肿瘤免疫治疗临床应用及进展ppt课件.ppt

肿瘤免疫治疗临 床应用 及进展 -肿瘤生物治疗学基 础与临床 1 教学目的与 要求 熟悉肿肿瘤免疫治疗疗的策略和方法 认识认识 免疫治疗疗在肿肿瘤综综合治疗疗中 的地位和作用 了解肿肿瘤免疫治疗疗的最新进进展 2 一、肿瘤的免疫治疗 基本原理： 提高肿瘤抗原免疫原性，激发和增强 机体抗肿瘤免疫应答，提高肿瘤对抗 瘤免疫效应的敏感性，在体内外诱生 肿瘤特异性效应细 胞和分子等。 抗肿瘤免疫治疗包括主动免疫治疗 、被动免疫治疗。 3 1、干扰扰素 1）I型干扰素：由单核巨噬细胞、病毒诱导 的成纤维细 胞、转化的B细胞产 生 种类：IFN-、IFN-、IFN-、IFN-等 作用：抑制肿瘤细胞周期、诱导细 胞凋亡 调节 免疫反应 感染肿瘤血管生成 其它作用：抗病毒 2）II型干扰素：由活化的T细胞、原始的Th0细胞和NK细胞产生 种类：IFN- 作用: 激活巨噬细胞、NK细胞等直接杀伤 癌细胞 延长细胞周期、抑制肿瘤细胞的生长和增殖 促进MHC-I、II类分子和抗原递呈细胞尚共刺激 分子的表达 在干扰素的调节下，IFN-可诱导Th0向Th1分 化，抑制向Th2分化，增强细胞免疫和CTL的杀 伤活性 临床药物：基因工程产品，已国产化。 干扰灵、赛若金 、因特芬、派罗欣。 。 （一）细胞因子治疗 4 适应应症：干扰素主要用于治疗晚期毛细胞白血病、肾 癌、黑色素瘤、kaposi肉瘤、慢性粒细胞性白血病 和中低度恶性非霍奇金淋巴瘤，其他曾用于骨肉瘤 、乳腺癌、多发性骨髓瘤、头颈部癌和膀胱癌等。 对慢性乙、丙型肝炎也有效。 用法：第1周300万单位，皮下注射，每周23次， 第2周每次加到500600万单位，第3周加到900 1000万单位连续6周，共8周为1疗程。 干扰素亦可局部注射（瘤周浸润）、腔内注射（癌 性胸腹腔积液）或膀胱内灌注。 毒副作用：高剂量干扰素具有一般生物制剂的反应即 发热、流感样症状，肌肉酸痛等，其次是轻度骨髓 抑制。一般对肝肾功能无影响，少数有转氨酶、血 肌酐升高。5 2、白细细胞介素-2 （IL-2) 来源：主要由激活的T淋巴细胞分泌和表达，此外NK、转化的B细胞和LAK细胞 也可产生 作用：促进T细胞增殖及相应的细胞因子分泌 刺激NK生长并增强其杀细胞活性 诱导LAK、NK、TIL扩增及细胞因子的分泌 促进B细胞分化、增殖和产生抗体 参与机体的炎症反应、抗肿瘤免疫反应和移植排斥反应 临床药物：基因工程IL-2 欣吉尔、德路生 、远策欣 。 6 适应应症：用于肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、 肝癌、直肠癌、淋巴瘤、肺癌等恶性肿瘤的治疗。用 于癌性胸腹水的控制。用于手术后、放疗及化疗后的 肿瘤治疗，可增强机体免疫功能。也用于自身免疫性 疾病和病毒性、细菌性疾病的治疗，如乙肝、结核病 。 用法：1）胸腹腔注射 100-200万IU/次，每周1-2次 ，2-4周为一疗程。 2）局部注射 根据癌灶大小决定剂量，每次每个病 灶不少于610万IU，隔日1次，4周为一疗程。 3）皮下注射 60-100万IU/m3，每日1次，每周5 次，4周为一疗程。 4）静脉滴注 40-80万IUIU/m3，每日1次，缓慢 滴注，每周5次，4周为一疗程。 7 毒副作用：治疗中常见副反应为发热 、 寒战、乏力、恶心、轻度食欲下降等。 其他少见的副反应包括局部反应、皮疹 、血压下降、水潴留、转氨酶升高等。 这些副反应多为轻 度、易耐受，停药后 可自行缓解。必要时可给与消炎痛或 给予升压等措施对症处理。 8 3、IL-12 主要是由抗原呈递细递细 胞（如单单核巨噬 细细胞、树树突细细胞及B淋巴细细胞产产生） 作用：诱导诱导 Th0分化为为Th1，增强 细细胞免疫应应答 促进进NK、T细细胞增殖，诱导诱导 LAK、TIL产产生， 并增强上述细细胞的杀伤杀伤 功能 诱导诱导 Th1、NK分泌IFN- 促进进巨噬细细胞分泌一氧化氮，杀杀 伤肿伤肿 瘤细细胞 抑制肿肿瘤血管的生成 增强肿肿瘤细细胞表达MHC-I II类类分 子，提高肿肿 瘤细细胞对对免疫效应细应细 胞的易感 性 增加抗原递递呈细细胞对肿对肿 瘤抗原的 递递呈功能 9 动动物试验试验 ： 应用基因工程技术，将IL-12基因导入肿瘤细胞、 树突细胞、成纤维细 胞等，制成肿瘤疫苗，使IL- 12在局部分泌，诱发机体的抗肿瘤免疫。 临临床试验试验 ： 重组人(rHu)IL-12治疗慢性乙型肝炎，效应与剂 量相关，但较大剂量较易有不良反应， IL-12能恢复由实体瘤转移患者PBMC获得的NK细胞 活性， IL12还能增强毛细胞白血病患者NK细胞活性 ， IL-12抗肿瘤作用 10 4、IL-4 主要由活化的T淋巴细胞（特别是Th2细胞）产生。 作用：促进休止期的B细胞活化，促进B细胞分泌 IgE，增加B细胞的抗原递呈功能，促进体液免疫应 答。 