品原液或者未澄清细胞培养液表层液）。 iv) 用PBS把ELISA板清洗5记遍。 v) 每个板的4、8、12列加50l PBST。另外在第一块板的A到H排的1、2、3孔再加50l PBST。第一块板A排的第1个孔加12.5l O型对照抗原，B排第一孔加12.5l A型对照抗原，依此方法加C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1、SVDV、VS（视其必要性）对照抗原到C到H排的第一孔。混匀后，每排（A到H）每一孔的12.5l液转移到第二孔，再次混匀后从第二孔转移12.5l液到第三孔，第三孔里的液体混匀后，从第三孔里弃去12.5l液体(这样每个对照抗原就做了5倍的系列稀释)。只需在不同抗原情况下更换滴头。板子的其它孔加检测样品。在A到H排的5、6、7列中加50l样品，第二份样品加到A到H排的9、10、11列。 如果每次检测的样品超过2份，其它的ELISA板按下面的方法做： 在A到H排的4、8、12列中加50l PBST。注意对照抗原不必在此板上加。检测样品可以在A到H排的1、2、3、5、6、7、9、10、11列分别加50。 vi) 加盖，37振荡1小时。 vii) 用PBS冲洗板子 洗三遍，排空孔里的液体，用吸水纸吸干。 viii) A排到H排按次序每孔分别加50最佳浓度的豚鼠抗O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1、SVD、VS血清。 ix) 加盖，37振荡1小时。 x) 板子洗三次，第孔加50l兔抗豚鼠免疫球蛋白辣根过氧化物酶结合物。加盖，37振荡1小时。 xi) 板子洗三次，每孔加含0.05% H2O2 和orthophenylene diamine或者chromogench 50l底物溶液。 xii) 15分钟后每孔加50l 1.25M的硫代硫酸。用与电脑联接的分光光度计在492nm处读板。 补体结合试验 通常来说，ELISA比补体结合试验敏感，并且不受补体前体和颉抗物的影响。如果做不成ELISA，那么按下面的方法做补体结合试验： 在U形底的微量滴定板上，从1/16起稀释口蹄疫七个病毒的抗血清，用巴比妥缓冲液做1.5倍系列稀释，每孔留液体25l。加50l 3个单位的补体，再加25l样品悬液。37孵育1小时，加25l 用5单位兔抗SRBC敏化的1.4%的标准化绵羊红细胞。37孵育30分钟，板子离心后，读板。试验要包括抗血清、细胞、补体的对照。补体结合试验的滴度用50%红细胞溶血的血清稀释度表示。滴度36判定为阳性，24则需要组织扩增抗原后重测。 c) 核酸检测法 PCR可以扩增诊断材料中口蹄疫病毒的片段。RT-PCR可以扩增包括上皮、奶、血清、OP液样品中口蹄疫病毒基因片段。RT-PCR敏感性好，自动程序能够提高样品的检出率。设计出特殊的引物可以区分不同的血清型。体外的杂交技术已经用于检测样品中的口蹄疫病毒的RNA，目前此项技术只在特殊的实验室里运用，其田间能够运用的简易步骤还没有开发出来。 实时RT-PCR OIE在Pirbright的参考实验室使用此法。RT-PCR法由三个连续的总分组成(i)从试验或者对照样品中提取模板RNA(ii)反转录RNA(iii) PCR扩增反转录产物(iv)凝胶电泳检测PCR产物。 试验步骤 i) 在无菌的试验管中加200l试验样品到1ml TRIzol Reagent中，70存放。 ii) 加1ml溶液到i)有200l氯仿的新鲜、无菌试管中，摇撼1015秒混匀，室温下放置3分钟。 iii) 20,000 g离心15分钟。 iv) 把500l水相转移到有1l肝糖(20 mg/ml)的洁净无菌试管中，再加500l异丙醇，摇振几秒钟混匀。 v) 室温放置10分钟，然后20,000g离心10分钟。 vi) 弃去上清液，加1ml70%的酒精，摇振几秒钟混匀。 vii) 20,000g离心10分钟。 viii) 小心除云上清液，注意不要搅散和除去底部物质。 ix) 室温下干燥2-3分钟。 x) 加20l无离子水重悬沉淀物。 xi) 把提取的RNA放到冰上等待反转录。否则70贮存。 