维持胸腺细胞和活化T细胞的生长，诱导Th2产 生，抑 制Th1分泌细胞因子。 诱导NK细胞增殖。 激活巨噬细胞，促进其抗原递呈和杀伤肿 瘤细胞 的作用。 诱导外周血单个核细胞分泌M-CSF和G-CSF， 增强中性粒细胞介导的吞噬、杀伤功能和抗体依赖 性细胞介导的细胞毒效应（ADCC） 应应用：主要用于DC细胞的诱导、扩增。 11 5、肿肿瘤坏死因子TNF 1）TNF-：主要来源于LPS、细菌DNA等抗原分 子激活的单核巨噬细胞、其它细胞如T淋巴细胞、 B淋巴细胞等产生的。 作用： 影响免疫反应过程 影响非免疫细胞 促进细胞因子分泌 调控细胞凋亡 全身反应 2）TNF-：主要由Th1、CD8T细胞和早期的B 细胞产生 作用：是炎症过程的重要组成成分 12 6、集落刺激 因子 是一种低分子 量糖蛋白， 能够在体内 外选择性刺 激造血干细 胞增生、分 化成某一谱 系的细胞 分类：G- CSF,M- CSF, GM- CSF, IL-3, EPO, SCF 13 7、胸腺素 分为两族 作用：1）具有免疫增强作用，可促 进T细 胞、NK、LAK等细胞的增殖及 杀伤 活性 2）参与细胞骨架的形成，通过 对 肌动蛋白的调节，参与某些肿瘤 的 转移 14 （二）肿瘤的主动免疫治疗 应用肿瘤抗原或模拟肿 瘤抗原的疫苗 刺激机体免疫系统，激发或增强机体的 抗肿瘤特异性免疫应答，阻止肿瘤生 长、扩散和复发。 15 肿瘤疫苗 肿瘤疫苗与传统 疫苗在概念上不同，它 主要不是用于肿瘤的预防，而是通过瘤 苗的接种来刺激机体对肿 瘤的免疫应答 来治疗肿 瘤。 该法应用的前提是肿瘤抗原能刺激机体 产生免疫反应。 对手术后清除微小转移瘤灶和隐匿瘤、 预防肿瘤转移和复发有较好的效果。 16 1、肿瘤细胞疫苗 即通过过自体肿肿瘤细细胞粗提取物，经经物理化学或生 物手段处处理后抑制其生长长能力，保持其免疫原性 ，需加入佐剂剂如卡介苗等以增强免疫原性。 17 2、肿瘤基因工程疫苗 肿瘤基因工程疫苗通过基因重组技术 ，将目的基因导入受体细胞而制备的 疫苗。 2、肿肿瘤基因工程疫苗 18 1)、提高机体抗肿瘤能力 将外源基因导入免疫细胞，其表达产物作用于免疫 细胞，促进免疫细胞生长、分化，从而提高机体的抗 肿瘤能力。 目前研究较多的是细胞因子基因的转导，如IL-2、IL- 4、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-以及GM- CSF等。 实验显 示，在各种细胞因子中，以GMCSF基因修 饰的肿瘤细胞疫苗效果最好，这与其诱导DC成熟有 关。 19 2)、增强肿瘤免疫原性 通过表达肿瘤所缺乏的某些分子 ，以增强其免疫原性。如将B7基因导 入具有肿瘤抗原的肿瘤细胞，不仅能 恢复肿瘤特异性免疫反应，也可增强 IL-2的抗瘤活性。一些肿瘤相关抗原 （TAA）基因的转导研究，显示也可以 增强其免疫原性，如CEA、AFP、gp100 、MART-1。 20 3)、基因产物直接杀伤 瘤细胞 如TNF基因导入肿瘤细胞可使局部持 续分泌TNF、从而直接杀伤肿 瘤细胞 。 21 3、肽疫苗 8-10个氨基酸的多肽肽是T细细胞识别识别 的 基础础 肽疫苗主要包括以下二种： 1）、癌基因、抑癌基因突变肽疫苗 目前已合成的p21-K-Ras-125突变 肽、EGFRvIII突变肽和 Her2/neu肽等。 2）、病毒相关疫苗 如EB病毒与鼻咽 癌、Burkitt淋巴瘤，HBV与肝癌 ，人类T细胞白血病病毒与成人T细 胞白血病。 22 Oncophage (Vitespen) 通过加工、纯化自体肿瘤细胞的gp96等热休克蛋白HSP，获得大量肿瘤抗原 。 一项III 期临床研究中728 肾癌术后随机分为观 察组和治疗组 结果： 复发率 观察组 治疗组 P值 全部 27.3% 25.0% 0.384 I+ II期 27.0% 15.2% 0.056 III +IV 27.5% 32.0% 0.686 中危患者* 30.9% 16.3% 0.004 中危患者*:I/II期低分化/III期高分化 俄罗斯2008-4-9批准Oncophage 用于中危肾癌的辅助治疗。 Lancet. 2008 (9633):14523 4、核酸疫苗 核酸疫苗是由 能引起保护性 免疫反应的抗 原基因片段及其 载体构建而成 。 包括DNA疫苗 和RNA疫苗。 4、核酸疫苗 24 5、抗独特型抗体疫苗 肿瘤抗原可诱导抗体(Ab1)产生，该抗体可变区的独 特型决定簇具有免疫源性，可诱导抗体Ab2产生，称 为抗独特性抗体。也是一种抗抗体。 在这些Ab2中，有的可模拟原来的抗原结构诱导抗原 的特异性免疫反应，可作为肿瘤疫苗应用。 这这种疫苗的特点是，它既不是天 然抗原的本身，也不是人工合成 的抗原自身，而是抗原本身的“摸 拟拟物”，当用这这种疫苗接种时时， 机体虽虽然没有直接接触抗原，却 能产产生对对相应应抗原的免疫应应答 具有抗原放大效应应 25 已进进入、期临临床的抗独特型抗体： 卵巢癌相关抗原CA125的独特型疫苗 ：AcA125 黑色素瘤的独特性疫苗：BEC2、 TriGem等 淋巴瘤的独特性疫苗：Id-KLH 乳腺癌的独特性疫苗：1E10 结直肠癌的独特性疫苗：105AD7 26 6、树突状细胞（DC）疫 苗 肿瘤抗原属于内源性抗原，机体主要依靠CTL免 疫应答杀伤肿 瘤细胞。但肿瘤细胞表面的MHC- 抗原肽段复合物表达水平低，需要经体内抗原提呈 细胞加工、处理，提供诱导T细胞活化的第二信号 ，才能激发肿瘤特异性CTL的产生。由于DC在 诱导体液免疫应答和细胞免疫应答中的重要功能 ，目前认为，DC在启动抗肿瘤免疫的抗原呈递中 发挥重要作用。 27 Dendritic cells connect innate immunity and adaptive immunity 人DC至少有三条来自于不同前体细胞的发育途径： 1）CD34+细胞分化为DC 2）外周血单核细胞分化为DC 3）淋巴样DC前体细胞分化途径 28 临床应用治疗恶 性淋 巴瘤 肿瘤抗原可以基因、多肽、蛋白、甚 至完整细胞的形式负荷给DC，因此 DC疫苗的制备明显比基因修饰的肿 瘤细胞疫苗容易，因而促进了DC疫 苗进入临床试验。 1996美国斯坦福大学的Hsu等首 先采用抗独特型抗体负荷的DC疫苗 治疗了4例B细胞型淋巴瘤，3例获 部分缓解。 29 抗原冲击DC治疗乳腺癌 （I/II期临床） 病人： 高表达HER2的转转移性乳腺癌病人16例 方法： HER500冲击击的自体APC 2108 to 5109 ， 二周一次，共三次。 副作用：主要为为寒战战和发热发热 ，没有3-4级级的毒副反应应 结结果： 12个可评评价的病人，1例PR 结论结论 ： HER500冲击击的自体DC使用安全，有一定 疗疗效，但效率仍不够够高。 J. W. Kylstra, et al. ASCO 2003 30 治疗转移性肾癌（I/II期临床） 病人：转转移性肾肾癌 15例 方法：肿肿瘤细细胞溶解物冲击击的DC 3.95106 淋巴结结内注射 副作用：无明显显的毒副作用 结结果：7例进进展，7例稳稳定，1例部分退缩缩 (14.4106细细胞 ) 结论结论 ：肿肿瘤细细胞溶解物冲击击的DC，即使在 有大负负荷肿肿瘤时时也有效，在大剂剂量使用时时 更有效，无毒副作用。 Marten A, et al. Cancer Immunol Immunother. 2002 31 PROVENGE (sipuleucel-T) Provenge是PA2024 (GM-CSF和PAP的融合蛋白)与自身树树突状 细细胞孵育后获获得的自体DC细细胞疫苗。 III期研究设计设计 :127例无症状激素治疗疗无效的转转移性前列腺癌患者， 以2:1比例接受sipuleucel-T (2周1次，连续连续 3次) 或安慰剂剂治疗疗，3月后 曲线线分离。 J Clin Oncol.2006:3089 32 DC Vax-Brain 患者DC细胞经自体肿瘤细胞刺激后获得。 胶质瘤手术联合放化疗的MS为14.6个月，TTP为 6.9个月。 N Engl J Med, 2005:987 I期和I/II期研究中发现胶质瘤经DCVax-Brain治疗后 （皮下注射）后，3年存活率为53%，95%的患者 MS超过14.6个月，TTP超过6.9个月。 http:/www.cancernetwork. com/publications/oncolog y/archives 基于上述研究结果，瑞士批准该疫苗上市。 目前II期临床研究正在进行中。 33 由于大多数肿瘤抗原 未被识别 ，因此 肿瘤细胞溶解物负荷的DC疫苗可使 更多的患者接受此种方法治疗。 直接携带肿 瘤抗原的DC作用更为直 接，可以活化静息的T细胞，诱导 强 烈的抗肿瘤免疫反应。 34 （三）肿瘤的被动免疫治疗 1、单单克隆抗体靶向治疗疗 又称之为生物导弹技术，通过补体系统和自然杀伤细 胞起抗肿瘤作用。 嵌合型单抗 达到95以 上人源化,减 少了异种免 疫原性。 35 1） 抗肿瘤单克隆抗体直接体内应用 很多进入临床治疗试验 ，包括抗白细胞 分化抗原CD19、CD20、CD22、 CD33，表皮生长因子受体（EGFR） ，MU C1，前列腺特异性抗原（PSA ），前列腺特异性膜抗原（PSMA），癌 基因cerbB2产物，神经节 苷酯GD3 、GM2等抗原的单抗。 36 2） 抗肿瘤单克隆抗体与抗肿瘤药物、生物毒素、细 胞因子或放射性核素偶联： 生物毒素，如假单胞菌毒素或蓖麻毒素； 放射线同位素，如131I 、186Re、177Lu、 90Y、212Bi、67Cu、等 单抗作为导向物可增加毒素、放射性同位素等在肿 瘤局部 的浓度，增加对肿瘤的杀伤力或诱导肿 瘤 局部的免疫反应。 