xii) 在0.5ml的微量离心管中加2l random hexamers (20 g/ml)和5l无离子水。建议每次制备相应的稀释液。 xiii) 加5l萃取的RNA，这样每个离子管中有12l液体。用滴头把底部物质轻轻打散。 xiv) 70孵育5分钟。 xv) 室温下冷却10分钟。 xvi) 在10分钟的孵育时间内，按下述方法准备RT反应混合物。一次性在1.5ml微量离心管中制备所有分析样品的反应混合物。 First strand buffer, 5 conc. (4 l); 牛血清蛋白(乙酰基化), 1mg/ml (2l); dNTPs, 10mM dATP, dCTP, dGTP混合物, dTTP (1l); DTT, 1 M (0.2 l); 反转录酶 200U/ l (1l)。 xvii) 加8l反应混合物到12l随机引物和RNA。用滴头轻轻吹打。 xviii) 37孵育45分钟。 xix) 把RT产物放在冰上，等PCR扩增，否则20贮存。 xx) 按下面的方法制备PCR混合物。建议一次性制备。 无离子水(35 l); PCR反应缓冲液, 10 conc (5 l); MgCl2, 50 mM (1.5 l); dNTPs, 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1l)混合物；引物1, 10pmol/l (1l)；引物2, 10pmol/l (1l); Taq 聚合酶 5units/l (0.5l)。 xxi) 对于每个样品，把45l PCR反应物加到PCR板的一个孔或者微量离心管，再加5l RT 产物，此时反应总量是50l。 xxii) 通过旋转或者离心1分钟，把液体混匀。 xxiii) 把板子放到PCR热循环仪中，按下面的方法运行： 94 5分钟：1个循环； 94 1分钟， 55 1分钟， 72 2分钟：30个循环； 72 7分钟：1个循环。 xxiii) 20l PCR反应产物水相与4l染色液混合后，加到1.5%凝胶上。电泳后，阳性结果在328bp 有带显示，相当于口蹄疫病毒基因5端未翻译区。 贮存液 i) 无核酸酶水、TRIzol Reagent、氯仿、肝糖、异丙醇、乙醇、随机六核甘引物、First strand buffer、BSA (acetylated)、dNTPs、DTT、反转录酶、PCR反应缓冲液(10)、MgCl2和Taq 聚合酶。 ii) 10pmol/l的引物，序列为：5-GCCTG-GTCTT-TCCAG-GTCT-3 (正链)；引物2序列： 5-CCAGT-CCCCT-TCTCA-GATC-3 (负链)。 iii) TaqMan 探针，浓度为5pmol/l，序列是：5-CCTCG-GGGTA-CCTGA-AGGGC-ATCC-3 实时RT-PCR OIE在Pirbright的实验室有操作规程。实时RT-PCR的总RNA萃取法与RT对照样品RNA萃取法相同。PCR扩增RT产物法则不同。在实时扩增中凝胶中的PCR产物不需要测定。 i) 从第9步取RT产物 (见上面)。 ii) 按下面的方法制备每个样品的PCR混合物。同样建议一次性制备。 无核酸酶水(6l)；PCR反应基本液2 conc. (12.5l)；引物1，10pmol/l (2.25 l)；引物2， 10pmol/l (2.25l)；TaqMan 探针5pmol/l (1l)。 iii) 把24l PCR反应基本液加到实时PCR板孔中，再加1l RT产物，最终液体量为25l。 iv) 在相应的离心上用1分钟时间把内容物混匀。 v) 把板子放到实时PCR机上扩增，按下面的方法进行： 50 分钟：1个循环； 95 10分钟：1个循环； 95 15秒，60 1分钟：50个循环。 vi) 结果读取： 设定循环阀值，每个PCR反应循环次数与荧光量有关，不同的样品其判定值不同。阀值是判定阳性或者阴性的标准，不同实验室其判定标准不同。例如OIE参考实验室阴性判定点和阴性对照的阀值50.0，而阳性样品或者阳性对照的值40。样品的值在4050之间判为中间值，需要重测。强阳性的CT值小于20.0。 已经定出了从样品或者阳性对照中自动萃取总核酸，在32孔板或者96孔板中自动加样进行RT和PCR法的规程。