37 3）基因工程抗体-毒素（或酶）融合蛋 白直接杀瘤 4）抗肿瘤单克隆抗体和抗效应细 胞表 面分子的抗体组成双特异性抗体，可引 导杀 瘤效应细 胞向肿瘤灶集中 5)胞内抗体在肿瘤细胞内表达，特异性 作用于致瘤的癌基因产物或端粒酶 38 2、肿肿瘤过继过继 性免疫治疗疗 向肿瘤患者体内输注具有抗瘤活性 的免疫细胞，直接杀伤肿 瘤细胞或激 发机体抗肿瘤免疫效应。 回输的效应细 胞包括：在体外用肿瘤 抗原或淋巴因子激活的淋巴细胞（CIK 、TIL等）、导入外援细胞因子基因并 表达相应产 物的淋巴细胞等。 39 11)LAK细胞 LAK细胞是在1980年由美国国立癌症研究所 Rosenberg发现，并在1982年由Grimm等命 名的。这是一类由IL-2激活的能够杀伤 NK抵抗的 新型免疫细胞，是一种强烈的，广谱的，具有杀瘤 活性的细胞。随后临床上广泛应用于肿瘤等疾病 治疗。但由于LAK细胞活性的维持需要IL-2，而 IL-2副作用大，而且在以后的临床总结中发现 LAK细胞疗效较低，现已基本不用。 40 2)CD3AK细胞 是在LAK细胞基础上，用抗CD3单抗和IL-2联 合诱导的杀瘤细胞。由于使用了抗CD3单抗刺激 ，减少了IL-2的用量，降低LAK治疗的毒副作用 ，且CD3AK的抗肿瘤活性大大高于LAK细胞。 对晚期恶性肿瘤患者输注自体 CD3AK 细胞 1个 疗程后 ,实体瘤组治疗有效率为 25. 45%,临床获 益率为 74. 54%;淋巴瘤组有效率为 83. 33%,临 床获益率为 91. 67%。 41 在利用外周血淋巴细胞制备免疫效应细胞的研究中 ，为增加效应细胞的数量和杀瘤活性，常添加一些 激活剂如抗CD3单抗，植物血凝素PHA等，以提 高免疫治疗疗效。 实验显 示PHA预刺激虽能促进IL-2激活的杀伤细 胞的增殖，但对杀伤 活性并无明显改善，而培养15 天以上，经PHA预刺激的P-LAK和P-CD3AK细 胞杀伤活性显著提高，且PHA与抗CD3单抗有协 同效应。 42 3)TIL细胞（肿瘤浸润 的淋巴细胞） 肿瘤浸润的淋巴细胞，是从新鲜的 肿瘤组织中分离出来，体外经IL-2， 抗CD3单抗，TNF等刺激，经20-45 天培养，获得的具有一定特异性的抗 肿瘤细胞。其局限在于分离困难，体 外培养时间过长 。 43 我们于1997-1998年选择21例癌性胸腹水患者，其 中肺癌4例，乳腺癌5例，肠癌4例，骨癌7例，胰腺癌 1例。所有病例均经病理学和细胞学诊断。共抽取33 次胸腹水做TIL细胞培养，抽取胸水2502200ml， 腹水量12004400ml。21例患者中14例经16次 的TIL胸腹腔回输治疗。回输期间隔天皮下注射IL-2 50万单位。14例患者回输治疗结果显示总有效率为 78.57%，其中3例胸腹水消失，并观察1个月无复发 ，1个月后检查胸腹水无瘤细胞；8例胸腹水有明显减 少，并控制1个月以上；3例仅控制12周。 44 4)TAK细胞 TAK是由可溶性肿瘤抗原，抗CD3 单抗和IL-2共同诱导的杀瘤细胞。用可 溶性肿瘤抗原诱导细 胞识别肿 瘤，以提 高杀瘤亲和性；用抗CD3单抗诱导所 有T细胞活化，培养出以CD8+T细胞 为主的杀瘤细胞。TAK细胞不仅增加 了杀瘤的特异性，且体外增殖快，IL-2 用量低。 用胃癌可溶性抗原（TSA），联合抗 CD3单抗和IL-2共同刺激正常人的外周 血单核细胞，培养10天后，经流式细 胞仪表型分析，表明其免疫效应细胞以 CD8+T细胞为主，其细胞增殖速度， 增殖水平与CD3AK和LAK相比明显升 高，且对抗原来源的胃癌细胞具有极强 的杀伤活性（98.5%），高于CD3AK （82.1%）和LAK（62.05%）。 45 我们于1996-1998年，采用静脉或口服化疗 和免疫效应细胞输注为主体的化学免疫疗法， 治疗晚期原发性肝癌18例。 收治的38例晚期原发性肝癌病人中，18例采 用化学免疫疗法（甲组），同期收治的晚期肝癌 患者，除对症处理外，单用静脉化疗或肝动脉 插管化疗20例，列为对照组（乙组）。 总缓总缓 解率（CR+PR）： 甲组22.22%（4/18） 乙组0% 无1例缓解 46 5)CIK细胞 是将人外周血单个核细胞经体外用各种细胞因子共 同刺激培养所获得的免疫细胞。由于同时表达 CD3和CD56分子，故又称为NK样T细胞，CIK 细胞兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞 的非MHC限制性杀瘤特点，其抗肿瘤活性远大于 LAK和TIL。因此被认为是新一代肿瘤过继细 胞 免疫治疗的首选方案。 刺激因子除了抗CD3单抗、IL-2外，还需用IFN- 和IL-1等细胞因子。 47 CIK细胞杀伤 机制 、识别识别 由于CIK的细胞杀伤 作用是非MHC限制 性的，故CD4、 CD8在其识别肿 瘤 细胞或病毒感染的细 胞过程中并非必不可 少。