手动萃取总核酸，手动进行RT和PCR扩增的规程也有。 口蹄疫的分子流行病学是经对比不同病毒基因差别的基础上建立的。已经制备出了七个血清型疫苗和田间毒株1D基因序列（VP1病毒蛋白编码）系统树图。反转录PCR扩增口蹄疫病毒RNA，接着测序，对得到的数据做比较。许多实验室已经做了这方面的研究，参考实验室已经收集到了3000个序列。 推荐的方法如下： i) 直接从上驉皮悬液或者低代的细胞培养液中萃取口蹄疫病毒RNA。 ii) 把整个1D基因进行RT -PCR(或者是部分1D基因，当然3端的基因更好)。 iii) 对PCR产物测序(或者3端的核苷酸至少170个而非法南非型则需要420个)。 可以在OIE参考实验室通过下面的网址索要操作规程和完整的引物序列： http:/www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/aphthovirus/fmd.htm .br/textoc/SerManDid17.pdf 2. 血清学试验 口蹄疫病毒血清学试验的主要目的有四个：1)进出口动物检疫(经济贸易)：2）确认可疑动物；3）证实没有感染者；4）证明免疫有效性。要证实有没有感染，首先要搞清楚动物免疫了没有，是紧急免疫还是常规免疫，不同的情况使用不同的检测方法。例如，血清检测阀值的设定分为个体和群体，在确定感染个体感染和贸易中分别使用。 口蹄疫血清学试验有两类：检测病毒结构蛋白（NPs）和非结构蛋白抗体(NSPs)。 结构蛋白试验是血清特异性的，可以检测到免疫和感染的抗体，如病毒中和试验、固相竞争 ELISA和液相阻断ELISA。如果试验中使用的病毒或者抗原与田间流行的毒株关系密切，那么这些试验可以测出血清型，敏感性也高。这些试验可以运用于贸易，以免疫动物是否感染或正在感染，同样可以检测田间免疫效果。病毒中和试验需要细胞培养设备，要有活病毒经23出结果。ELISA试验分为阻断和竞争两种，用不同型的单克隆或者多克隆，特点是快速、不依靠组织培养、不需要活病毒。两种ELISA试验都会出现少量的假阳性。结合ELISA和病毒中和试验可以降低假阳性结果。OIE参考实验室可以提供部分血清型和血清亚型的、用于血清学试验的结构蛋白参考血清。 不管动物免疫过没有，检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体以区分动物有没有感染史。此方法是在群体的基础上确认口蹄疫可疑动物、检测病毒活动情况或者有没有感染。在贸易中使用此法比结构蛋白法具有的长处是无需知道病毒的血清型。然而，有试验证明有的牛免疫后用活病毒攻击后可持续感染，但是有可能在非结构蛋白试验中为阴性。这些试验检测的是通过体外各种重组表达系统生产的非结构蛋白抗原的抗体。结合蛋白3AB或者3ABC的抗体通常是感染的最好证据。一些3AB或者3ABC抗体阳性的动物，其它非结构蛋白抗体可以试验最后得以区分。然而，部分疫苗配苗时分类不清，并反复免疫，造成不纯疫苗，影响诊断的特异性。本章D节有关于疫苗纯度的评价方法。 OIE参考实验室、Panaftosa、PAHO/WHO可以提供牛非结构蛋白试验的国际标准血清，将来，也可提供绵羊和猪的标准血清。OIE参考实验室已经起来了牛血清板比较非结构蛋白试验。 a) 病毒中和(国际贸易规定的试验) 用IB-RS-2、BHK-21、犊羊、猪的肾细胞在平底的微量板上做病毒中和试验。 病毒在单层细胞上繁殖，加50%甘油20C保存(在此条件下病毒至少可以保存1年)。试验前把血清 56C灭活30分钟。标准对照血清感染后21天或者痊愈后采集。培养基是有抗生素的Eagles/LYH (加水解乳蛋白的Hanks盐平衡液)缓冲液。 试验用的量是50。 试验步骤 i) 用50l从1/4开始，作2倍系列稀释，每个血清作2排，最好是4排。 ii) 加滴定好的病毒，50l的病毒悬液的病毒含量是100TCID50 (50% tissue culture infective dose)，病毒含量变化范围是32320 TCID50。 iii) 对照试剂包括测好效价的抗血清、阴性血清、细胞、培养液，以及病毒滴定法。 iv)板子加盖，37C孵育1小时。 v) 用含10%牛血清（特异性抗体阴性）的培养基把细胞悬液稀释成106 cells/ml。每孔加50 l细胞悬液。 vi) 板子用压力敏感膜封盖，37C孵育23天，也可以用轻松的盖子盖上板子，在35%二氧化碳培养箱中37C培养23天。 vii) 48小时后显微镜观察。板子在第三天固定染色。用10% formol/saline作用30分钟固定细胞。把板子浸在0.05%亚甲兰10%福尔马林液中作用30分钟染色。也可以用萘兰黑染色(0.4% w/v naphthalene blue black, 8% w/v柠檬酸)。板子用自来水清洗。 viii) 阳性孔(病毒被中和了，细胞保持完整)细胞染成兰色；阴性孔(病毒没有中和)是空的。滴度用混合孔50%被保护的血清最终稀释度表示(Krber, 1931)。每孔的病毒量在. log10 1.52.5 TCID50，阳性标准血清在预计滴度的2倍内，试验有效。 ix) 由于阴/阳性血清的判定点不同，不同实验室的试验结果判定也不同。每个实验室应该根据OIE参考实验室的标准试剂，设定各自的判定标准。一般而言，血清/病毒混合的血清最终稀释度1/45时判定为阳性。1/16判为阴性。国际贸易中个体的判定标准认为滴度在1/16到1/32是可疑，须重新采集血清检测；如果重新检测的值1/16判定为阳性。而在群体基础上做血清检测则把判定点设在1/45比较合适。而要评判免疫效果，判定点则针对不同的疫苗和免疫动物要建立在效力实验的基础上。 b) 固相竞争酶联免疫吸附试验(国际贸易规定试验) 146s抗原的兔抗血清作为捕获抗体，用pH9.6的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液把兔抗血清稀释到最佳浓度。 按照疫苗生产工艺，二乙烯亚胺把细胞上系列的病毒灭活后制成抗原。最佳稀释度应该选在滴主曲线上吸光度项部 (最佳浓度约是1.5)。含有0.05%吐温20、10%正常牛血清5%正常兔血清和酚红的PBS做为稀释液。 用146s抗原免疫豚鼠，采集血清后用正常牛血清阻断制成豚鼠抗血清以检测抗体。用含有0.05%汢温20、5%脱脂奶粉的PBS测定最佳浓度。 兔（或绵羊）抗豚鼠免疫球蛋白与辣根过氧化物酶结合，用NBS阻断，用PBSTM缓冲液测定最佳稀释度。 试验血清用PBST稀释。 固相竞争ELISA与液相阻断ELISA敏感性相同，但是特异性更高。试验方法在研制第二血清和分析制表中述及。 试验步骤 i) 用pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐稀释的兔抗口蹄疫抗血清包被ELISA板，每孔l，4C湿盒中过夜。 ii) 用PBS把板子清洗3遍。 iii) 用阻断缓冲液稀释的口蹄疫病毒抗原50l加到ELISA板中。(阻断缓冲液：0.05% w/v吐温20， 10% v/v正常牛血清，5% v/v正常兔血清)。板子加盖，振荡器上37C孵育1小时。 iv) 用PBS清洗三遍，每孔加40l阻断缓冲液，再加10l血清（或者对照血清），制成最初血清1/5稀释度。 v) 立即加用阻断缓冲液稀释的豚鼠抗口蹄疫抗血清50l，此时血清稀释度为1/10。 vi) 板子加盖，振荡器上37C孵育1小时。 vii) 用PBS把板子清洗三遍，用阻断液稀释的1g抗豚鼠结合物50l加到板中(预先用等量的NBS在室温下预阻断1小时)。板子加盖，振荡器上37C孵育1小时。 viii) 用PBS清洗三遍，加含有0.05% H2O2和orthophenylene diamine或者氯仿的底物溶液每孔加50l。 ix) 10分钟后，加1M硫代硫酸50l中断反应。在与电脑联接的分光光度仪中于492nm处读数。 x) 对照： 每个板子的2个孔用于结合物对照（没有豚鼠血清）、2孔用于阴性血清、4孔用于0%竞争（没有试验血清）。 xi) 结果的表达：手算或者电脑计算每孔的抑制百分比(100 试验或对照值/0%竞争最佳浓度平均值 100%)，表示试验血清和豚鼠抗口蹄疫病毒抗血清与口蹄疫病毒抗原的竞争。