细胞表面粘附分 子LFA-1 ICAM-1在 CIK细胞识别过 程中 起关键作用。对正常 细胞无毒性作用。 48 、杀伤杀伤 细胞对肿瘤细胞或感染细胞的直接杀伤： CIK细胞 在受到外源性抗原或敏感靶细胞刺激时会释放具有 细胞毒性的胞浆颗粒物到膜外空间，其中细胞可产 生最大的颗粒释放量。这些胞浆颗粒物对靶细胞具 有直接杀伤作用。 炎性细胞因子的杀伤活性：培养的细胞可以分泌多种 细胞因子，如、（肿瘤坏死因子）、等，不 仅对靶细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免 疫系统反应性间接杀伤靶细胞。 诱导肿瘤细胞凋亡：细胞在培养过程中表达（型 跨膜糖蛋白），一方面增强了其对肿瘤细胞引发的 凋亡的抵抗性，还可通过对（型跨膜糖蛋白）肿 瘤细胞诱导凋亡行使其对肿瘤细胞的慢性杀伤作用 ，保证抗瘤活性的长期持久。 49 CIK细胞的杀瘤特点 1、增殖速度快 CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%5% ，在体外经多因子培养2830天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可 达1000倍以上。且所占百分比也大幅上升，细胞毒活性亦达峰值。 2、杀伤活性高、杀瘤谱广 CIK细胞的总杀伤单位（TLU）为LAK 细胞的73倍甚至更高，CIK细胞的瘤细胞 抑制Log指数为2.53.5，较LAK细胞的瘤细胞抑制指数高2 个Log。其抗病毒 活性大大增强。 因没有T 淋巴细胞杀伤时的MHC 限制性，故对于多种肿瘤细 胞系和新鲜肿瘤组织均表现出强大的杀伤活性。 3、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感 CIK细胞对化疗药物敏感的亲本细胞和不敏感的转化细胞均具有强大的杀伤活 性，两者比较无差别。 4、杀瘤活性不受CsA、FK506等免疫抑制剂的影响 免疫抑制剂CsA（环孢霉素A）和FK506（普乐可复）不影响靶细胞诱导的CIK 细胞脱颗粒，并且CIK细胞对靶细胞的杀伤活性不会因此降低。 5、对正常骨髓造血前体细胞毒性很小 CIK细胞对正常髓系克隆生成几乎没有影响，对GM-CFU（粒细胞巨噬细胞集落 形成单位）仅有不足1级的抑制。 6、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡 CIK细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如Bcl-2等和survivin 的转录水平上调。CIK细胞具备合成FasL的能力， CIK细胞可以对抗体内FasL 阳性肿瘤所引发的效应细胞活性下降。 50 CIK制备 采集：外周血单个核细胞。 分离：PBMNC经淋巴细胞分离液分离、洗 涤后悬浮于含10%AB血清的RPMI 1640 中。 培养：第一天培养加入-IFN 1000U/ml ，24小时后加入IL-2 1000U/ml，在 37，5% CO2孵箱中培养。以后每3天 更换培养液补加IL-2 1000U/ml；培养 710天。 无菌检测：细菌霉菌培养阴性；热源检 测阴性。 收获：收集细胞，加入含1%白蛋白的生 理盐水洗涤。 回输：洗涤后的细胞悬浮于1%白蛋白生 理盐水中，将CIK细胞通过输血器经静 脉输给患者。 疗程：培养的第8-10天开始，分八袋 回输，每次间隔1-2天。自回输CIK细 胞前一天起, 可每日静脉输注IL-2， 每日剂量为100万单位直到回输结束。 51 52 53 54 临床应用 体内回输CIK细胞, 可以在没有损伤 机体免疫系统结构和功能的前提下,直 接杀伤肿 瘤细胞, 并可调节和增强机 体的免疫功能。 特别适应于那些对手术、放疗、化疗 已无适应证的晚期肿瘤患者,因而成为 治疗肿瘤的重要辅助治疗方法,为预 防肿瘤复发、改善生存质量提供了新 途径。 一般在放疗、化疗后间隔24周,机 体免疫力有所恢复时,输入CIK细胞,可 提高肿瘤患者的缓解率并在清除微小 残留病灶方面发挥重要作用。 55 6)DC-CIK 将外周血来源的CIK 细胞和同源DC 细胞共培养一段时间 后发现 ,DC 和CIK 细胞的增殖能力明显增强,共培养14 d 后CIK细胞的增 殖倍数比共培养7d 时高出2 倍左右。共培养24 h 后,DC 细胞白 细胞介素12 的分泌量为单 独培养时的6.93 倍,与DC 细胞共培 养的CIK 细胞对肿 瘤细胞的杀伤 活性显著提高。 56 DC-CIK制备流程 57 58 7) NK细胞 自然杀伤细 胞(natural killer cell,NK )细胞不经致敏可直接杀 伤敏感的肿瘤细胞,是宿主抗肿瘤的 第一道防线。 自然杀伤细胞(黄色)在它们严重 破坏机体之前识别并杀死癌细胞 (粉红色)或病毒感染的细胞 NK细胞受体和配体 59 60 中国肿瘤临床 2013,40卷 90例食管癌中晚期患者（TNM III-IV期）接 受枯息性手术后，分为单纯化疗组40例、化 疗联合NK细胞治疗MCIA阴性组（简称联合 MICA-组）25例及化疗联合NK细胞治疗MCIA 阳性组（简称联合MICA+组）25例。 中国肿瘤生物治疗杂志 2013,20卷 61 体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本方案 恶恶性肿肿瘤 手术术治 疗疗 可手术术 放化疗疗敏感（常规规放化疗疗 ） 放化疗间疗间 隙联联合细细胞免疫治 疗疗 （卵巢癌、乳腺癌、小细细胞肺 癌和鼻咽癌等） 放化疗疗不敏感 （肾肾癌、前列腺癌、黑色素瘤 和肝癌等） 放化疗疗敏感（常规规放化疗疗 ） 放化疗间疗间 隙联联合细细胞免疫治 疗疗 （卵巢癌、乳腺癌、小细细胞肺 癌和鼻咽癌等） 细胞免疫治疗 疾病 稳定期 细胞免疫治疗 联合内分泌或 靶向治疗，细 胞因子治疗 专专科治疗疗 （微创创介入） 不能手术术（期，期 ）复发发者 细胞免疫治疗 疾病 稳定期 化疗疗不敏感 （原发发性肝癌、肾肾癌、前列腺 癌和黑色素瘤等） 细胞免疫治疗 联合专科治疗 62 CIK输注不良反应 免疫活性细胞回输后患者可出现一过性 类流感样症状，如发热 （体温37.5 39.5），轻度头痛、乏力、关节 酸痛，持续时间 均不超过12 h， 可 自行缓解，所有患者均能很好耐受治 疗。 63 64 3、过继过继 性免疫效应细应细 胞治疗疗的优优点 (1)免疫细细胞在体外处处理，可绕过绕过 体内 肿肿瘤免疫障碍的种种机制，从而选择选择 性地操作抗肿肿瘤免疫反应应: 如新鲜鲜分离的肿肿瘤浸润润性淋巴细细胞 （tumor infiltrating lymphocyte，TIL）往往缺乏抗肿肿 瘤效应应，而在体外一定条件下培养一 段时间时间 后可恢复特异性抗肿肿瘤作用； 在体外培养条件下，肿肿瘤抗原特异性 耐受的免疫细细胞可被逆转转。 65 (2)免疫细细胞的活化及效应过应过 程往往由一 些细细胞因子介导导，而目前基因工程可大 量克隆不同的细细胞因子，也可大量克隆 肿肿瘤抗原或多肽肽，这这使体外活化扩扩增 大量的抗肿肿瘤免疫细细胞更为为可行方便。 66 (3)免疫细细胞的体外活化扩扩增可避免一 些制剂剂 体内大量应应用带带来的严严重毒副作 用， 如: IL2、TNF、IL4、IL7、 IL12等具有抗肿肿瘤作用，抗CD3 单单克隆抗体(MabCD3)的体内应应用 可激活T淋巴细细胞，但这这些制剂剂由于 其复杂杂的多种作用，在体内大量应应用 可导导致严严重的甚至致死性副作用，这这 也是这这些因子难难以被批准临临床使用的 重要原因，而在体外操作可避免这这些 副作用。 67 (4)目前已能在体外大量扩扩增自体或异基因的抗肿肿 瘤免疫细细胞，其数量大于肿肿瘤疫苗在体内激活的效 应细应细 胞数，一些体外培养的免疫细细胞已进进入临临床治 疗试验疗试验 。 实验显实验显 示肿肿瘤疫苗在体内应应用可增加体内的肿肿瘤 特异性CTL数量，但到一定时时候，体内的CTL到 达平台期而不再增加，这这主要由体内存在的特异性 及非特异性免疫调节调节 网络络限制了CTL克隆的扩扩增 。而在体外培养可突破此调节调节 网络络，大量扩扩增免 疫效应细应细 胞。 68 理想的过继过继 性免疫细细胞治疗应疗应 具有以 下特点: (1)可大量获获得，实验实验 室研究及临临床 实实践显显示，临临床治疗疗量的免疫细细胞 应应在11010以上 (2)为肿为肿 瘤特异性 (3)抗肿肿瘤活性强 (4)体内应应用可耐受 (5)可聚集在肿肿瘤灶 (6)可在体内存活 、增殖 69 二、免疫治疗的作用 肿肿瘤免疫治疗疗即能够够直接清除体内的残存肿肿瘤细细 胞，又能够够提高机体的整体免疫功能，还还具有将患 者个体化的肿肿瘤抗原信息递递呈给给体内肿肿瘤免疫杀杀 伤细伤细 胞的独特作用。 肿肿瘤免疫治疗疗已成为临为临 床上继继手术术、化疗疗、放疗疗 之后的第四种最有效的肿肿瘤治疗疗方法。在肿肿瘤综综 合治疗疗方案中，免疫治疗疗成为为提高肿肿瘤治愈率和 有效率的一个关键键措施。 70 三、免疫治疗的临床地 位 免疫治疗疗是最有前途的抗肿肿瘤手段之一 目前尚未起主导导作用 定位于手术术、放化疗疗后清除残留病灶 目标标是预预防复发发 关键键是抗原在体内有效地被递递呈并激 活T淋巴细细胞 71 四、免疫治疗的原则 虽虽然目前免疫治疗疗的方法还还不是很有效的，只能 配合其他疗疗法作为为一种 辅辅助手段。但从肿肿瘤免疫 的理论论看，它涉及的是肿肿瘤发发生发发展的内部因素 和内部矛盾性。随着它的迅速发发展，为肿为肿 瘤的免疫 治疗疗提出了广泛的可能。 从宿主与肿肿瘤相互斗争这这一矛盾出发发，从增强宿主 对肿对肿 瘤的免疫能力，以及消除肿肿瘤对对免疫功能的 抑制两个方面入手，并继续继续 在增强机体非特异性免 疫能力方面进进行研究，肿肿瘤的免疫治疗疗是大有希望 的。 