实验室应当根据阳性判定值结合以下情况验证试验(i)调查的特定血清型和毒株；(ii)试验的目的；(iii)检测的群体数量（见1.1.3.章的方法）。OIE参考实验室O型的标准是，对于任何品种，检测感染情况时如果一个新的群体中超过60%被抑制，说明试验为阳性。为了在国际贸易中提高敏感度，可疑的范围定在4060%。 c) 液相阻断酶联免疫吸附试验 抗原从BHK-21单层细胞敏系列的毒株制备。直接用2倍系列不加血清稀释预滴度上清液。最终的滴度选择在滴定吸光曲线项部（最佳浓度约为1.5）（见下）。稀释液是含0.05%吐温20和酚红指示剂的PBS（PBST）。其它试验试剂与固相阻断ELISA中的相同。下面对试验方法做了叙述。但是温度和孵育时间不同。 试验步骤 i) ELISA板每孔加50l兔抗146s抗原的血清，湿盒中在室温过夜。 ii) 用PBS把ELISA板洗三次。 iii) 在U形底的微量板，试验血清从1/8起，加50l做两排（重复一排）2倍系列稀释。每孔加50l兔抗血清的同源毒，4C过夜或者在37C孵育1小时。那么血清起始稀释度此时为1/16。 iv) 然后把50l血清抗原混合物转移到兔血清包被的ELISA板中，37C振荡1小时。 v) 清洗后，每孔加50l豚鼠同源口蹄疫病毒抗血清（预先用正常牛血清阻断，用含5%脱脂奶粉的PBS稀释）。37C振荡1小时。 vi) 清洗后加50l兔抗豚鼠免疫球蛋白辣根近氧化物酶结合物（预先用正常牛血清阻断，用含5%脱脂奶粉的PBS稀释）。37C振荡1小时。 vii) 板子清洗三遍，每孔加50l含有H2O2和orthophenylene diamine或者氯仿的0.05%底物溶液。 viii) 15分钟后加1M硫代硫酸钠50l中止反应。在与电脑联接的分光光度计中于492nm处读数。 ix) 对照：每块板至少有4孔最终稀释度为1/32的强阳性、弱阳性、阴性牛血清和试剂对照和4孔没有血清的试剂（抗原）对照。每个最终滴定试验至少在每个试验步骤里的一块板子上设2排2倍稀释的同源牛阴、阳性血清作为参考。 x) 结果的表达：抗体滴度用50%最终滴度表示，如能够对对照（抗原）试剂最佳浓度50%抑制的最佳浓度作为试验血清滴度(Krber, 1931)。计算方法是，除去最高值和最低值后取2个对照孔的平均值(如果设定了偏差，最高值和最低值也可以使用)。通常情况下如果血清滴度1/90判定为阳性，如果滴度40判定为阴性。在国际贸易中要确认个体的情况时如果滴度1/40，但是1/90判定为可疑，需重新采集血清后检测，如果此时1/40，则判为阳性。如果是群体水平上的血清学统计监测，则判定点设为1/90比较合适。要是判定疫苗免疫保护效果，则要参照相关疫苗和免疫动物具体试验数据设判定点。 d) 非结构蛋白试验 口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(如3A, 3B, 2B, 2C, 3ABC)可以用不同的ELISA或者免疫显色技术检测。这些ELISA要么是把纯化的病毒直接吸附到微量板上要么是使用多克隆或者单克隆抗体捕获半纯化的特殊性抗原。下面详细介绍了Panaftosa使用的筛选方法。其它间接和竞争ELISA检测牛3ABC抗体同样具有诊断价值。Panaftosa的研究证明在牛、羊和猪上，这些试验基本相似。 间接酶联免疫吸附试验 制备重组抗原(见B.2.d. 酶联免疫电泳转移试验) 试验步骤 i) 在pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐中的1g/ml（100l/孔）溶合3ABC抗原包被微量板，4C过夜。用酶联免疫电泳印迹试验（EITB）表达和纯化3ABC。 ii) 含0.05%吐温20，pH7.2的PBS把板子清洗6遍。 iii) 试验血清（100l/孔）用含0.05%吐温20、5%脱脂奶粉、10%马血清和0.1%大肠杆菌溶解物的PBS缓冲液1/20稀释。每块板要设强阳性、弱阳性和下述的国际标准血清校正的阴性对照。 iv) 37C孵育30分钟，用PBST清洗6次。 v) Horseradish-peroxidase-conjugated rabbit anti-species 兔抗IgG辣根过氧化物酶结合物用阻断液稀释到最佳浓度，每孔加100l。