72 1、增强宿主对肿对肿 瘤的免疫能力： 1）提纯纯改造抗原，提高抗原的免疫作用 2）发挥细发挥细 胞免疫的作用进进行过继过继 免疫治疗疗 3）利用细细胞因子激活抗肿肿瘤免疫 4）抗体导导向治疗疗 2、消除肿肿瘤对对免疫的对对抗 如何清除免疫抑制因子的作用，是肿肿瘤免疫治疗疗 很有希望的一个方面。 73 五、免疫治疗的评价 1、临临床评评价： 病灶变变化-临临床查查体和影像学检查检查 （CT、 MRI、B超、等） 内镜检查镜检查 肿肿瘤标标志物 肝功、肾肾功、血象等的改善 其他 74 肿瘤标志物 （tumor markers,TM) 1978年NCI提出 1979年确认认并开始使用 TM是表示肿肿瘤存在并反映其一定的 生物特性的生化物质质 TM主要是指那些在血液、体液及组组 织织中可检测检测 到的与肿肿瘤相关的物质质， 这这些物质质达到一定的水平时时能揭示某 些肿肿瘤的存在。 TM的临临床意义义： （1）诊诊断 （2）复发发（3）判断 疗疗效（4）预预后 75 常用肿瘤标志物 甲胎蛋白（AFP） 癌胚抗原（CEA） 糖类类抗原（CA50、CA125、CA15-3、CA199、CA242 、CA72-4） 2-微球蛋白（ 2-MG） 铁铁蛋白（Ft） 细细胞角质质素片段抗原21-1（CYFRA21-1） 神经经元特异性烯烯醇化酶（NSE） 鳞鳞状上皮癌相关抗原（SCC-Ag） 前列腺特异抗原（PSA） 前列腺酸性磷酸酶（PAP） 核基质质 76 2、免疫监测监测 -观观察CTL的反应应、认认定CTL反应应的细细胞类类 型、等，从而评评价机体对对免疫治疗疗的反应应 1）迟发迟发 超敏试验试验 （DTH） -体内抗原特异性免疫监测监测 技术术 2）机体免疫功能检测检测 体液免疫指标标：定量分析抗原特异性抗体的数量 和功能检验检验 科 细细胞免疫功能：FCM技术检测术检测 淋巴细细胞表面标标 志 CD3、CD4、CD8、CD19、CD28、 CD16/CD56、CD25、HLA-DR、等等。 实验实验 室 Th1、Th2类类因子检测检测 ：应应用FCM-CBA技术术 ，采用磁珠微阵阵列技术术，同时测时测 定血清中46种 免疫相关因子的水平实验实验 室 77 78 3）T细细胞增殖反应应 -3H测测定法 4）T细细胞毒性检测检测 ： 51Cr释释放试验试验 LDH MTT （WST-1） 5）T细细胞限制性稀释释分析法（LDA） -分析未知频频率的淋巴细细胞克隆、定量检测检测 外周血 中最初抗原T特异性淋巴细细胞的数目或频频率。 操作复杂杂，被ELISPOT等新技术术所取代 79 6）细细胞因子检测检测 -测测定T淋巴细细胞分泌的因子 ELISA（酶联联免疫技术术）-检测检测 T淋巴 细细胞分泌于细细胞外的因子 ELISPOT（酶联联免疫斑点技术术）-检检 测测T淋巴细细胞分泌于细细胞外的因子 FCM（流式细细胞术术）-检测检测 T淋巴细细 胞胞内细细胞因子 80 7）其他 P-MHC tetramer技术术-检测细检测细 胞表面受体（ TCR）与MHC分子递递呈的多肽肽的相互作用 定量PCR技术术-检测细检测细 胞因子基因、T细细胞受体复合 物基因等表达水平，反应应T淋巴细细胞功能状态态 81 六、肿瘤免疫治疗的新进 展 1、免疫卡控点抑制剂 Checkpoimt inhibitor CTLA4、 PD-1、 PD-L1 2、TCR-T和CAR-T 82 T T B7B7 CD28CD28 MHC-IMHC-I AgAg TCRTCR TCRTCR AgAg MHC-IMHC-I IL-2IL-2 APCAPC TumorTumor T T T T T T T T T T 耐受耐受 激活激活 CD28CD28 协同刺激分子作用示意图 T 83 1、T细胞免疫卡控点治疗 84 有两种受体存在于T细胞表面 B7 CD28 低亲和力受体 CTLA-4 高亲和力受体 B7 B7 传递阳性或阴性信号决定于传递阳性或阴性信号决定于T T细胞上的配基细胞上的配基 B7-CD28结合:产生阳性信号，增强免疫反应。封闭 CD28依赖的T细胞激活，下调免疫反应。 B7-CTLA-4结合:产生阴性信号，下调免疫反应。封闭 CTLA-4促进抗肿瘤反应。 85 The Biology of Cancer86 抗CTLA-4抗体治疗黑色素瘤肺转移患者 87 Ipilimumab治疗疗复治转转移性黑色素瘤 (fully human, IgG1 monoclonal antibody, anti-CTLA-4) Ipi+gp100Ipi alone gp100 alone mOS10.0m10.1m6.4m 2y- SR 22%24%14% 结结果提示：Ipilimumab能 够够延长转长转 移性黑色素瘤患 者的总总生存，故2011年通 过过FDA批准用于治疗转疗转 移 性黑色素瘤。 入组标组标 准： 二线线治疗疗（化疗疗或细细胞因子治疗疗 失败败）； HLA-A* 0201 排除标标准： 既往CTLA-4抗体或疫苗治疗疗； 免疫抑制剂剂或自身免疫疾病； 脑转脑转 移、脉络络膜黑色素瘤 88 Early Response to Therapy Cancer Investigation, 30:712720, 2012 89 Gradual/Delayed Response Cancer Investigation, 30:712720, 2012 90 2011年，Nature杂杂志指出：“肿肿瘤免疫治疗疗的时时代已经经来临临”。 91 抗PD-1抗体治疗黑色素瘤肺、肝转移患者 T h e new engl and journa l o f medicine CD8+ RECIST，为38%（44 / 117例） 92 Checkpoint Inhibitor: Nivolumab (BMS-936558) (fully human, IgG4 monoclonal antibody, anti-PD-1) melanomaNSCLCRCC RR28% (26/94)18% (14/76)27% (9/33) Durable OR was observed in patients with melanoma, NSCLC and RCC. l该研究中NSCLC患者的给药浓 度分别为 1mg / kg、3mg / kg 和 10mg / kg ；76例可评价疗效NSCLC患者的ORR达18%；鳞癌与 非鳞癌患者的ORR分别为 33 % (6/18 ) 和12 %(7/58)。 93 2、TCR-T和CAR-T 94 基本概念 1、T细细胞（抗原）受体（T cell receptor ,TCR） TCR为为所有T细细胞表面的特征性标标志，以非共价键键与CD3结结合，形成TCR CD3复合物。TCR的作用是识别识别 抗原。 2、TCR-T TCR基因转转染的T细细胞免疫治疗疗 3、嵌合抗原受体(CAR) 是通过过基因改造的T细细胞抗原受体，赋赋予T细细胞HLA非依赖赖的方式识别肿识别肿 瘤 抗原的能力，CAR的基础设计础设计 中包括一个肿肿瘤相关抗原（tumor- associated antigen， TAA）结结合区（通常来源于单单克隆抗体抗原结结 合区域的scFV段），一个胞外铰链铰链 区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目 标标抗原的选择对选择对 于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细细胞自身的安全性 来讲讲都是关键键的决定因素。 4、CAR-T 全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌 合抗原受体T细细胞免疫疗疗法。经过经过 CAR改造的T细细胞相较较于天然T细细胞表面 受体TCR能够识别够识别 更广泛的目标标。 95 TCR 转转染 CTL 细细胞治疗疗 转导识别转导识别 特异性肿肿瘤抗原的TCR基因至T细细胞，强制性其表达独特性TCR，经经大量扩扩增，成为为 具备备特异性杀伤杀伤 活性的CTL，识别识别 并杀伤杀伤 携带带相应肿应肿 瘤抗原的肿肿瘤细细胞。 In a HLA-dependent way 96 嵌合体抗原受体（CAR） 改造的 CTL 细细胞治疗疗 嵌合抗原受体(CAR)是将识别肿识别肿 瘤相关抗原 (TAA)的单链单链 抗体和T细细胞的活化序列结结合 为为一体，通过过基因转导转导 方法转转染T淋巴细细胞 ，使其能特异性地识别识别 和杀伤肿杀伤肿 瘤细细胞。 non HLA- dependent way 97 TCR TCR 与与 CARCAR的的结结结结构比构比较较较较 4-1BB，OX-40 受MHC限制性 不受MHC限制 98 TCR-T/CAR-T相关临临床试验举试验举 例 99 aCD19 aCD3 + PBMC Day 0 Transduction Day 2 CAR-T infusion Day 10 Fig 2. Complete remissions (CRs) of chemotherapyrefractory large-cell lymphomas in patients receiving anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells. (A) Positron emission tomography (PET)/computed tomography (CT) scans show CR of chemotherapyrefractory primary medi