37C孵育30分钟。 vi) 清洗6遍，每孔加0.004%(w/v) H2O2 pH5.5的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液稀释的100l 33, 55-l四甲基对二氨基联苯（tetramethylbenzidine）。 vii) 室温孵育15分钟后，加100l 0.5M硫酸中止反应。吸光值用620nm背景值校正后，在450nm处读数。 viii) 结果的表达：试验结果用强阳性对照的百分比表示 (试验或者对照/强阳性对照最佳浓度) 100或者试验数据与判定指数（阳性阀值）的比。对免疫动物群体检测中，非结构蛋白抗体的反应水平可以帮助确定群体感染状态。不管设不设可疑区，试验判定阀值要结合试验目的和动物群体设定。得不到结论的结果要用定性试验确定。对于多次免疫的动物，建议使用EITB。但是对于免疫一、二次的动物，如果出现难以判定的结果，用第二种非结构蛋白ELISA检测(结合两种ELISA试验结果)，当然在设计血清监测计划时也要考虑整个试验的敏感性和特异性。尽管没有在贸易中规定具体的试验，非结构蛋白ELISA可以帮助诊断血清型和血清亚型不明的地区的口蹄疫情况。 酶联免疫凝胶电泳法(EITB) EITB法在南美广泛用于上述方法的确诊试验。更多的信息可能从OIE参考实验室、Panaftosa、 PAHO/WHO。 制备重组抗原测试条 i) 口蹄疫病毒的5个生物活性的非结构蛋白3A、3B、2C、3D、3ABC是用大肠杆菌C600热导表达的。3D多肽链是以完整形式表达的，而其它蛋白则是与MS-2聚和酶N-溶合而成。 ii) 聚和酶是用磷酸纤维素纯化后过富集poly(U)凝胶柱制成。溶合蛋白3A、3B、2C、3ABC通过逐渐增加尿素浓度连续抽取纯化。含7M的片段进一步在预先制备的10%SDS-PAGE（十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳）纯化。溶合蛋白带从胶上切下来。 iii) 纯化的重组多肽聚合物各20ng/ml混合物在12.5%SDS-PAGE上分离，电泳转移到硝酸纤维上。 试验步骤 i) 把硝酸纤维条计算在内，一个转移胶、阳性、弱阳性、阀值条、阴性对照等，估算需要的试剂条。一般来讲一个胶上可以得到3mm宽的24个硝酸纤维条。 ii) 每孔加0.8ml饱和缓冲液（50mM Tris/HCl, pH7.5;；150mM NaCl；0.2%吐温20；5%脱脂奶粉；0.05% 大肠杆菌溶解物)。抗原包被的纤维条在振荡器上、室温（20-22C)、30分钟阻断。 iii) 在相应的槽中加1/200试验血清和各种对照血清。纤维条在整个过程中都要保面向上完全浸入液体中。 iv) 室温下振荡器上孵育60分钟。 v) 移去托盘中的液体，用洗涤液（50mM Tris/HCl，pH7.5；150mM NaCl；0.2% Tween 20）洗3次，每次在液体中搅动5分钟。 vi) 在每个试验孔中加碱性磷酸酯酶和兔抗牛血清结合物，纤维条室温下振动孵育60分钟。 vii) 移去托盘中的液体，按上述方法把纤维素条清3次。 viii) 在底物缓冲液中（100mM NaCl；5mM MgCl2；100mM Tris/HCl，pH9.3）制备底物液（0.015% 溴氯吲哚磷酸（bromochloroindolylphosphate）/0.03% 硝基四唑），然后加入每个试验孔。 ix) 把纤维素条入在振动器或者搅动上孵育，直到阀值对照出现5条清晰可见的带。纤维素条用流动的无离子水清洗后风干。 x) 结果表达：EITB用密度显影仪读数，当然用肉眼也可观察尽管有主观性的因素仍比较适宜于结果判定。对照血清对5个抗原着色最少但是稳定。如果试验样品的3ABC、3A、3B、3D（2C）抗原着色浓度与对照相同或者高于对照，那么就判为阳性。如果有2个或者2个以上的抗原着色低于对照，榈结果判定为阴性。着色分不清的判定为可疑。 C. 疫苗匹配试验 1. 介绍 最近有人回顾了制苗毒株的选择历史。一种血